用于研究中枢神经元轴突曲张体形成与恢复的微生物力学系统

摘要

本方案描述了一种生理相关、加压液体方法，用于在神经元中快速且可逆地诱导曲张体形成。

摘要

轴突曲张体是沿轴突主干分布的膨大结构，具有高度异质性。它们不仅存在于患有神经退行性疾病或脑损伤的脑组织中，也存在于正常脑组织内。本文介绍一种新建立的微机械系统，可快速、可靠且可逆地诱导轴突曲张体的形成，从而帮助我们理解调控曲张体生成及其蛋白质异质性组成的机制。该系统提供了一种新颖手段，用于评估压缩力和剪切应力对神经元不同亚细胞区室的影响，不同于其他主要关注拉伸效应的体外（in vitro）模型。尤为重要的是，得益于本系统的独特特性，我们近期取得了一项新发现：施加压力流体可通过激活瞬时受体电位通道，快速且可逆地诱导轴突曲张体的形成。我们的生物力学系统可方便地与药物灌注、活细胞成像、钙成像以及膜片钳记录技术联合使用。因此，该方法可用于研究机械敏感性离子通道、轴突运输调控、轴突细胞骨架动态、钙信号传导以及与创伤性脑损伤相关的形态学变化。

引言

轴突沿线出现的串珠样变性或肿胀/成结，是中枢神经系统多种疾病和损伤中观察到的神经退行性变的显著特征，包括多发性硬化症、阿尔茨海默病、帕金森病和创伤性脑损伤。^1,2尽管轴突串珠样膨大对动作电位传导和突触传递具有显著的生理影响³，但其产生机制仍不清楚。最近，利用新建立的微生物力学检测方法对啮齿类动物培养的海马神经元进行研究，我们发现机械刺激可诱导这些神经元产生具有高度引人注目特征的串珠样膨大。首先，串珠样膨大的诱导过程迅速（<10秒），且该过程出乎意料地可逆。其次，串珠状突起的形成依赖于吹流压力的强度：压力越高，串珠状突起的形成速度越快。第三，串珠状突起的形成与神经元的年龄有关。相较于较老的神经元，年轻神经元的轴突对机械应力表现出更高的敏感性。第四，串珠状突起出现在海马神经元的轴突上，而在相同的吹流条件下，这些神经元的树突和轴突起始段则未发生明显变化。因此，本研究揭示了神经元极性的一种新特征。这些发现结合 体外 系统具有生理相关性。使用一种 体内 轻度创伤性脑损伤（mTBI）模型显示，小鼠在颅骨闭合状态下受到冲击后，体感皮层中的轴突发生多灶性串珠样膨大，与我们的结果一致 体外 结果⁴需要注意的是，我们对轻度创伤性脑损伤小鼠的染色和成像仅能提供神经元形态变化的瞬时快....

方案

以下所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 盖玻片准备

1. 将一盒或多盒12 mm或25 mm盖玻片放入盛有70%硝酸的玻璃烧杯中，在室温下孵育过夜。
   注意：不要将25 mm盖玻片与12 mm盖玻片在同一烧杯中清洗，建议分别清洗。
2. 将所有盖玻片转移至一个盛有 2.5 L 去离子水的 4 L 烧杯中₂O，并在100 rpm条件下振荡含有盖玻片的烧杯1小时。振荡时使用橡皮筋固定烧杯。用新鲜的2.5 L ddH₂O重复冲洗₂O 四次。
3. 将清洗后的盖玻片转移至带金属盖的干燥烧瓶中，在225 °C烘箱中烘烤6 h，随后冷却至室温。
   注意：25 mm 盖玻片易碎。需逐片分离后空气干燥，再放入烘箱中烘烤。
4. 将干燥且清洁的盖玻片存放于灭菌的塑料容器中，室温保存，直至使用。
5. 按照以下步骤包被盖玻片：
   1. 在离心管中配制新鲜的包被溶液。
   2. 将每张盖玻片放入24孔（或6孔）板的一个孔中。加入30（或100）µL盖玻片包被溶液（表1将溶液滴加到12 mm（或25 mm）盖玻片上并轻轻混匀。向孔中加入1 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS，组织培养级）。这些培养板可立即使用，或在无菌P....

结果

在施加喷射压力之前，轴突通常很少出现串珠样膨大。在使用标准压力（190 mmH₂O 高度）进行喷射后，轴突开始形成大量珠状的串珠样膨大。串珠样膨大的形成具有部分可逆性，如轴突某些区域在恢复10分钟后可回到喷射前的状态（图2A-B）。经过更长时间的恢复（>20 分钟），部分轴突可完全恢复。若喷射移液管位置欠佳，或注射器未能准确置于载物台上方190 mm处，则可能无法快速诱导串珠样膨大的形成。在最佳条件下，年轻神经元（约7天体外培养，7 DIV）的轴突应在约5秒内出现串珠样膨大⁴。

讨论

该微生物力学检测实验的操作流程简单直接。只要严格按照各个步骤进行，即可获得可靠的结果。其中若干关键步骤若操作不当，将会影响数据的顺利采集。关键步骤始于施加喷射刺激之前。仔细地解剖、培养以及妥善维护原代神经元培养物至关重要。如果培养的神经元状态不健康，则其反应将不一致，因为这些神经元可能已处于应激预激活状态。在培养之后，需耐心完成喷射装置的初始设置与校准，以提供稳定的压力——该压力应足以诱导神经末梢膨大（varicosities），但又不会导致细胞从盖玻片表面脱落。由于移液管堵塞、管路或阀门问题，准确校准整个系统可能需要约1小时。在将细胞放入培养皿并定位移液管尖端之前，必须确保液体能够以最小阻力从移液管中顺畅流出。关于装置的改进，可将喷射装置与灌流系统、膜片钳以及其他基于显微镜的仪器联用，主要取决于显微镜两侧可用的物理空间。

该系统存在两个需要关注的内在局限性。通过向细胞吹入液体，该装置能够持续诱导培养的海马神经元轴突中可逆性串珠样肿胀的形成。然而，需要注意的是，在同一吹液区域内，不同神经元所受到的确切压力值并不完全相同。作用于细胞的流体压力是基于微加工硅胶膜的压力负荷测量计算得出的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	Warner Instruments	64-0702	用于 24 孔板
25 mm 盖玻片	Fisher Scientific	12-545-102	用于 6 孔板
乙酸	Fisher Scientific	A38-212
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
大鼠尾胶原蛋白	Roche	11 179 179 001
10X PBS	National Diagnostics	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientific	S373-500
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500
HEPES	Fisher Scientific	BP410-500
D-葡萄糖	Fisher Scientific	D16-500
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
蛋白酶	Sigma	P4032
FBS	Gibco	26140
丙酮酸钠	Gibco	11360-070
L-谷氨酰胺	Gibco	25030081
青霉素/链霉素 100 倍溶液 (P/S)	Gibco	15140122
MEM Earle's 盐溶液	Gibco	11090
B27 添加剂	Gibco	17504-044
Neurobasal 培养基	Gibco	21103-049
阿糖胞苷 (Ara-C)	Sigma	147-94-4
Opti-MEM 培养基	Gibco	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1854313	转染试剂
硼硅酸盐玻璃棒	World Precision Instruments Inc.	PG52151-4	用于吹液移液管
橡胶管	Fisher Scientific	14-169-1A
10 cc 塑料注射器及推杆	Becton Dickinson
显微操作器	Sutter Instruments
NaCl	Fisher Scientific	S640-3
KCl	Fisher Scientific	BP366-500
CaCl2	Fisher Scientific	C70-500
细胞培养皿 (35 mm × 10 mm)	Corning	3294
Fluo-4 AM	Molecular Probes	F14201	用于钙成像
Mito-YFP 质粒	Takara Bio Inc.		用于细胞转染
YFP-N1 质粒	Takara Bio Inc.		用于细胞转染
Model P-1000 Flaming/Brown 微量移液管拉制仪	Sutter Instruments
Eclipse TE2000-U 显微镜	Nikon
Plan Fluor ELWD 20x 物镜	Nikon	062933	物镜
Apo TIRF 100x/1.49 油镜	Nikon	MRD01991	物镜