腹膜来源肥大细胞的分离及其通过Ca2+-成像与脱颗粒实验进行的功能表征

摘要

本文介绍了一种分离和培养小鼠腹腔肥大细胞的实验方案。同时，我们还描述了两种用于其功能表征的方法：一种是通过荧光成像检测细胞内游离Ca²⁺浓度的变化，另一种是基于比色法定量释放的β-己糖胺酶来评估脱颗粒反应的实验方法。

摘要

肥大细胞（MCs）作为免疫系统的一部分，在抵御多种病原体以及启动过敏免疫反应中发挥关键作用。通过高亲和力IgE受体（FcεRI）与表面结合的IgE发生交联，以及其他多个受体的刺激，可激活肥大细胞，引发细胞内游离Ca²⁺水平（[Ca²⁺]_i）升高，从而促进炎症和过敏介质的释放。鉴定参与这些信号通路的分子组分，对于理解肥大细胞功能的调控机制至关重要。本文描述了一种通过腹腔灌洗分离小鼠结缔组织型肥大细胞并培养腹腔肥大细胞（PMCs）的实验方案。利用该方法培养来自不同基因敲除小鼠模型的肥大细胞，是鉴定参与肥大细胞信号通路蛋白的有效途径。此外，我们还介绍了一种单细胞Fura-2成像技术的实验方案，该技术是定量检测肥大细胞中Ca²⁺信号的重要方法。基于荧光的[Ca²⁺]_i监测是一种可靠且常用的技术，可用于研究包括钙库操纵性钙内流在内的Ca²⁺信号事件，后者对肥大细胞的活化尤为重要。在肥大细胞脱颗粒分析方面，我们描述了一种β-己糖苷酶释放检测法。释放到培养基中的β-己糖苷酶含量被视为肥大细胞中三种不同分泌亚群的脱颗粒标志物。通过微孔板比色法，利用显色底物与β-己糖苷酶发生反应，可方便地定量检测其含量。该技术高度可重复、成本低廉，且无需特殊设备。总体而言，本方案可获得高产量的肥大细胞，这些细胞表达典型的肥大细胞表面标志物，具有典型的形态学和表型特征，并在Ca²⁺成像和脱颗粒实验中对分泌刺激剂表现出高度可重复的反应。

引言

肥大细胞（MCs）在先天性和获得性免疫反应中发挥重要作用。具体而言，肥大细胞参与杀灭病原体（如细菌和寄生虫），并可降解潜在的有毒内源性肽或毒液成分（综述见Galli et al. 2008¹）。肥大细胞在先天免疫和适应性免疫中的生理功能目前仍存在激烈争论。因此，针对不同肥大细胞缺陷型小鼠模型的研究中出现的大量数据差异，迫切需要对肥大细胞在过敏反应之外的免疫学功能进行系统性重新评估²。成熟的肥大细胞主要定位于皮肤、肺和肠道等组织和器官中，通常在血液中仅少量存在。肥大细胞起源于造血前体细胞（如肥大细胞祖细胞），并在几乎所有血管化组织的微环境中完成其分化和成熟过程¹。T细胞来源的因子白细胞介素（IL）-3可选择性促进小鼠多能性肥大细胞群体从其造血祖细胞存活、增殖和分化³。干细胞因子（SCF）由组织中的结构细胞产生，在肥大细胞的发育、存活、迁移和功能中起关键作用⁴。单个肥大细胞的特性可能因其合成和储存不同蛋白酶或蛋白聚糖的能力而有所差异。在小鼠中，根据解剖定位、形态以及肝素和蛋白酶含量的不同，可将所谓的结缔组织型肥大细胞与黏膜型肥大细胞区分开来⁵。

在肥大细胞中，游离胞质Ca²⁺浓度....

方案

所有动物实验均按照德国关于实验动物护理和使用的法律法规进行（已由卡尔斯鲁厄地区委员会正式批准）。

1. 腹腔灌洗法分离与培养PMC

....

1	冰
2	10 mL 注射器
3	27 G 针头
4	20 G 针头
5	泡沫塑料块和固定针
6	收集管（50 mL 塑料离心管）
7	70% 乙醇
8	RPMI 培养基（预冷并置于冰上）
9	PMC 培养基：RPMI 培养基 + 20% FCS（胎牛血清）+ 1% 青霉素-链霉素溶液（Pen-Strep）
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结果

通过腹腔灌洗法从3只野生型小鼠（C57BL/6N）中分离出肥大细胞（PMCs），并在补充有20% FCS和1%青霉素-链霉素、并添加生长因子（含10 ng/mL IL-3和30 ng/mL SCF）的RPMI培养基中，于37 °C、5% CO₂的无菌湿润条件下继续培养。在细胞分离后的第2天和第9天更换培养基。采用透射光DIC成像技术分析细胞形态（见图1A, B）。细胞对比度和颗粒性显示细胞活力良好。在此条件下培养2周后，获得数量为1.5 × 10⁷的均一细胞群体。对细胞进行FITC标记的抗IgE抗体和PE标记的抗c-Kit抗体共染色后，流式细胞术分析显示，98.6%的细胞为FITC阳性，99.8%的细胞为PE阳性（图1C）。98.5%的培养细胞同时表达FITC和PE（图1

讨论

肥大细胞（MC）模型可成功用于研究肥大细胞脱颗粒、趋化性、黏附性，以及阐明参与肥大细胞活化的细胞内信号转导通路。一些研究人员使用人源肥大细胞模型，例如永生化细胞系（LAD2 和 HMC1）或来源于脐带血前体细胞（CD133+）及外周血前体细胞（CD34+）的人肥大细胞。另一些研究人员则偏好啮齿类动物肥大细胞模型，例如永生化细胞系（大鼠嗜碱性白血病 RBL-2H3 肥大细胞系）或原代培养模型（小鼠骨髓来源肥大细胞 BMMCs、腹腔来源肥大细胞 PMCs）。小鼠原代肥大细胞可用于分析多种"基因敲除"小鼠模型中的肥大细胞功能，这是探索特定基因及其编码蛋白生理功能的金标准方法。由于缺乏具有足够选择性和效力的药理学工具，该方法在研究肥大细胞活化过程中信号转导机制方面尤为有价值¹⁸。小鼠 PMCs 具有结缔组织表型，表现出成熟形态和高度颗粒化。它们不仅像 BMMCs 一样对 FcεRI 的抗原交联反应良好，还可被内皮素 1 或化合物 48 等多种其他受体激动剂激活。然而，PMCs 的产量通常显著低于 BMMCs，通常不足以进行 Western 印迹或其他需要大量细胞的技术操作。已有多种.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 培养基	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
刀豆蛋白 A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
抗 DNP 抗体	Sigma-Aldrich	D-8406
青霉素-链霉素溶液（Penstrep）	Thermo Scientific	15140122
化合物 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基-聚乙二醇	Sigma-Aldrich	X100
4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell 成像腔室	Sigma-Aldrich	GBL635051
96 孔板，V 型底	Corning	3896
96 孔板，平底	Greiner Bio-One	655180
配备 "i-control" 软件 的酶标仪	Tecan	Nano Quant, infinite M200 Pro
平底板	Greiner Bio-One	655180
离子霉素	Sigma-Aldrich	I9657
50 mL 塑料离心管	Sarstedt	62.547.254
培养瓶（25 cm²）	Greiner Bio-One	69160
圆形盖玻片；ø 25 mm；No. 1	Menzel	CB00250RA1
血细胞计数板	VWR	631-0696
倒置显微镜	Zeiss	Observer Z1
Fluar 40x/1.3 油镜物镜	Zeiss	440260-9900
HC Fura 2 滤光片组	AHF	H76-521
CCD 相机	Zeiss	AxioCam MRm
单色光源系统	Sutter Instruments	Lambda DG-4
成像采集程序	Zeiss	AxioVision 4.8.2
重力供液式溶液施加系统	定制	4 通道
15 mL 塑料离心管	Sarstedt	62,554,502
台式离心机	Heraeus	Megafuge 1.0R