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方法文章

利用高频超声（30/45 MHz）系统对胎鼠心血管成像

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DOI：

10.3791/57210

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2018年5月5日

1Neonatal/Congenital Heart Laboratory, Cardiovascular Research Laboratory, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Children's Discovery and Innovation Institute, Department of Pediatrics, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

本文内容

摘要

高频超声成像技术显著提高了胎鼠心脏的成像分辨率，可实现对心脏发育过程及结构缺陷的精确、无创性表征。本文所述方案旨在进行实时胎鼠超声心动图检测 体内.

摘要

先天性心脏病（CHDs）是儿童发病和早期死亡最常见的原因。产前检出 先天性心脏病（CHDs）潜在分子机制的研究 对于发明新的预防和治疗策略至关重要。突变小鼠模型是发现新靶点的有力工具 机制 以及驱动心脏发育并影响其潜能的环境应激调节因子 先天性心脏病（CHDs）中的改变。然而，针对这些假定致病因素的因果关系建立，目前仅局限于组织学研究 以及分子研究 在非存活动物实验中，其中 监测关键的生理和血流动力学参数是 常常缺失。活体成像技术已成为建立 先天性心脏病的病因。特别是 超声成像可用于产前检查，无需通过手术暴露胎儿， 允许维持 在监测环境胁迫影响的同时记录其基础生理状态 在心脏腔室发育的血流动力学和结构方面。在此，我们使用高频超声（30/45） 用于在E18.5阶段检测胎鼠心血管系统的体系 在子宫内 在基线水平及产前缺氧暴露后的反应。我们展示了该系统用于测量胎鼠心脏心腔大小、形态、心室功能、胎心率以及脐动脉血流指数的可行性，并揭示了系统性慢性缺氧暴露对这些参数的影响。 在子宫内 实时地

引言

先天性心脏畸形是在早期心脏发育过程中发生的异质性结构缺陷。目前手术技术的进步已显著提高了患者的生存率 患有先天性心脏病的婴儿1,2然而，生活质量常常因继发性因素而受到影响 长期住院及分期手术修复的需求1,2,3,4,5先天性心脏病潜在分子机制的产前检测对于规划早期干预、实施新的预防策略以及改善终身预后至关重要6,7.

尽管多种遗传和环境因素已被认为与先天性心脏病（CHDs）的发病机制相关，但明确其因果关系仍是改进诊断、治疗和预防策略尚未满足的需求1,8,9,10,11,12此外，研究这些角色 在子宫内 应激因素与表观遗传修饰剂为未来研究开辟了新的方向11,12近十年来，下一代测序技术取得了快速进展，包括单核苷酸多态性（SNP）微阵列、全外显子组测序以及全基因组甲基化研究， 其在研究包括先天性心脏病（CHDs）在内的复杂人类疾病遗传病因中的应用1,8,9,10,11 为鉴定奠定基础 尚未在合适的动物模型中对其致病性进行检测的新发突变和遗传变异

在各种疾病模型系统中，小鼠 是研究早期心脏发育过程中先天性心脏病（CHDs）机制的首选动物模型13,14,15,16，还阐明产前和围产期应激因素对晚期妊娠心脏腔室成熟与功能的影响。因此，进行 体内 在胚胎发育的早期和晚期阶段对突变型胎鼠心脏进行表型表征，对于理解这些遗传变异的作用至关重要 环境因素对 心脏发育，以及对小鼠心腔特异性成熟过程的潜在未来影响。

发育过程中心脏缺陷的早期检测与准确诊断对干预方案的制定至关重要17,18由于安全、简便、便携且可重复，胎儿超声检查已成为临床心脏评估的标准影像学技术。利用多普勒超声进行胎儿循环评估已在临床实践中广泛应用。 不仅可用于检测 心脏缺陷，还可检测血管异常、胎盘功能不全和 宫内生长受限，以及评估胎儿对 在子宫内 包括低氧血症、母体疾病和药物毒性在内的损伤因素17,18与其并行 在评估人类缺陷和疾病方面具有重要价值，胎儿小鼠的超声评估在实验环境中正获得越来越广泛的应用19,20,21,22,23特别是胎儿心脏超声（超声心动图）可实现连续观察 体内 心脏发育的可视化。许多实验研究已采用超声成像技术来观察转基因胎鼠的心血管发育过程。多普勒超声在阐明生理挑战或疾病状态下胎儿循环中的血流模式等病理生理参数方面尤为有用。10,19在人类和动物中，多种状况可导致胎儿血流或氧气供应异常，从而破坏胎儿所处的环境。 在子宫内 并影响胎儿-胎盘轴，包括胎盘 异常、母体缺氧、妊娠期糖尿病以及药物诱导的血管收缩15,22因此，建立对胎鼠进行多普勒超声检查的标准化方法，将通过促进先天性心脏病（CHDs）的未来研究而极大增强相关领域的研究能力 监测 遗传小鼠模型中心血管回路在心脏发育不同阶段的血流模式及关键血流动力学指标.

高频超声已成为测量发育过程的一种强大工具 小鼠模型中心血管系统的生理参数 和人类疾病18近年来，该技术得到了进一步优化。我们及其他研究人员已证实，该系统可用于开展胎鼠心脏的超高频超声研究。15,19,20,21,22,23该系统配备多普勒彩色血流成像和线阵探头，可在高频（30至50 MHz）帧率下生成二维动态图像。与低频超声系统及上一代高频超声系统相比，具有上述优势。21,22，可为实验条件下胎鼠循环系统的深入评估提供必要的灵敏度和分辨率，包括对心脏结构、心腔功能及血流指数的全面表征。本文概述了在胚胎第18.5天（E18.5）快速评估心肺循环及胎儿-胎盘循环的方法。 体内 通过使用高频 系统。我们选择了一个30/45 MHz的换能器，其轴向分辨率为约60 µm，横向分辨率为150 µm。然而，通过采用类似的方法学途径，也可选用更高频率的换能器（40/50 MHz）来分析更早期的发育阶段。所选的M型模式可在高时间分辨率水平下（1,000帧/秒）实现对运动组织的可视化。最后，我们 证明高频超声在小鼠基线状态及产前缺氧应激条件下，对胎儿心血管血流动力学状态和功能进行详细、全面表型表征的可行性。

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方案

加州大学洛杉矶分校动物护理与使用委员会已批准本方案中所示的所有操作程序。这些实验是在美国加利福尼亚州加州大学洛杉矶分校机构动物护理与使用委员会批准的有效动物实验方案下开展的持续性研究的一部分。动物的饲养与护理遵循《实验动物护理与使用指南》中的标准。

1. 准备高频超声成像系统

  1. 打开超声成像系统和生理监测仪。
  2. 连接 30/45 MHz 探头。
  3. 将相应的扫描头放置在成像平台附近的支架上。
  4. 选择 Cardiac Measurement Program 选项。
  5. 将超声耦合剂倒置放入预热至 37 °C 的预热容器中。
  6. 确认麻醉用管路系统正常，并检查氧气和异氟烷的液位。
  7. 对成像平台及工作区域进行消毒。
  8. 调节成像平台的加热档位，以维持母体恒定的体温和心率。

2. 孕鼠准备

  1. 将怀孕的小鼠（C57/BL6）放入麻醉诱导室中。
  2. 通过持续输送异氟烷（异氟烷 2%–3%）与100%氧气（100% O2）的混合气体，以200 mL/min的流速在诱导室中进行麻醉诱导。
  3. 将已镇静的小鼠转移至成像平台，保持仰卧位。
  4. 使用连接麻醉管路系统的面罩，持续提供异氟烷（1.0%–1.5%）与100% O2的混合气体，流速为200 mL/min，以维持稳定状态的镇静。
    警告：应使用配备含活性炭过滤罐的通风系统，以控制麻醉气体泄漏。
  5. 在涂抹电极凝胶后，将四肢轻轻固定于嵌入式心电图电极上，以持续监测母体的心率和呼吸频率。
  6. 调节异氟烷浓度，使平均心率维持在（450 ± 50 次/分钟（bpm））。
  7. 将体温维持在37.0 °C ± 0.5 °C范围内，并通过生理监测控制器实时监测体温和心率。
  8. 在整个成像过程中，每15分钟记录一次镇静小鼠的生命体征。
  9. 通过评估小鼠的体位、心率以及对足趾夹捏的反应，判断麻醉深度。
  10. 涂抹眼用软膏（每眼1滴），以防止眼睛干燥和角膜损伤。
  11. 使用脱毛膏去除从胸部中段至下肢的毛发，以减少超声波衰减。涂抹脱毛膏后1–1.5分钟内，交替使用湿、干纱布擦拭清除，以避免皮肤损伤。

3. 胚胎鉴定

  1. 轻柔触诊腹壁以定位胎儿，并将其分散开。
  2. 用记号笔在母体腹部标记每个胚胎，并标注其头尾轴和背腹轴方向。
  3. 以镇静后母鼠的子宫颈作为解剖标志。将左侧和右侧子宫角的胎鼠分别标记为 L1、L2、L3。 等等。 （左侧）以及 R1、R2、R3 等等。 （右侧），分别（图1A).
    注意：避免用力撑开胎鼠。每窝中可能有1-2只胎鼠与其他胎鼠重叠，导致其定位和成像不可靠。此类胎鼠应排除在分析之外。

4. 胎儿心脏可视化与标注

  1. 在腹部涂抹预热的超声耦合剂，并小心涂抹以避免产生气泡。在扫描成像区域添加足量的耦合剂。
  2. 将超声探头放置于其机械支架上，并逐渐移动至皮肤，使其接触较厚的耦合剂层，同时使用B模式扫描寻找跳动的心脏（图1）。
  3. 点击扫描B模式按钮以获取二维图像。以膀胱作为解剖标志，识别位于右侧或左侧子宫角的第一个胎儿，并分别标记为R1或L1。
  4. 通过在水平面内移动成像平台，实时确认单个胎儿的左右方位。从头部至尾部进行扫描，标注吻部、四肢和脊柱作为解剖标志（图1B，视频1）。
  5. 观察跳动的心脏，并标注左心室（LV）和右心室（RV）。使用彩色多普勒模式优化心脏的可视化效果（图1 C-G，视频1-2）。
  6. 点击扫描B模式按钮，获取胸骨旁短轴切面，使LV和RV在其最大直径处位于数据采集帧的中心。开始实时成像（图1B-C）。
  7. 调整小鼠相对于扫描平面的方向，以获得长轴四腔心切面（图1D）。首先识别心脏的其他结构，如心房、室间隔以及左、右心室流出道。随后使心室和心房腔室在其最大直径处显示，然后开始图像采集。
  8. 在最终分析中排除非最佳或斜切的图像。点击Cini按钮，连续录制至少10秒的动态图像序列（“Cineloops”），然后保存所记录的图像。

5. 评估胎儿心率和心室功能

  1. 点击扫描M型按钮，从四腔心切面获取心脏图像（视频3）。
  2. 当所有胚胎的图像采集完成后，查看用于分析的录影列表。
  3. 在最终分析中排除非最佳或斜切的图像。
  4. 点击分析按钮，测量舒张期和收缩期的室壁厚度以及左/右心室内径（LVID, d；RVID, d 和 LVID, s；RVID, s），如图2所示。
  5. 通过播放每段记录的M型图像，计算一个血流周期到下一个血流周期的时间间隔（相邻峰值之间的间距），以确定平均胎儿心率。
  6. 进行多次测量（每段至少5次），以获得平均心率（图2）。
  7. 测量心动周期中左心室内径舒张末期（LVID, d）与收缩末期（LVID, s）之间的时间变化，然后按以下公式计算缩短分数百分比（FS%）：FS%=[(LVID,d-LVID,s)/LVID,d]x100。
  8. 进行多次测量（每段至少5次），以获得平均FS%值。

6. 评估心肺血流参数

  1. 调整扇形角度，使其采集角度小于60o。点击多普勒按钮，使用45-MHz换能器从二维四腔心成像平面进行脉冲波多普勒测量。
    1. 首先，观察肺动脉的分叉处以识别右心室流出道。然后，点击脉冲波多普勒按钮，获取通过肺动脉瓣和主动脉瓣的血流频谱（图3A，视频4）。
  2. 从脉冲波多普勒频谱中获取肺动脉血流参数，包括收缩期峰值流速（PkV）、加速时间（AT）和射血时间（ET）。
  3. 进行多次测量（每条频谱至少5次），以获得平均值，如图3A（右图）所示。
  4. 计算每个流出道瓣膜的AT/ET比值，作为评估流出道通畅性和血流状态的指标。
  5. 继续使用脉冲波多普勒从二维心尖四腔切面获取二尖瓣和主动脉瓣的血流频谱。首先，识别左心房 和左心室腔室。然后，将脉冲波多普勒取样容积置于适当位置，记录二尖瓣流入道多普勒频谱，并测量舒张早期流速（E）和心房收缩期流速（A）（图3B）24,25。
  6. 调整多普勒取样容积，获取主动脉多普勒射流频谱。利用主动脉多普勒射流频谱测量加速时间（AT）和射血时间（ET），如图3B（右图）所示（视频5）。

7. 评估胎儿-胎盘轴

  1. 使用彩色多普勒扫描，通过45 MHz探头观察子宫动脉和胎儿-胎盘血管树（图4A）。
  2. 在脐带自胎儿腹部穿出后的羊膜内段，识别脐带内的脐血管（两条动脉和一条静脉）。
  3. 放置脉冲波多普勒取样容积，获取脐动脉血流波形（图4A）。
  4. 利用脉冲波多普勒扫描记录，测量血管峰值血流参数，包括加速时间（AT）、射血时间（ET）以及收缩末期峰值流速（PkV, s）（图4B）。
  5. 在无胎儿运动和 母体呼吸运动干扰的情况下，于每条血管中连续获取5个波形，以测量每条血管的平均峰值流速。
  6. 继续下一个胚胎的操作。

8. 成像后动物监测

  1. 成像过程结束后，关闭异氟烷容器。
  2. 在恢复期间持续监测体温、呼吸频率和心率。
  3. 一旦母鼠开始出现自主活动，立即移除面罩及连接的管路系统。
  4. 将母鼠送回合适的饲养环境，并根据机构标准的术后观察规程继续观察。
  5. 记录恢复正常活动所需的时间。

9. 性能要求与技术考量

  1. 将约8只胎鼠的处理时间限制在1小时左右，以避免长时间麻醉对生命体征和生理参数产生不利影响。
  2. 通过对8至10只妊娠小鼠进行训练，优化在短时间内完成图像采集和血流模式追踪的技术。

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结果

心脏和血流动力学指标的统计学分析离线进行。计算3张最佳图像中连续5次测量的平均值。数据以均值±标准误（Mean ± SEM）表示。组间比较采用学生t检验。以P值≤0.05为差异具有统计学意义。

根据上述方案，我们通过在妊娠18.5天对C57/BL6系定时妊娠小鼠进行实时高频超声记录，表征了产前慢性缺氧暴露对晚期妊娠小鼠胎儿心血管状态的影响。

建立繁殖组后，确认交配成功。将定时妊娠的母鼠置于笼中饲养，保持12小时光照-12小时黑暗的光照周期，并自由供应食物和水。 随意摄取 直至妊娠14.5天（GD14.5），怀孕小鼠被分配至常氧组（维持在室内空气中）或低氧组（置于低氧舱内，吸入氧浓度为10% FiO₂）2 以诱导全身性缺氧）。出生后，母鼠及其幼鼠继续保留在各自...

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讨论

心血管畸形和疾病在很大程度上受到遗传因素和环境因素的影响19。我们先前已证明，从妊娠中期开始实施的母体热量限制对胎儿-胎盘循环血流及胎儿心脏功能具有显著影响9。

产前缺氧是胎儿发育过程中另一种常见的应激因素，可能极大地影响胎儿-胎盘生理及 循环系统。在先天性心脏病（CHD）背景下，产前缺氧暴露的影响可能更为显著，导致围产期难以适应出生后的生活。本研究中检测到的异常心率和心脏指数确实是心脏应激及胎盘循环生理改变的重要指标，因此构成了识别发育缺陷以及随之而来的血流动力学改变的基本要素；这些改变在产前缺氧应激下可能进一步加剧，进而导致早期心力衰竭。与预期相反的是，暴露于缺氧环境的胎儿心率较低。这一现象可能反映了在妊娠18.5天（GD18.5）时，胎鼠对缺氧反应中心脏自身调节机制尚未成熟。然而，其确切的发病机制仍不清楚。

尽管其他先进的成像方法（如胎儿心脏磁共振成像）能够在发育过程中对心脏结构进行实时成像

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致谢

我们感谢加州大学洛杉矶分校分子医学部动物生理学核心设施提供的支持 技术支持 并开放获取Vevo 2100超声生物显微镜（UBM）系统。本研究由美国国立卫生研究院/儿童健康研究中心（5K12HD034610/K12）、加州大学洛杉矶分校-儿童发现研究所、今日与明日儿童基金以及M. Touma获得的大卫·格芬医学院研究创新奖资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Vevo 2100VisualSonics，加拿大安大略省多伦多市N/A高频超声生物显微镜。该设备位于美国加州大学洛杉矶分校（UCLA）分子医学部动物生理学核心设施。
近交系小鼠（c57/BL6）查尔斯河实验室N/A近交系野生型小鼠品系

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