中枢神经元轴突静脉曲张形成和恢复的 Microbiomechanical 系统研究

摘要

本协议描述了一种生理上相关的加压液方法, 用于快速可逆地诱导神经元中的静脉曲张。

摘要

轴突静脉曲张是在高异质性的轴轴上扩大结构。它们不仅存在于神经退行性疾病或损伤的大脑中, 还存在于正常大脑中。在这里, 我们描述了一个新建立的微机械系统快速, 可靠, 可逆诱发轴突静脉曲张, 使我们能够理解的机制, 控制静脉曲张形成和异构蛋白组成。该系统代表了一种新的方法来评估压缩和剪切应力对不同的神经元亚细胞间隔的影响, 不同于其他体外系统, 主要集中于伸展作用。重要的是, 由于系统的独特性, 我们最近提出了一种新的发现, 即加压液的应用可以通过瞬态受体电位通道的活化, 快速、可逆地诱发轴突静脉曲张。我们的生物力学系统可以方便地与药物灌注、活细胞成像、钙成像和膜片钳记录结合使用。因此, 该方法可用于研究 mechanosensitive 离子通道、轴突转运调节、轴突细胞骨架动力学、钙信号传递以及与颅脑损伤相关的形态学变化。

引言

静脉曲张形成, 或肿胀/珠, 沿轴突, 是一个突出的特点变性观察到许多疾病或损伤的中枢神经系统, 包括多发性硬化症, 阿尔茨海默病, 帕金森病, 和创伤脑损伤^1,2。尽管轴突静脉曲张对动作电位传播和突触传输有显著的生理影响³, 但如何生成静脉曲张仍然不得而知。最近, 利用新建立的 microbiomechanical 对啮齿动物培养的海马神经元进行了检测, 发现机械刺激能诱发这些神经元中的静脉曲张, 具有极具吸引力的特征。第一, 静脉曲张诱导迅速 (< 十年代), 这个过程是出乎意料的可逆的。其次, 静脉曲张的萌生取决于膨化压力的强度: 压力越大, 启动速度越快。第三, 静脉曲张的萌生取决于神经元的年龄。与较旧的神经元相比, 年轻神经元的轴突对机械应力的反应更大。第四, 静脉曲张沿海马神经元的轴突形成, 而这些神经元的树突和初始轴突段在同一膨化条件下无变化。因此, 我们的研究揭示了一种新的神经极性特征。这些发现与体外系统在生理上是相关的。使用体内模型进行轻度创伤性脑损伤 (mTBI), 我们表明, 轴突静脉曲张在小鼠体感皮层的多焦点模式下, 在闭合颅骨撞击后立即形成, 与我们的体内一致。结果⁴。值得注意的是, 我们的 mTBI 小鼠的染色和成像只提供了神经元形态学变化的快照, 因为执行体内的神经元形态学在机械撞击过程中的时间推移成像仍然是不可行的。

这种液体膨化系统不仅使我们能够捕捉到与机械应力引起的静脉曲张形成相关的独特特征, 而且还可以确定其内在机制。通过对不同细胞外溶液、mechanosensitive 离子通道不同候选者的阻滞剂和开启器的测试, 以及细胞电生理学, 我们确定了瞬态受体电位阳离子通道亚科 V 成员 4 (TRPV4)可渗透到 Ca^{2 +}和 Na⁺并由膨化激活的通道主要负责检测轴突静脉曲张形成的初始机械应力⁴。这进一步证实了以 siRNA 淘汰赛方法。结合这一新的实验系统, 我们开发了海马神经元培养, 对于研究中枢神经元的微机械特性, 特别是与其他技术相结合, 具有重要的价值。

我们建立的这一微机械系统是独一无二的, 不同于以前存在的系统在几个主要方面。首先, 在这个系统中, 神经元在压缩和剪切的形式中经历了平面外的机械应力。在机械撞击过程中, 神经元的过程仍然附着在盖玻片表面, 不移动。这与其他主要涉及弯曲和平面拉伸 (或张力) 的实验系统不同, 例如, 捆绑轴突的偏转, 如移动字符串^5,6或在 micropatterned 上生长的拉伸轴突。通道和伸缩膜^7,8。此外, 虽然轴突静脉曲张也可以在这些化验中诱发像我们的液体膨化系统, 这些设置的过程需要更多的时间 (从10分钟到几个小时^6,7,8), 并出现不可逆转。最后, 我们的系统使用局部液体膨化允许检查静脉曲张形成的空间特征 (e. g., 树突, 树枝状刺, 躯体, 轴突的初始段, 轴突终端), 除了它的世俗特征。利用该系统, 我们发现了轴突静脉曲张形成的几种意想不到的独特特征, 特别是快速发作、慢可逆性和轴突-枝晶极性。

本文所讨论的系统与多种分子和细胞生物学技术相适应。例如, 研究机械应激对神经元形态和功能的影响, 可与髓鞘共培养、荧光共振能量转移 (焦虑) 的时移成像和全内反射荧光 (TIRF) 一起使用,钙成像和膜片钳记录。本文重点讨论了系统的核心组件。海马神经元培养, 液体膨化设置, 高分辨率的轴突传输的时间推移成像, 和钙成像, 说明了逐步下一步。

方案

下面描述的所有方法都已由俄亥俄州立大学的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。

1. 盖玻片准备

1. 将一个或多个12毫米或25毫米的盖玻片盒放入含有70% 硝酸的玻璃烧杯中, 并在室温下一夜之间孵化盖玻片。
   注意: 不要在同一个烧杯中洗25毫米的盖玻片12毫米盖玻片。最好分开洗。
2. 将所有盖玻片转换为4升烧杯, 填充2.5 升_ddH2 O, 并摇动包含盖玻片的烧杯, 在 100 rpm 处为1小时。在摇晃的时候用橡皮筋来控制烧杯。重复冲洗与新鲜的 2.5 L ddH₂O 四次。
3. 将清洗过的盖玻片转到带有金属盖的干烧瓶中。烘烤的盖玻片在一个烤箱在225°c 6 小时, 让他们冷却到室温。
   注:25 毫米盖玻片容易折断。将盖玻片分开, 晾干, 然后用烤箱烘烤。
4. 将干燥和清洁的盖玻片在室温下存放在灭菌塑料容器中, 直到使用。
5. 外套盖玻片如下:
   1. 在离心管中制备新的涂层溶液。
   2. 将每个盖玻片放入一个24井 (或6井) 板的一个井中。将盖玻片涂层溶液(表 1) 的 30 (或 100) µL 到12毫米 (或25毫米) 盖玻片和涡流。在井中加入1毫升无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS, 组织培养级)。这些板可以立即使用或储存在4摄氏度在无菌 PBS 长达一周。
   3. 在解剖的那天, 取出 PBS。空气干燥和安置板材在紫外光 (30W) 之下为 2-4 h。
      注: 最后一步应在细胞培养层流罩上的紫外线照射下完成。引擎盖的门应该稍微抬起, 以允许气流干燥盖玻片。

2. 孕鼠/大鼠海马神经元的解剖、分离和培养

1. 培养海马神经元的解剖与分离
   1. 解冻蛋白酶酶溶液 (3 毫克/毫升蛋白酶23在 SLDS,表 1) 和预热前电镀介质 (表 2) 在37°c。
   2. 根据上一出版物¹⁴中描述的方法, 解剖海马并用 SLDS 冲洗。
      注: 四海马为一个24井或一个6井板提供足够的电池。
   3. 去除 SLDS, 加入2毫升蛋白酶酶溶液, 并在37摄氏度, 5% CO₂上孵化样品15分钟。
   4. 用5-10 毫升电镀培养基将海马外植体清洗两次。添加5毫升电镀培养基。用1毫升塑料尖端的吸管产生一个小漩涡, 将海马外植体分离成单个细胞。吸管上下大约40次, 避免形成氧泡, 直到溶液变得混浊, 没有大块的外植体依然存在。
      注: 切记在洗涤过程中留一些培养基, 在整个过程中, 海马外植体应保持在培养基中浸泡。
   5. 离心细胞在 1125 x g 3 分钟. 用介质淹没的细胞去除上清液。并用重悬145毫升的电镀培养基中的细胞。添加1毫升/井的细胞悬浮到一个24井板 (3 毫升/井到6井板)。
      注: 145 毫升电镀介质用于产生细胞悬浮, 细胞密度低。这一体积将允许电镀细胞成六24井板, 八6井板, 或各种组合的24或6井板, 取决于要进行的实验。24井板的每个井都有约 3 x 10⁴单元⁹。
   6. 将电镀介质中的细胞孵化37摄氏度, 5% CO₂用于 2-4 h, 然后取出所有电镀介质, 并用新鲜的维护介质替换。
   7. 2天 (2 天体外, 2DIV), 用2µM (arabinosylcytosine) 溶解于维持介质中, 将一半的培养基替换为抑制成纤维细胞、内皮和胶质干细胞生长的介质。将细胞暴露在两天后, 用新鲜的维护介质替换介质。
2. 细胞形态学可视化的转染
   注: 染细胞与荧光结构的绿色荧光蛋白 (GFP), 黄色荧光蛋白 (YFP), mCherry,等, 以照亮个别神经元的形态学。
   1. 将构造从股票 (1 µg/µL) 稀释成最的介质 (50 µL 中的结构的0.8 µg) 和涡。准备1建筑稀释为每个井。
      注: 一个24井板需要0.8 µg 的结构, 在50µL 的最适记忆介质。一个6井板需要2.4 µg 的结构在150µL 的记忆介质。
   2. 将脂质体介导的转染试剂稀释到µL 介质中 (50 µL 中的1.5 的转染试剂) 和涡流。准备1转染稀释为每个井。
      注:24 井板需要1.5 µL 的转染试剂, 在50µL 的最适记忆介质。一个6井板需要4.5 µL 的转染试剂在150µL 的最适记忆介质。
   3. 准备1:1 混合物 (100 µL) 的结构, 在更低的记忆介质和转染试剂的最适记忆介质和涡流。室温下将混合物孵化20分钟。
      注: 如果使用 24-井板 (300 µL 6 井板), 每一个井, 应有约100µL 的解决方案, 包含结构, 转染试剂, 和最适合的记忆介质。
   4. 卸下一半的介质 (500 µL 为24井板, 1.5 毫升6井板) 从每个井和转移这个媒介成一个干净的锥形管。把这个管子放在孵化器里。然后将100µL 混合物 (步骤 2.2.3) 添加到井中的剩余介质中。允许细胞在37摄氏度孵育20-30 分钟。
   5. 在孵化过程中 (步骤 2.2.4), 在锥形管 (步骤 2.2.4) 的介质中添加一卷新鲜的维护介质。将混合物放入同一孵化器 (37 °c 和 5% CO₂)。
   6. 在孵化后, 从井中移除包含转染溶液的所有介质, 并将其替换为锥形管 (步骤 2.2.5) 中旧的和新鲜的维护介质的1:1 混合物。
      注意: 根据构造的大小, 单元格可以在12小时内开始表达;对于较大的构造, 在达到构造的峰值表达式之前, 可能需要3-4 天。

3. 设置膨化吸管装置

注: 此设置有五基本组件: 玻璃吸管、油管、注射器、机器人和缓冲器 (汉克)。任何具有生理相关盐浓度的缓冲液都可用于此装置。

1. 使用微拉出器和表 3中的规范, 在45µm 直径的开口尖端上拉一个硼硅吸管。
   注: 在实验条件下, 发现45µm 是适用于吸管开口直径的合适尺寸。开口尺寸稍有变化不应显著影响结果。重要的是要注意的是, 更大的偏离这个数字应该仍然工作的静脉曲张诱导通过调整注射器的高度与吸管通过油管, 但这将需要重新校准的压力值。
2. 将吸管的未拔出端插入薄橡胶管。
   注: 油管壁应薄而刚性, 以尽量减少流体阻力, 确保注射器的高度与流体通过吸管的压力直接成正比, 阻力极小。油管长度不得超过0.6 米, 以进一步减少阻力。
3. 将油管的另一端连接到一个10毫升的塑料注射器上, 通过连接器与可转动的阀门相连。
   注: 塑料注射器需要保持在一个恒定的, 可测量的高度, 以确保一个准确的措施, 假定压力流动从吸管。高度190毫米被使用了, 因为这提供极小的压力, 但可靠地诱导静脉曲张在轴突。如果压力导致单元格从盖玻片表面分离, 也可以使用其他高度值。建议在整个实验中使用相同的设置。
4. 将吸管插入机器人的螺钉顶部, 将吸管固定到位。拧紧连接在机器人臂上的金属, 平顶螺钉, 使其保持在所附橡胶管的上方的吸管的未拔出端。在45°角上用含有神经元的盖玻片的表面将吸管倾斜。
   注: 应构造机器人, 使吸管可以在不收缩橡胶管的情况下举行。机器人必须允许在 x、y 和 z 方向的吸管运动, 以便准确地将其放置在细胞的范围内。下面提供了一种图形以及该设备的照片 (图 1)。
5. 打开荧光滤光片, 开启光圈, 确保荧光点可以通过目标来观察。使用机器人, 将吸管移入一个位置, 将针尖与荧光点对线, 并将吸管降低到刚好高于细胞培养皿高度 (35 毫米 x 10 毫米) 的位置。一旦定位到位, 打开透射光并关闭荧光。
6. 使用镊子, 添加一个盖玻片 (与细胞朝向向吸管) 从细胞培养板到细胞培养皿包含约2毫升的汉克的缓冲在室温下。
7. 将包含盖玻片的文化菜盘放到范围内。
8. 使用精细对焦旋钮和20X 目标, 聚焦在四个以上的细胞 (约0.4 毫米) 的平面上。使用机器人定位吸管尖端, 使其集中, 并在中心, 左侧的平面上看到通过眼睛片断。
   注意: 树突是投射, 应该与它们起源的细胞体在同一帧中。为诱发轴突静脉曲张, 应遵循从细胞体到内侧和远端轴突的较长的投射。

4. 使用伸缩膜系统校准吸管的压力

1. 在含有 microfabricated 硅膜 (直径500µm 和50µm 厚) 的系统上设置与上述参数完全相同的膨化吸管装置, 并将显微镜聚焦在膜表面。
   注: 本系统设计用于测量小压力值, 并在¹⁰之前发布了系统说明。这种测量只需要做一次的膨化实验, 如果使用完全相同的膨化的设置。
2. 将显微镜聚焦在微粒的阵列上 (直径为4µm, 在中心之间测量10µm)。转动截止阀, 允许液体从吸管流出。用共焦显微镜检查膜的挠度, 以响应流体压力。
3. 利用线性模型确定与膜挠度相关的压力。
   注: 虽然最近的一项研究发现 w =-3.143 0.69 µm 的偏转是为190毫米注射器高度获得的, 这产生了压力 0.25 @ 0.06 nN/µm²从目前的吸管设置, 这是在生理和病理范围内, 虽然注射器高度不是唯一的决定因素。其他因素也会影响神经元的确切压力值, 包括吸管的开口、与细胞相对的吸管尖端的定位 (距离和角度), 甚至是导管的灵活性^4,10。

5. 膨化诱导静脉曲张

1. 一旦吸管就位, 将显微镜聚焦在包含感兴趣区域的平面上。将单元格和进程放置在成像场的左半部分 (通过相机的实时捕获) 在膨化区域内, 而右半部分位于膨化区域之外。
   注意: 由于神经元轴突和树突的广泛生长, 神经元的所有过程不太可能在同一膨化区域内。这实际上是这个系统的一个优点, 它允许检查膨化的局部效应。有两种膨化方式可用于诱导静脉曲张: 长时间膨化和脉冲膨化。
2. 膨化
   1. 长时间膨化
      1. 将注射器放置在高度, 190 毫米以上的盖玻片包含培养的^神经元4。开始时间推移成像的兴趣区域与优化曝光时间, 揭示清晰的神经元形态学。以2秒间隔 (三十年代总计) 捕获至少15帧作为基线。该间隔可以根据实验进行调整。在16帧, 打开注射器的可转截止阀, 允许流体流动75帧 (150s)。在75帧, 关闭阀门, 使流体流动停止。停止视频捕获。
         注: 这应诱发神经元轴突静脉曲张在5-10 秒内 7-9 DIV, 而较旧的神经元需要较长的时间来形成静脉曲张。
   2. 脉冲 (2 s 持续时间) 膨化
      1. 将注射器放置在适当的高度 (190 毫米)。开始时间推移成像和捕获至少15帧 (三十年代) 在2秒的时间间隔。在16帧, 打开注射器的阀门, 允许流体流动, 然后在2秒后关闭阀门. 等待5-20 秒 (取决于要测试的频率), 然后再打开阀门。重复开启和关闭阀门以产生流体脉冲, 并持续150-300 秒的总周期. 持续时间推移成像20分钟, 以捕获恢复阶段。
         注: 当间隔时间长于十年代时, 脉冲产生的静脉曲张大大减少。在二十年代的时间间隔内, 脉冲⁴不能诱发静脉曲张。为获得可靠、一致的静脉曲张形成, 建议注射器高度应在190毫米左右. 注射器高度和流体压力不应提高到细胞开始从盖玻片表面分离的地步。
   3. 使用前一天, 清洁设置 (吸管, 油管, 和注射器) 通过流动约10毫升70% 乙醇通过设置。在乙醇清洗后, 通过设置以使系统在当天使用时, 流10毫升的汉克缓冲器 (或所需的缓冲器)。在完成当天的实验后, 清洁以前用乙醇描述的设置, 以防止污染物在一夜之间生长。

6. 恭维方法

注: 膨化试验可以结合各种不同的技术, 在介绍部分讨论。在这里, 重点是与膨化试验最常用的核心技术, 包括高分辨率荧光 timelapse 成像, 钙成像和恢复化验。下文将讨论这些问题。

1. 按照下面的协议进行高分辨率荧光时间推移成像
   1. 用100X 油透镜跟踪神经元内荧光标记蛋白的运动。神经元用适当的 cDNA 结构进行转染。捕获150帧 (总 300s), 间隔为2秒。
      注意: 有时, 多色时移成像是同时对多个荧光标记的蛋白质的运动进行图像处理的。
   2. 通过视频捕获软件或通过 ImageJ (NIH) 生成 kymograph。
      注意: 使用 kymograph 可以确定旅行的速度和方向性。* 一定要注意到从捕获的区域中的躯体所在的方向。对躯体的旅行是逆行的, 而从躯体到轴突尖端的旅行顺。
   3. 重复此过程后膨化, 或一个 kymograph 可以创建使用图像捕捉期间膨化试验。
      注意: 膨化对线粒体和突触蛋白的轴突传输的影响在最近的一篇论文⁴中显示。
2. 钙成像
   1. 增加1µL (为24井板材) 或3µL (为6井板材) 5 毫米 Fluo-4 是对文化媒介在一个井和孵化在37°c 为30分钟。
   2. 用1毫升的缓冲器洗两次细胞。
      注: 加载的神经元通过 FITC 过滤器集发出绿色荧光。基因座表示细胞内有明显钙的区域。当与膨化结合时, 可以看到强度的增加 (内部钙含量的增加)。
3. 静脉曲张恢复
   注: 在膨化实验之后, 可以进行20分钟的恢复实验。
   1. 捕获300帧 (1200 s) 的图像, 其间隔为4秒。
      注意: 用可溶性 YFP/mCherry/GFP 转染的细胞应在成像会话结束时显示中等水平 (少于 50%) 的恢复。轴突恢复取决于多种因素, 如培养神经元的发育阶段⁴。这也可以与上面描述的高分辨率荧光成像和钙成像相结合。

结果

在膨化前, 轴突通常表现为小静脉曲张形成。随着我们的标准压力 (190 嗯₂O 高度) 的膨胀, 轴突开始发展许多像珠样的静脉曲张。静脉曲张的形成部分是可逆的, 如轴突区域在10分钟恢复期后返回到其预膨胀状态 (图 2a B) 所示。经过较长时间的恢复 (> 20 分钟), 一些轴突完全恢复。膨化吸管的次优定位以及190毫米以上的注射器准确定位可能不会迅速产生静脉曲张。最佳条件应导致年轻神经元轴突的静脉曲张形成 (约 7 DIV), 约 5 s⁴。

图 1

讨论

这 microbiomechanical 化验的程序是直接的。它将产生可靠的结果, 如果所有的步骤都仔细执行。有几个关键步骤, 如果执行不当, 将阻碍成功的数据收集。关键步骤从实际应用到膨化刺激的上游开始。仔细解剖, 培养和照顾的主要神经元培养是至关重要的。如果培养的神经元不健康, 它们就不会持续反应, 因为它们可能已经被灌输给压力。下游的文化, 初始设置和校准的膨化设备提供一致的压力, 这将诱发静脉曲张, 但不会导致细胞脱离盖玻片表面, 必须进行耐心。精确校准的设置可能需要1小时由于吸管堵塞, 油管, 或阀门的问题。重要的是要确保液体流出的吸管与最小的阻力, 然后向前移动, 放置在盘子里的细胞和定位的吸管尖端。至于对设置的修改, 你可以对膨化设备与灌注, 补丁夹紧, 和任何其他显微镜的仪器, 主要依赖于物理空间免费在显微镜的侧面。

这个系统有两个内在的局限性, 需要注意。在培养的海马神经元的轴突中, 通过向细胞膨化液, 可以持续地形成可逆静脉曲张。然而, 重要的是要注意到, 在同一膨化领域的神经元的确切压力值是不相同的。根据来自 microfabricated 硅膜的压力负荷测量...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
12 mm 盖玻片	华纳仪器	64-0702	代表 24 孔板
25 mm 盖玻片	费舍尔科技	12-545-102	用于 6 孔板
醋酸	Fisher Scientific	A38-212
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
鼠尾胶原蛋白	罗氏	11 179 179 001
10X PBS	国家诊断	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientific	S373-500
K2SO4	Fisher Scientific	P304-500
HEPES	费舍尔科技	BP410-500
D-葡萄糖	费舍尔科技	D16-500
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
NaOH	Fisher Scientific	SS255-1
蛋白酶	西格玛	P4032
FBS	Gibco	26140
丙酮酸钠	Gibco 公司	11360-070
L-谷氨酰胺	Gibco 公司
青霉素/链霉素 100x （P/S）	Gibco
MEM Earle's 盐	Gibco 公司	11090
B27 增刊	Gibco 公司	17504-044
神经基底	Gibco 公司	21103-049
阿拉伯糖基胞嘧啶 （Ara-C）	Sigma	147-94-4
Opti-MEM 培养基	Gibco 公司	31985-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	1854313	转染试剂
硼硅酸盐棒材	世界精密仪器公司	PG52151-4	用于膨吸管
橡胶管	费舍尔科技	14-169-1A
10cc 塑料注射器和柱塞	Becton Dickinson
显微作器	萨特仪器
氯化钠	费舍尔科技	S640-3
氯化钾	费舍尔科技	BP366-500
CaCl2	Fisher Scientific	C70-500
细胞培养皿 （35 mm x 10 mm）	康宁	3294
Fluo-4 AM	分子探针	F14201
Mito-YFP 构建体	Takara Bio Inc.		用于细胞转染
YFP-N1 构建体	Takara Bio Inc.		用于细胞转染
型号 P-1000 火焰/棕色微量移液器拉拔器	萨特仪器
Eclipse TE2000-U 显微镜	尼康
Plan Fluor ELWD 20x 镜头	尼康	062933	物镜
Apo TIRF 100x/1.49 油性镜头	尼康	MRD01991	物镜