腹膜源性肥大细胞的分离及其功能特征的 Ca2 +成像和脱粒测定

Volodymyr Tsvilovskyy; Alejandra Solis-Lopez; Kathrin Öhlenschläger; Marc Freichel

doi:10.3791/57222

方法文章

腹膜源性肥大细胞的分离及其功能特征的 Ca^{2 +}成像和脱粒测定

DOI：

10.3791/57222

⸱

2018年7月4日

Volodymyr Tsvilovskyy¹ , Alejandra Solis-Lopez¹ , Kathrin Öhlenschläger¹ , Marc Freichel¹

¹Institute of Pharmacology, Ruprecht-Karls Heidelberg University

本文内容

摘要

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在这里, 我们提出了一个隔离和培养小鼠腹膜肥大细胞的协议。我们还描述了两个协议的功能表征: 一个荧光成像的细胞内游离 Ca^{2 +}浓度和脱粒检测的基础上的色度量化的释放β-hexosaminidase。

摘要

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肥大细胞 (MCs) 作为免疫系统的一部分, 在保护宿主抵抗几种病原体和引发过敏性免疫应答方面起着关键作用。通过将表面 IgE 与高亲和 IgE 受体 (FcεRI) 的交联, 以及通过其他几种受体的刺激, 激活 MCs, 启动了游离胞内 Ca^{2 +}级 ([Ca^{2 +}]_i) 的上升。这促进了炎症和过敏介质的释放。这些信号通路中所涉及的分子成分的识别对于理解 MC 函数的调节是至关重要的。本文介绍了一种通过腹腔灌洗和腹腔 MCs 培养分离小鼠结缔组织型 mcs 的协议。采用这种方法对各种击倒小鼠模型的 MCs 进行培养, 是鉴别 MC 信号通路所涉及蛋白质的一种有用方法。此外, 我们还描述了一个单细胞 Fura-2 成像协议, 作为一个重要的技术, 以量化的 Ca^{2 +}信号在 MCs. 基于荧光的监测 [ca^{2 +}]_我是一个可靠和常用的方法来研究 Ca^{2 +}信号事件, 包括存储操作的钙进入, 这是至关重要的 MC 激活。对于 MC 脱粒的分析, 我们描述了β hexosaminidase 释放试验。将β-hexosaminidase 释放到培养基中的量被认为是 MCs 中描述的所有三种不同分泌亚群的脱粒标记. β-hexosaminidase 可以很容易地被量化的反应与 colorigenic 基板在微量滴定板比色法。这种高度可重复的技术具有成本效益, 不需要专门的设备。总体而言, 所提供的协议表明了一个高产量的 mcs 表达典型的 MC 表面标记, 显示典型的形态和表型特征的 mcs, 并表明高重现性反应 secretagogues 在 Ca^{2 +}-影像学和脱粒化验。

引言

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MCs 在先天和后天免疫应答中起着突出的作用。具体地说, MCs 参与杀害病原体, 如细菌和寄生虫, 并降低潜在的有毒内源性肽或毒液成分 (审查见加利等2008¹)。MCs 在先天和适应性免疫中的生理作用是激烈争论的主题。因此, 在不同的 MC 缺陷小鼠模型的研究中, 大量的数据差异需要对²过敏后的 MCs 免疫功能进行系统的重新评估。成熟的 MCs 大多是局部的组织和器官, 如皮肤, 肺和肠道, 通常只在少量的血液中发现。MCs 来源于造血前体, 如 MC 祖细胞, 在几乎所有血管化组织的微环境中完成它们的分化和成熟¹。T 细胞衍生因子白细胞介素 (IL)-3 有选择地促进小鼠 MCs 的多能种群的生存能力, 增殖和分化从他们的造血祖父母³。干细胞因子 (超临界) 是由组织中的结构细胞产生的, 在 MC 的发展、生存、迁移和功能⁴中起着至关重要的作用。单个 MCs 的性质可能因其合成和贮存各种蛋白酶或软骨的能力而异。在小鼠中, 根据肝素和蛋白酶⁵的解剖定位、形态学和含量, 将所谓的结缔组织型 mcs 与黏膜 mcs 区别开来。

在 MCs 中, 增加游离胞浆 Ca^....

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方案

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所有动物规程根据德国立法指南被执行了对实验室动物的关心和用途 (正式地批准由卡尔斯鲁厄区域理事会)。

1. 经腹腔灌洗的 PMC 分离和培养

1	冰
2	10毫升注射器
3	27克针
4	20克针
5	泡沫塑料块和别针
6	收集管 (50 毫升塑料离心管)
7	70% 乙醇
8	RPMI 介质 (预冷和保持在冰上)
9	PMC 培养基: RPMI 中等 + 20% FCS (胎小牛血清) + 1% 青霉素链霉素溶液 (笔链球菌)
10	Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 DPBS (没有钙^{2 +}和镁^{2 +<....}

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结果

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在无菌湿润条件下, 经腹腔灌洗并进一步培养 RPMI 培养基中的3种野生小鼠 (C57BL/6N), 在生长因子 (IL-3 10 ng/毫升和 30 ng/毫升) 的情况下, 对其进行了进一步养殖。37°c 和 5% CO₂。媒介在天2和9被改变了在细胞隔离以后。用透射光 DIC 成像 (见图 1A, B) 对细胞形态学进行分析。细胞的对比度和粒度表现出良好的细胞活力。在这些条件下培养2周后, 获得了 1.5 x 10⁷细胞的均匀种群。用 FITC 和抗 c-试剂盒抗体结合 pe 结合抗 IgE 抗体的细胞进行流式细胞分析, 揭示了98.6% 的 FITC 阳性和99.8% 阳性细胞 (图 1c)。98.5% 的培养细胞为 FITC 和 PE 的双阳性 (图 1C

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讨论

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mc 模型可以成功地用于研究 mc 脱粒, 趋化性, 黏附性, 以及阐明细胞内信号传导通路参与 mc 激活。一些研究人员使用人体 mcs 模型, 如永生化的线 (LAD2 和 HMC1) 或由脐血祖细胞 (CD133+) 和外周血祖细胞 (CD34+) 所衍生的人 mcs。其他人更喜欢啮齿动物 MC 模型, 如永生化 (大鼠嗜碱性颗粒白血病 RBL-2H3 MC 线) 或初级培养 (小鼠骨髓源性 MCs BMMCs, 局) 模型。小鼠原发性 MCs 可用于分析多种 "敲出" 老鼠模型中的 MC 功能, 这是探索特定基因和编码蛋白生理功能的黄金标准方法。由于缺乏足够的选择性和有效性的药理工具, 这一方法对于研究 MC 激活¹⁸的信号传导机制特别有价值。小鼠局是结缔组织表型, 呈现成熟的形态学和高粒度。它们不仅对 FcεRI 类似 BMMCs 的抗原交联反应良好, 而且还由几种附加受体的激动剂激活, 如内皮素1或复方48。然而, 与 BMMCs 相比, 临时市政局的收益率通常明显较低, 通常不足以执行西方污点或其他需要大量细胞的技术。本文介绍了几种分离纯化的方法。例如, Percoll 梯度离.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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作者想确认朱莉娅 Geminn 在肥大细胞的制备和培养方面的技术援助。这项工作得到了跨区协作研究中心 (SFB) 152 的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号
RPMI 培养基	Thermo Scientific	21875034
DPBS	Sigma-Aldrich	14190144
FCS	Thermo Scientific	R92157
IL-3	R&D Systems	403-ML
SCF	Thermo Scientific	PMC2115
伴刀豆球蛋白 A	Sigma-Aldrich	C2272
Fura-2 AM	Thermo Fischer Scientific	F1221
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
DNP-HSA	Sigma-Aldrich	A6661
抗 DNP 抗体	Sigma-Aldrich	D-8406
Penstrep	Thermo Scientific	15140122
化合物 48/80	Sigma-Aldrich	C2313
4-（1,1,3,3-四甲基丁基）苯基-聚乙二醇	Sigma-Aldrich	X100
4-硝基苯基 2-乙酰氨基-2-脱氧-β;-D-吡喃葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N9376
CoverWell 成像室	Sigma-Aldrich	GBL635051
96孔板，V形底部	康宁	3896
96 孔板，平底	Greiner Bio-One	655180
微量滴定板读数仪，带"i-control"软件	Tecan	Nano Quant， infinite M200 Pro
平底板	Greiner Bio-One	655180
霉素	Sigma-Aldrich	I9657
50毫升塑料离心管	Sarstedt	62.547.254
培养瓶（25 cm）	Greiner Bio-One	69160
盖玻片玻璃杯圆形;ø 25 mm;No. 1	Menzel	CB00250RA1
血细胞计数器	VWR	631-0696
倒置显微镜	蔡司	观察者Z1
Objectiv Fluar 40x/1.3油	蔡司	440260-9900
HC滤镜套装 Fura 2	AHF	H76-521
CCD相机	蔡司	AxioCam MRm：
单色光源	Sutter Instruments	Lambda DG-4
成像采集程序	Zeiss	AxioVision 4.8.2
重力进料溶液应用系统	定制	4 通道
15 mL 塑料离心管	Sarstedt	62,554,502
台式离心机	Heraeus	Megafuge 1.0R

离子

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated ce....

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