腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca2+-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

摘要

本文介绍了一种分离和培养小鼠腹腔肥大细胞的实验方案。同时，我们还描述了两种用于其功能表征的方法：一种是通过荧光成像检测细胞内游离Ca²⁺浓度的变化，另一种是基于比色法定量释放的β-己糖胺酶来评估脱颗粒反应的实验方法。

摘要

肥大细胞（MCs）作为免疫系统的一部分，在抵御多种病原体以及启动过敏免疫反应中发挥关键作用。通过高亲和力IgE受体（FcεRI）与表面结合的IgE发生交联，以及其他多个受体的刺激，可激活肥大细胞，引发细胞内游离Ca²⁺浓度（[Ca²⁺]_i）升高，从而促进炎症和过敏介质的释放。鉴定参与这些信号通路的分子组分，对于理解肥大细胞功能的调控机制至关重要。本文描述了一种通过腹腔灌洗分离小鼠结缔组织型肥大细胞并培养腹腔肥大细胞（PMCs）的实验方案。利用该方法培养来自不同基因敲除小鼠模型的肥大细胞，是鉴定参与肥大细胞信号通路蛋白的有效手段。此外，我们还介绍了一种单细胞Fura-2成像技术的实验方案，该技术是定量检测肥大细胞中Ca²⁺信号的重要方法。基于荧光的[Ca²⁺]_i监测是一种可靠且常用的技术，可用于研究包括钙库操纵性钙内流在内的Ca²⁺信号事件，后者对肥大细胞的活化尤为重要。在肥大细胞脱颗粒分析方面，我们描述了一种β-己糖苷酶释放实验。释放到培养基中的β-己糖苷酶含量被视为肥大细胞中三种不同分泌亚群的脱颗粒标志物。通过微孔板比色法，利用显色底物与β-己糖苷酶发生反应，可方便地定量检测其含量。该技术高度可重复、成本低廉，且无需特殊设备。总体而言，本方案可获得高产量的肥大细胞，这些细胞表达典型的肥大细胞表面标志物，具有典型的形态学和表型特征，并在Ca²⁺成像和脱颗粒实验中对分泌刺激剂表现出高度可重复的反应。

引言

肥大细胞（MCs）在先天性和获得性免疫反应中发挥重要作用。具体而言，肥大细胞参与杀灭病原体（如细菌和寄生虫），并可降解潜在的有毒内源性肽或毒液成分（综述见Galli et al. 2008¹）。肥大细胞在先天免疫和适应性免疫中的生理功能目前仍存在激烈争论。因此，针对不同肥大细胞缺陷型小鼠模型的研究中出现的大量数据差异，迫切需要对肥大细胞在过敏反应之外的免疫学功能进行系统性重新评估²。成熟的肥大细胞主要定位于皮肤、肺和肠道等组织和器官中，通常在血液中仅少量存在。肥大细胞来源于造血前体细胞，例如肥大细胞祖细胞，并在几乎所有血管化组织的微环境中完成其分化和成熟过程¹。T细胞来源的因子白细胞介素（IL）-3可选择性促进小鼠多能性肥大细胞群体从其造血祖细胞存活、增殖和分化³。干细胞因子（SCF）由组织中的结构细胞产生，在肥大细胞的发育、存活、迁移和功能中起关键作用⁴。单个肥大细胞的特性可能因其合成和储存不同蛋白酶或蛋白聚糖的能力而有所差异。在小鼠中，根据解剖定位、形态以及肝素和蛋白酶含量的不同，可将所谓的结缔组织型肥大细胞与黏膜型肥大细胞区分开来⁵。

在肥大细胞（MCs）中，胞质游离Ca²⁺ （[Ca²⁺]_i）浓度的升高对于抗原及多种分泌刺激物诱导的脱颗粒、二十碳烯酸类物质的生成，以及细胞因子的合成和转录因子的活化均至关重要⁶。这些刺激的主要下游靶点是磷脂酶C，它可将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸水解为二酰甘油（DAG）和肌醇1,4,5-三磷酸。DAG激活蛋白激酶C，而IP3则促使内质网释放Ca²⁺ 离子。这些储存池的耗竭会激活质膜Ca²⁺通道介导的Ca²⁺ 内流，从而引发储存操作性钙进入（SOCE）。该过程通过内质网中的Ca²⁺感受器——基质相互作用分子1（Stim1）与Orai1的相互作用而触发⁷，同时也涉及质膜上瞬时受体电位经典型（TRPC）通道蛋白的激活（综述见Freichel et al. 2014⁸）。

为了研究这些通道的生理功能，通常采用多种药理学方法（如通道阻断剂的应用）或遗传学手段。在后者中，可通过靶向 mRNA（敲低）或对基因组 DNA 进行全局性或组织特异性编辑来实现蛋白表达的抑制⁹ 删除编码通道孔形成亚基的外显子（基因敲除）。目前可用于这些通道且具有足够特异性的阻断剂十分有限。此外，敲低方法需要通过有效性的严格对照来谨慎验证其效果， 例如，蛋白质印迹分析，并且在许多情况下受到针对目标通道蛋白的特异性抗体无法获得的限制。因此，基因敲除小鼠模型的使用仍被视为此类分析的金标准。一种优选的 体外 用于研究MC功能的模型是培养可分离的PMCs 离体 作为完全成熟的群体（而非正在分化的肥大细胞） 体外 从， 例如骨髓细胞¹⁰与常用于研究肥大细胞功能的骨髓来源肥大细胞（BMMCs）相比 体外，FcεRI 的刺激以及 β-己糖胺酶的释放分别在肥大细胞中增加了 8 倍和 100 倍。本文中，我们描述了一种小鼠肥大细胞分离与培养的方法，该方法能够获得 培养2周后，可获得大量纯化的结缔组织型肥大细胞，足以用于后续分析。

尽管基因编码的钙指示剂在开发和应用方面已取得最新进展，但其使用仍受限于将基因递送至靶细胞的困难，特别是在原代培养的肥大细胞（MCs）等高度特化的细胞中。此外，用于细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）检测的这类荧光指示剂仍缺乏具有高动态范围的比率型染料。因此，目前进行比率型[Ca²⁺]_i检测的首选方法仍然是使用荧光染料"Fura-2"¹¹。

目前，评估肥大细胞（MC）活化和脱颗粒最常用的方法是检测β-己糖胺酶活性。β-己糖胺酶是一种过敏介质，是肥大细胞颗粒成分之一，与组胺以恒定比例从肥大细胞中共释放¹²。通过该酶与特异性底物的反应，可简便且准确地测定β-己糖胺酶活性，该反应生成可定量的显色产物，可在微孔板比色法中轻松检测。本文报道了该技术在分析原代肥大细胞（PMC）对多种刺激物产生脱颗粒反应中的应用。

高亲和力质膜IgE受体（FcɛRI）在肥大细胞（MCs）中的聚集会激活一条多功能的细胞内信号通路，导致分泌性颗粒内容物释放到周围的细胞外空间。除特异性抗原外，许多其他刺激物也可激活肥大细胞，释放多种免疫调节介质，例如补体过敏毒素（如，C3a和C5a）¹³、血管收缩肽内皮素1（ET1）¹⁴，以及多种阳离子物质和可引发假性过敏反应的药物（如，依卡替班）¹⁵，这些物质通过与MRGPRX2结合发挥作用¹⁶。相较于FcɛRI介导的细胞内信号通路，MRGPR诱导肥大细胞脱颗粒所涉及的细胞内信号通路目前仍知之甚少；自该受体被鉴定以来¹⁶，相关通路才在过去几年中开始受到深入研究¹⁷。目前，MRGPRX2激活后介导钙离子内流的质膜离子通道仍不明确。因此，本文还重点探讨了由MRGPR激动剂刺激所引发的肥大细胞内钙信号转导及脱颗粒过程。

方案

所有动物实验均按照德国实验动物护理与使用法律法规进行（已由卡尔斯鲁厄地区委员会正式批准）。

1. 腹腔灌洗法分离与培养PMC

1	冰
2	10 mL 注射器
3	27 G 针头
4	20 G 针头
5	泡沫塑料块和固定针
6	收集管（50 mL 塑料离心管）
7	70% 乙醇
8	RPMI 培养基（预冷并置于冰上）
9	PMC 培养基：RPMI 培养基 + 20% FCS（胎牛血清）+ 1% 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）
10	杜尔贝科磷酸盐缓冲液 - DPBS（不含 Ca2+ 和 Mg2+）
11	培养瓶（25 cm）
12	生长因子储备液（IL-3：1 μg/μL；SCF：2.5 μg/mL）
13	血清移液管（10 mL）
14	无菌移液器吸头（20–200 µL）
15	血细胞计数板
16	台式离心机
17	剪刀和镊子
18	小鼠用 CO2 麻醉室
19	开放式无菌操作台
20	封闭式无菌操作台
21	细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2）
22	移液器（20–200 µL）

表1：步骤1所需材料。

1. 通过腹腔灌洗法分离PMC
   1. 在细胞分离前，准备好表1中列出的材料。
   2. 使用8至14周龄的雄性小鼠进行PMC分离。通过吸入CO₂处死小鼠，并通过反射消失确认死亡。用70%乙醇喷洒小鼠，然后用针将其固定在泡沫板上（背侧朝下）。使用钝头剪刀去除小鼠腹部皮肤，注意避免损伤腹腔。
      注意：我们通常将此方案用于C57BL/6N品系遗传背景的小鼠。
   3. 使用配备27 G针头的10 mL注射器，向腹腔内注入7 mL冰冻RPMI培养基和5 mL空气。将针头小心插入腹膜，避免刺穿任何器官。选择附睾脂肪区域作为穿刺点，以降低器官穿孔的风险。
   4. 注射后，轻轻摇晃小鼠1分钟，使腹腔细胞脱落进入RPMI培养基中。不要剧烈摇晃，以免损伤内脏器官并导致血液污染腹腔。
   5. 将10 mL注射器更换为新的20 G套管针。通过倾斜泡沫板并轻轻敲击实验台面，将内脏移向一侧，以便从另一侧更容易吸取液体。插入20 G针头（斜面朝上），缓慢轻柔地抽吸腹部液体（约0.5 mL/s），避免因接触内脏而堵塞针头。尽可能多地收集液体（通常为5–6 mL）。
   6. 从注射器上取下针头，将收集的细胞悬液转移至置于冰上的收集管中。若发现明显血液污染，则弃去该样本管。
   7. 将含有细胞悬液的管子在约300 x g条件下离心5分钟。在无菌操作台中吸除上清液。对每只小鼠的样本，将沉淀物合并于4 mL冷（4–10 °C）PMC培养基中，并将细胞悬液转移至25 cm²培养瓶中。加入生长因子IL-3和SCF，使其终浓度分别为10 ng/mL和30 ng/mL。将含有细胞的培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO₂），培养约48小时，直至进行下一步操作。
2. PMC培养
   1. 第2天（分离后约48小时）：更换培养基
      1. 为去除上清液及非贴壁细胞（红细胞和死细胞），将巴斯德吸管尖端置于培养瓶边缘，将培养瓶几乎水平持握，吸除培养基。按每只小鼠加入4 mL预热的PMC培养基。加入生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL）。将含有细胞的培养瓶放回培养箱（37 °C，5% CO₂）中继续培养。
   2. 第9天：细胞传代
      1. 将细胞悬液从细胞培养瓶转移至50 mL塑料离心管中。用10 mL预热（37 °C）的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤培养瓶三次，每次洗涤液均收集至同一50 mL塑料离心管中，以回收脱落的细胞。使用血细胞计数板测定细胞浓度，并计算细胞总数。
      2. 将细胞悬液在约300 x g条件下离心5分钟，吸除上清液。用预热的PMC培养基（37 °C）重悬沉淀，调整细胞浓度至1 × 10⁶ cells/mL。将细胞悬液转移至新的25 cm²培养瓶中。弃去底部附着有成纤维细胞的旧培养瓶。
      3. 加入生长因子IL-3（10 ng/mL）和SCF（30 ng/mL），将含有细胞的培养瓶置于培养箱中（37 °C，5% CO₂）继续培养。
   3. 第12–15天：细胞检测
      1. 若计划进行FcɛRI受体刺激实验，需在标准培养基中用300 ng/mL抗DNP IgE对细胞进行过夜预处理。随后进行步骤2或步骤3。

2. PMCs 中细胞内游离钙浓度的荧光测定

1. 在测量之前，准备好 表2 中列出的材料。同时，准备一个成像装置，包括：倒置荧光显微镜；物镜：40X/1.3 油镜；Fura 2 滤光片组；CCD 相机；激发光源；图像采集程序；重力驱动的溶液施加系统。

1	PMC（12–15 天龄）1 × 106 个细胞/mL
2	Concanavalin A
3	Fura-2 AM
4	Pluronic F-127 20% 溶液
5	圆形盖玻片；直径 25 mm；1 号
6	DNP-HSA（二硝基苯酚-人血清白蛋白）储备液
7	抗 DNP 抗体（IgE）储备液
8	平底培养板（12 孔）
9	Compound 48/80 储备液
10	Cover Well 成像培养皿
11	血细胞计数板
12	移液器吸头（20–200 µL）

表2：步骤2所需材料。

2. Fura-2成像制备
   1. 使用血细胞计数板进行细胞计数，并将细胞浓度调整至 1 x 10⁶ 细胞/mL。使用1 mL移液枪头轻柔吹打细胞悬液3–5次，以分离PMC集落。
   2. 制备 Ca²⁺含HEPES缓冲盐溶液（Ca²⁺-HBSS，含有 135 mM NaCl、6 mM KCl、2 mM CaCl₂₂，1.2 mM MgCl₂，10 mM HEPES 和 12 mM 葡萄糖。用 3 M NaOH 将 pH 调至 7.4。
   3. 通过移液将1滴刀豆蛋白A溶液（0.1 mg/mL，溶于H₂O）滴加至载玻片表面，制备刀豆蛋白A包被载玻片。₂O）置于无菌操作台中的每个25 mm圆形盖玻片上。让液滴在盖玻片上静置至少1分钟，然后用移液器吸除大部分溶液，并将盖玻片室温晾干45分钟。小心地将经刀豆蛋白A处理的盖玻片压在橡胶成像腔上（参见 材料表）直至其附着，以获得显微成像用培养室。
      注意：可使用多聚-L-赖氨酸包被的载玻片作为替代方案。
   4. 溶解荧光 Ca²⁺ 染料Fura-2 AM（1 mM）溶于二甲基亚砜（DMSO）中。将此溶液避光保存。
   5. 将Fura-2 AM储备液用Ca²⁺-HBSS 中，配制终浓度为 5 µM 的“负载缓冲液”。加入 5 µL/mL 的 20% Pluronic F-127（溶于 DMSO）。
   6. 将500 µL“上样缓冲液”与500 µL PMC细胞悬液混合。用移液器将混合液转移至成像室中，在室温避光条件下孵育20–30分钟。
   7. 根据刺激方案，使用不同溶液设置重力驱动给药系统。向1号注射器中加入40 mL Ca²⁺-HBSS 溶液，注射器 2 含 40 mL Ca²⁺含100 ng/mL DNP的HBSS溶液，3号注射器含40 mL Ca²⁺-HBSS 溶液，含 50 µg/mL Compound 48/80，4 号注射器，40 mL，名义上含 Ca²⁺无钙HBSS溶液，以及含有40 mL名义上无钙的HBSS溶液的注射器5²⁺含2 µM Thapsigargin的无HBSS溶液
   8. 在40倍高数值孔径的油浸物镜上滴加一滴浸油，以备使用。
   9. 将给药系统安装在倒置显微镜的载物台上。将已接种细胞的成像腔室放入给药系统中，并固定以防止记录过程中发生移动。打开透射光，对细胞进行聚焦。
   10. 用不含 Ca²⁺ 的缓冲液冲洗细胞三次²⁺-HBSS 缓冲液，使用重力驱动加样系统。
   11. 将细胞在 Ca²⁺-HBSS 中孵育 5 分钟，以去除 Fura-2 AM 的酯键。
   12. 再次冲洗细胞，以去除任何可能泄漏的荧光染料，然后再开始成像。
3. 细胞成像
   1. 在生理采集模式下启动成像采集程序。打开设置窗口，调节焦距和最佳采集时间（340 nm 和 380 nm 激发时应保持一致，通常为 50–150 ms）。
      注意：尽量减少Fura-2负载细胞暴露于任何光线，以避免染料发生光漂白。
   2. 拍摄参考图片，并将细胞标记为感兴趣区域（ROI）。在无细胞区域标记最后一个ROI，并将其定义为背景。
   3. 完成设置后，以5秒的采样速率开始测量。
      注意：细胞将依次用340 nm和380 nm的激发光照射，并采集其发射荧光（>使用CCD相机采集510 nm的荧光信号。F340 nm和F380 nm的荧光信号图像以及比值（F340 nm/F380 nm）将在三个窗口中显示。各感兴趣区域（ROIs）荧光强度平均值的时间进程曲线也将持续实时显示。
   4. 根据实验设计，在适当的循环数添加溶液：
      1. 测量抗原诱导的[Ca²⁺]_i，如图所示 图2A，2B在第20个循环后加入注射器2中的溶液，第150个循环后停止记录。
      2. 测量由Compound 48/80诱导的[Ca²⁺]_i,，如图所示 图2C在第20个循环后加入注射器3中的溶液，第150个循环后停止记录。
      3. 为了测量[Ca²⁺]_i 由SOCE诱发，如图所示 图2D在第10个循环后加入注射器4中的溶液，第70个循环后加入注射器5中的溶液，第120个循环后加入注射器4中的溶液，第150个循环后加入注射器1中的溶液，第220个循环后停止记录。
   5. 测量结束后，将结果转换为包含两个激发波长下各感兴趣区域（ROI）及每个测量时间点的实测强度比值表，该表需包括经背景校正和未经背景校正的强度值，以及相应的经背景校正和未经背景校正的比值。在采集程序中依次点击按钮：“start cutter”、“mark all”、“convert all”、“physiology measurements”、“Ok”、“Ok”。将文件保存为表格和图像堆栈，用于离线分析。

3. 肥大细胞中β-己糖胺酶释放量的测定

1	PMC（12–15 天龄）1 × 106 个细胞/mL
2	抗 DNP 抗体（IgE）储备液
3	DNP-HSA 储备液
4	化合物 48/80 储备液
5	离子霉素
6	96 孔板，V 形底
7	96 孔板，平底
8	塑料离心管（15 mL）
9	血清移液管
10	细胞培养箱（37 °C 和 5% CO2）
11	台式离心机
12	用于光密度测定的酶标仪
13	多通道移液器（20–200 μL）
14	血细胞计数板

表3：步骤3所需材料。

1. 测量前，准备好 表3 中列出的材料。
   注意：肥大细胞（MCs）受到刺激后释放的 β-己糖胺酶可将对硝基苯基-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺（pNAG）水解为对硝基苯酚和N-乙酰-D-葡萄糖胺。样品中β-己糖胺酶的量与生成的对硝基苯酚的量成正比。在“终止液”的高pH环境中，对硝基苯酚以完全去质子化的对硝基苯酚根形式存在，可通过其在405 nm处的光吸收进行检测。
2. 配制含有130 mM NaCl、5 mM KCl、1.4 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、5.6 mM葡萄糖和0.1% BSA的Tyrode溶液。用3 M NaOH将pH值调节至7.4。
3. 通过向Tyrode溶液中加入终浓度为1%体积的Triton X-100来制备裂解液。
4. 配制由200 mM甘氨酸组成的终止液，并用NaOH将pH值调节至10.7。
5. 将pNAG溶解于0.4 M柠檬酸中，配制成终浓度为4 mM的pNAG溶液（4-硝基苯基-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷）。
6. 计算实验所需的细胞数量（实验需设复孔）。每孔使用200,000个PMC。每种基因型设置2孔作为阴性对照（不含任何分泌刺激剂如DNP或化合物48/80的Tyrode溶液），另设2孔作为阳性对照（含10 µM离子霉素的Tyrode溶液）。
7. 将细胞转移至15 mL塑料离心管中，用Tyrode溶液定容至15 mL，于200 × g 离心4分钟。用巴斯德吸管吸除上清液，并将细胞重悬于Tyrode溶液中，调整浓度至2 × 10⁶ 个细胞/mL。
8. 将100 µL细胞悬液加入96孔V型底板的每孔中。向各孔加入25 µL刺激液或对照液（根据 图3A 所示加样方案）。将细胞在37 °C、5% CO₂ 条件下孵育45分钟。
9. 将96孔板置于冰上5分钟以终止反应，随后在4 °C下以120 × g 离心4分钟。使用多通道移液器将120 µL上清液转移至平底96孔板中，并置于冰上。操作时应小心避免触碰细胞沉淀，但需完全吸走上清液。
10. 向细胞沉淀中加入125 µL裂解缓冲液。室温孵育5分钟后，通过反复吹打（约5次）使沉淀充分重悬。
11. 在新的平底96孔板中，向所需孔中加入25 µL pNAG溶液（4 mM）。再分别向每孔中加入25 µL上清液和25 µL相应的细胞裂解液。
12. 将反应体系在37 °C孵育1小时。孵育结束后，向每孔加入150 µL终止液以终止反应。
13. 使用酶标仪在405 nm波长下进行检测，参考波长设为630 nm，以实现自动背景扣除。在采集程序中勾选“参考”选项，并在“吸光度”程序元素菜单中从下拉列表选择“630 nm”。若样品的光密度值过高，应在重新测量前对样本进行适当稀释。
14. 根据以下公式计算β-己糖胺酶释放百分比：
    
    其中，释放率 [%] 表示特异性β-己糖胺酶的释放百分比，A[上清液] 为经背景校正后的上清液吸光度，A[裂解液] 为对应细胞裂解液经背景校正后的吸光度。

结果

通过腹腔灌洗法从3只野生型小鼠（C57BL/6N）中分离出肥大细胞前体（PMCs），并在补充有20%胎牛血清（FCS）、1%青霉素-链霉素以及生长因子（含10 ng/mL IL-3和30 ng/mL SCF）的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO₂的无菌湿润环境中进一步培养。在细胞分离后的第2天和第9天更换培养基。使用透射光微分干涉差（DIC）成像技术分析细胞形态（见图1A, B）。细胞对比度和颗粒性显示细胞活力良好。在此条件下培养2周后，获得数量为1.5 × 10⁷的均一细胞群体。对细胞进行FITC标记的抗IgE抗体和PE标记的抗c-Kit抗体共染色后，流式细胞术分析显示，98.6%的细胞为FITC阳性，99.8%的细胞为PE阳性（图1C）。98.5%的培养细胞同时表达FITC和PE双阳性（图1...

讨论

肥大细胞（MC）模型可成功用于研究肥大细胞脱颗粒、趋化、黏附，以及阐明参与肥大细胞活化的细胞内信号转导通路。一些研究人员使用人源肥大细胞模型，例如永生化细胞系（LAD2 和 HMC1），或来源于脐带血前体细胞（CD133+）及外周血前体细胞（CD34+）的人肥大细胞。另一些研究人员则偏好啮齿类动物肥大细胞模型，例如永生化细胞系（大鼠嗜碱性白血病细胞 RBL-2H3 肥大细胞系）或原代培养模型（小鼠骨髓来源肥大细胞 BMMCs、腹腔来源肥大细胞 PMCs）。小鼠原代肥大细胞可用于分析多种"基因敲除"小鼠模型中的肥大细胞功能，这是探索特定基因及其编码蛋白生理功能的金标准方法。由于目前缺乏具有足够选择性和效力的药理学工具，该方法在研究肥大细胞活化过程中信号转导机制方面尤为宝贵¹⁸。小鼠 PMCs 属于结缔组织表型，具有成熟的形态和高度颗粒化特征。它们不仅像 BMMCs 一样对 FcεRI 的抗原交联反应良好，还可被内皮素-1 或化合物 48 等多种其他受体激动剂激活。然而，PMCs 的产量通常显著低于 BMMCs，通常不足以进行 Western 印迹或其他需要大量细胞的技术操作。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 培养基	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
刀豆蛋白 A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
抗 DNP 抗体	Sigma-Aldrich	D-8406
青霉素-链霉素溶液（Penstrep）	Thermo Scientific	15140122
化合物 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇	Sigma-Aldrich	X100
4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell 成像腔室	Sigma-Aldrich	GBL635051
96 孔板，V 型底	Corning	3896
96 孔板，平底	Greiner Bio-One	655180
配备 "i-control" 软件的微孔板读板仪	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
平底板	Greiner Bio-One	655180
离子霉素	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL 塑料离心管	Sarstedt	62.547.254
培养瓶（25 cm²）	Greiner Bio-One	69160
圆形盖玻片；ø 25 mm；No. 1	Menzel	CB00250RA1
血细胞计数板	VWR	631-0696
倒置显微镜	Zeiss	Observer Z1
Fluar 40x/1.3 油镜物镜	Zeiss	440260-9900
HC Fura 2 滤光片组	AHF	H76-521
CCD 相机	Zeiss	AxioCam MRm
单色光源系统	Sutter Instruments	Lambda DG-4
成像采集程序	Zeiss	AxioVision 4.8.2
重力供液溶液施加系统	定制	4 通道
15 mL 塑料离心管	Sarstedt	62,554,502
台式离心机	Heraeus	Megafuge 1.0R