结合光遗传学与人工微小RNA技术在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响

摘要

本方案提供了一种工作流程，介绍如何将人工微小RNA介导的RNA干扰与光遗传学技术相结合，以特异性刺激完整神经环路中选择性基因表达降低的突触前终末。

摘要

本实验方案旨在表征基因敲低对完整神经环路中突触前功能的影响。我们介绍了一种将人工微小RNA（miR）介导的RNA干扰技术与光遗传学相结合的工作流程，以实现对急性脑片中经遗传操作的突触前终末进行选择性光刺激。该实验方法采用单一病毒载体和单一神经元特异性启动子，驱动光遗传学探针及针对突触前基因的人工miR共同表达。当该载体通过立体定位注射至目标脑区后，可在活体组织中特异性地仅对目的基因表达水平降低的神经元进行光刺激。该策略无需构建和维持转基因小鼠品系，原则上可应用于其他生物体系以及任意选定的神经元基因。我们近期已将该方法用于研究突触前P/Q型电压门控钙通道（VGCCs）不同剪接异构体的敲低如何调控急性海马脑片中CA3至CA1兴奋性突触的短时程突触可塑性。类似方法亦可用于操控和探究神经环路功能 关键词：基因敲低，人工miR，RNA干扰，光遗传学，突触前功能，急性脑片，病毒载体，神经环路，电压门控钙通道，剪接异构体，短时程突触可塑性，CA3-CA1突触 体内.

引言

本方案描述了一种新方法，用于在完整神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响。在完整神经环路中研究突触前功能具有挑战性，因为许多突触前终扣体积过小且远离胞体，难以同时进行分子和电生理干预。尽管RNA干扰提供了一种强大且灵活的手段来敲低突触蛋白¹，但该方法极少被用于研究突触前功能，原因是传统电刺激难以检测敲低效应，无法区分经过操作与未经操作的突触前终扣²。本文中，我们介绍如何将人工微小RNA（miR）介导的RNA干扰与近期发展的光遗传学技术相结合，以实现对急性脑片中经过操作的突触前终扣进行选择性刺激。

虽然条件性基因敲除小鼠结合电生理学技术也可用于研究突触前蛋白的功能^3,4，但我们的策略无需建立和维持基因修饰小鼠品系，且可轻松用于敲低基因的特定亚型。与更常用的短发夹RNA（shRNA）相比，本研究采用的人工miR在神经元敲低中具有关键优势。与shRNA不同，人工miR可在RNA聚合酶II启动子的控制下表达¹。因此，可利用单一启动子同时驱动miR、光遗传学探针以及荧光报告基因的表达。通过这种方式，可将整个构建体的大小控制在重组腺相关病毒（rAAV）的包装容量之内（图1A）。此外，使用单一构建体和单一启动子可减少实验变异性，因为它能够以固定比例共表达miR、光遗传学探针和荧光报告基因。

我们最近应用该技术研究了海马体中突触前钙通道选择性剪接异构体的作用⁵。这一策略通常适用于研究任何感兴趣脑回路中其他突触前表达蛋白的生理相关性。

方案

所有实验均按照欧洲共同体理事会（2014年3月4日第2010/63/EU号指令）制定的指南进行，并获得了意大利卫生部的批准。

1. 用于RNA干扰的microRNA设计及其在异源表达系统中效率的评估

注意：本实验方案需要掌握以下已确立的方法：分子克隆、DNA测序、细胞系的培养、磷酸钙转染、定量实时PCR（qRT-PCR）、细胞系裂解液的制备以及蛋白质印迹（Western blotting）。

1. 确定目的基因是否发生可变剪接。若需对该基因进行普遍敲低，应选择仅存在于组成型剪接外显子中的序列；若需特异性敲低某一可变剪接异构体，则应选择相应的可变剪接外显子。
2. 使用专用软件（例如 https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）设计针对目的序列的人工miR，用于RNA干扰。
   注意：必须使用基础局部比对搜索工具（BLAST）在同一物种内检测可能的脱靶位点。
3. 选择针对目标基因排名前三的miR。
4. 从合适的公司订购所选miR的上链和下链。对于阴性对照，使用所选miR之一的随机序列版本，或使用预测不靶向实验所用物种任何已知基因的miR。例如对于脊椎动物基因，使用pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg中含有的miR。
5. 将选定的miR上下游链退火，并克隆至专用于miR表达的质粒中（例如 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR）采用标准克隆策略。
   注意：目的是构建一个miR表达盒，该表达盒包含5' miR侧翼区、选定的miR序列以及3' miR侧翼区，可在RNA聚合酶II型启动子的调控下，从报告基因3'非翻译区（3' UTR）进行表达。
6. 使用DNA测序验证所选miR的正确插入。
7. 在加湿的细胞培养箱中培养 HEK293 细胞（37 ℃） °C，5% CO₂使用添加了10%胎牛血清、1 mM NaPyruvate、10 mM HEPES（pH 7.39）和1×青霉素/链霉素（Pen/Strep）的DMEM培养基。
8. 当 HEK293 细胞融合度达到约 70% 时，使用磷酸钙法以 1:1 的 DNA 比例共转染各 miR 表达载体和表达靶基因的载体⁶包括以下对照：（i）未转染的细胞，（ii）转染了表达靶基因的载体以及载体DNA的细胞例如 pBluescript II SK(+) 或 (iii) miR 对照。
   注意：（i）所表达的目标基因必须来自设计miR所针对的同一物种，除非在两种物种间，miR所靶向的序列在核苷酸水平上完全保守；（ii）可使用除HEK293以外的其他细胞系；（iii）可采用其他转染方法，如电穿孔或基于脂质体的方法。
9. 转染48小时后，裂解细胞，进行蛋白质凝胶电泳，执行Western blot，并使用识别目标蛋白的抗体分析蛋白含量。目标为实现≥50%的基因敲低效率。
   注意：敲低效率也可或另可（i）通过ELISA分析，（ii）在适用情况下通过测定目标蛋白的活性来评估例如 离子通道的电流密度）或（iii）在缺乏合适抗体时，通过qRT-PCR在mRNA水平进行检测（实验步骤3）。
   1. 将培养皿置于冰上，用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞一次。
   2. 吸弃 PBS，然后加入冰浴的 RIPA 缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4，150 mM NaCl，2 mM EDTA，1% NP40，0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS），含蛋白酶和磷酸酶抑制剂；每皿加入 1 mL） Ø 100 毫米，每皿 0.5 毫升 Ø 60 mm
   3. 使用细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，并轻柔地将细胞悬液转移至预冷的微量离心管中。
   4. 在4℃下以15,000 × g离心15分钟 °C，将上清液转移至新的预冷微量离心管中，弃去沉淀。
   5. 使用BCA蛋白检测试剂盒或其他合适方法测定蛋白浓度（例如 Bradford 法
      注意：样品可在 -20 °C 冻存，也可立即进行后续处理。 °C 或 -80 °C 以备后续使用，或立即进行处理。
   6. 将适量的裂解液转移至微量离心管中，使所有样品的蛋白浓度相同，并加入足量的预冷裂解缓冲液，使所有裂解液的体积一致。
      注意：30 至 50 µ对于大多数蛋白质而言，上样量为总蛋白的克级通常已足够，但具体上样量应根据目标蛋白的丰度进行优化确定。
   7. 加入适量的2x Laemmli缓冲液（4% SDS，10% 2-巯基乙醇，20% 甘油，0.004% 溴酚蓝，0.125 M Tris-HCl，pH 6.8），于95℃煮沸样品 °5 分钟内升至 C。
   8. 将样品与分子量标记物一同上样至丙烯酰胺凝胶中，在100 V条件下电泳运行1–2小时。
      注意：凝胶浓度取决于目标蛋白的大小。
   9. 将转膜三明治结构组装好，于100 V电压下电转2小时，将凝胶中的蛋白质转移至膜上。膜可选用硝酸纤维素膜或PVDF膜。若使用PVDF膜，需先用甲醇活化1分钟，再用转膜缓冲液冲洗，然后进行转膜夹层的制备。
   10. 使用封闭缓冲液（含5%脱脂奶粉的PBST（PBS + 0.1% Tween-20））在室温下封闭膜1小时，随后在4℃下用一抗溶液孵育膜过夜 °用封闭缓冲液稀释的一抗在 4°C 下孵育过夜。
   11. 用 PBST 洗涤膜 10 分钟，重复三次，然后在封闭缓冲液中加入 HRP 标记的二抗，室温孵育 1 小时。
   12. 用 PBS 洗涤膜 10 分钟，重复四次，然后将化学发光底物加至膜上，并使用基于 CCD 相机的成像系统捕获化学发光信号。
   13. 使用图像分析软件量化敲低效率。
10. 选择两个靶向非重叠序列且效率最高的miR，用于后续功能实验。
    注意：对于任何 miR，脱靶效应都无法完全排除。然而，若两个独立的 miR 产生相似的效应，则该效应由相同的脱靶敲低所致的可能性极低。
11. 如果所选miRs的敲低效率不理想（<50%），筛选其他miR。或者，将效率最高的miR(s)串联表达， 即 从同一表达盒中多拷贝表达，这可能会提高基因沉默效率⁷.

2. 用于光遗传学探针和microRNA联合表达的重组腺相关病毒载体的构建

注意：本方案需要掌握以下已确立的方法：分子克隆、DNA测序和重组腺相关病毒（rAAV）生产。

1. 将每个最有效的miR表达盒克隆至用于重组rAAV生产及兴奋性光遗传探针表达的载体3'非翻译区（3'UTR）中，例如pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X（图1A），其中神经元特异性突触素启动子（synapsin promoter）驱动超快通道视紫红质ChETA、红色荧光报告蛋白TdTomato以及插入于NheI和EcoRI位点之间的miR(s)的表达⁵。
   注意：(i) 不得超过rAAV的包装容量限制，即从ITR（反向末端重复序列）到ITR的长度约为4.7 Kb（图1A，橙色部分）。(ii) miR表达盒必须插入终止密码子与WPRE（土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件；图1A）之间。(iii) 包含荧光蛋白（如TdTomato）极为有用，因其可便于监测感染的定位与强度（实验步骤4）。
2. 通过DNA测序验证miR表达盒的正确插入。
3. 根据已发表的方案⁸生产和测定rAAV1/2的滴度，每种选定的miR分别制备一种rAAV1/2。针对单个基因敲低的典型实验应包括两个针对同一基因的独立miR以及一个miR对照。目标病毒滴度应达到≥10⁹ 病毒基因组（vg）/µL。
   警告：rAAV必须在生物安全等级1级（BSL-1）设施中操作。请咨询所在机构的生物安全委员会以获取详细信息。
   注意：若实验室不具备病毒生产设施，或病毒滴度不理想，可将rAAV生产外包。例如，访问 https://www.med.upenn.edu/gtp/vectorcore/ 或 https://vcf.charite.de/en/metas/。

3. 通过qRT-PCR评估内源基因miR敲低效率的原代神经元培养物RNA提取

注意：（i）本实验方案需要掌握以下已建立的方法：原代神经元培养物的制备与维护，以及定量逆转录 PCR（qRT-PCR）。（ii）敲低效率的定量分析（步骤 3.1–3.14）应至少重复 3 次（生物学重复）。（iii）当无法进行蛋白质含量分析时（例如敲低那些缺乏特异性抗体的可变剪接异构体），可通过 qRT-PCR 在 mRNA 水平上评估敲低效率⁵。

1. 从目标脑区制备原代神经元培养。参照先前发表文献中所述的皮层培养方案进行操作⁹，作如下修改：
   1. 以每孔500,000个神经元的密度将神经元接种于6孔板中。每孔加入2.5 mL贴壁培养基和3.3 mL维持培养基。
   2. 若观察到星形胶质细胞过度生长，向每孔加入 0.5 mL 维持培养基，并补充 7.5 µ胞嘧啶的M β-D-阿拉伯呋喃糖苷（终浓度为1） µM）于第3–4天 体外 (DIV)
2. 每个 miR 感染三个孔（技术重复）于 5–6 天体外培养。使用能够感染 ≥99% 神经元的最低感染剂量。
   1. 从每个孔中移除 2 mL 培养基，并收集至 50 mL 离心管中。
   2. 将病毒直接加入神经元中，轻轻混匀，然后将培养板放回37℃培养箱中 °C.
   3. 将收集的培养基放回培养箱中。松开离心管的管盖，以允许气体平衡。
   4. 24小时后，将移除的培养基重新加回每个孔中（1.9 mL/孔）。
3. 17时–18 天体外培养（DIV），裂解神经元以提取 RNA。
   警告：裂解试剂和氯仿具有高毒性。请在化学通风橱中操作，并穿戴防护装备；废弃物应根据国家和机构指南进行处置。
   注意：步骤 3.3–3.13 需在无 RNase 条件下操作。佩戴手套，并使用无 RNase 的玻璃器皿和一次性塑料制品。有关 RNA 操作的一般注意事项，可参考例如在线提供的 RNeasy Micro 手册附录 A。
   1. 将玻璃巴斯德吸管在180℃烘箱中孵育过夜 °C.
   2. 倾斜培养板，使用连接至真空泵的玻璃巴斯德吸管，彻底吸除各孔中的培养基。
   3. 立即加入 700 µ每孔加入 L 裂解试剂。
   4. 通过手动轻轻摇晃和晃动培养板，使溶液均匀铺展。
   5. 用移液器将溶液上下吹打4至5次，或直至获得均一的悬浮液。
   6. 将每个孔中的溶液转移至单独的1.5 mL离心管中。
      注意：细胞裂解液可在 -80 ℃ 保存 °C 或立即进行处理。
4. 如有需要，将细胞裂解液在室温下解冻，并立即进行步骤3.5。
5. 加入140 µ每份细胞裂解液样品中加入 L 氯仿。
   注意：氯仿具有挥发性，难以移取，应尽快关闭离心管。
6. 剧烈振荡Eppendorf管15秒，或直至样品完全乳化。
7. 室温放置1–2分钟，或直至液相开始分离。
8. 在 4°C 条件下，以 12,000 × g 离心 15 分钟 °C.
9. 转移上层水相（约320 μL） µL）含有RNA的液体转移至新的Eppendorf管中，弃去剩余液体。
   注意：移液时切勿触碰下层粉红色有机相或两相之间的白色环状物。
10. 加入1.5倍体积的100%乙醇（480 µ将溶液缓慢上下吹打3次以混匀。
11. 使用专为小样本RNA纯化设计的市售试剂盒纯化RNA。
12. 使用分光光度计测定RNA浓度和样品纯度。
    注意：(i) 预期产量 ≥3.5 µg/孔；RNA纯度检测中，260/280和260/230比值分别用于评估蛋白质和有机化合物的污染程度，二者均应≥1.9。（ii）RNA样品可在-80℃保存 °C 或立即进行处理。
13. 使用市售试剂盒将 250、500 或 1000 ng 的 RNA 进行逆转录。
14. 通过qRT-PCR定量内源目的基因的敲低效率。详细实验步骤参见参考文献¹⁰。力求达到≥60%的敲低效率（图2）。将数据归一化至≥2个看家基因（例如. GAPDH、ACTB、TUBB3、PPIA) 使用多个内参基因方法¹¹.
    注意：若使用大鼠样本，请采用以下内参基因的PCR引物：GAPDH-fwd：5' GGTGCTGAGTATGTCGTGGA 3' 和 GAPDH-rev：5' GATGATGACCCTTTTGGC 3'；ACTB-fwd：5' CATCACTATCGGCAATGAGC 3' 和 ACTB-rev：5' TCATGGATGCCACAGGATT 3'；TUBB3-fwd：5' GCCTTTGGACACCTATTCAG 3' 和 TUBB3-rev：5' TCACATTCTTTCCTCACGAC 3'；PPIA-fwd：5' CACTGGGGAGAAAGGATTTG 3' 和 PPIA-rev：5' CCATTATGGCGTGTGAAGTC 3'。

4. 利用光遗传学靶向刺激基因敲低神经元评估突触前蛋白在完整神经环路中的作用

注意：以下实验方案要求操作者具备急性脑切片电生理记录的相关经验，并能够使用电生理记录设备。

1. 立体定向注射 rAAV1/2 至脑内，操作步骤参照先前发表的详细方案¹²使用小鼠立体定位图谱确定目标脑区的立体定位坐标¹³ 或大鼠脑¹⁴.
   1. 使用微电极拉制仪制备具有长柄的注射用微电极 Ø 7–9 µm；用剪刀在针柄处剪断注射微量移液管。使用细标记笔和坐标纸，在注射微量移液管上每隔 2 mm 标记一个刻度。
   2. 使用异氟烷麻醉动物，并将其固定于立体定位仪中。
   3. 手术过程中使用设定为37℃的加热垫保持动物体温 °C.
   4. 使用眼用润滑剂保护眼睛。
   5. 使用电动剃须刀剃除头部的毛发。
   6. 用棉签将聚维酮碘涂抹于剃毛后的头部。
   7. 在解剖显微镜下，沿中线做一切口。
   8. 用棉签清洁颅骨表面，使前囟和后囟清晰可见。
   9. 将注射移液管放入其固定架中，将固定架连接至立体定位臂。
   10. 根据前囟和/或后囟确定注射位点的 x 和 y 坐标。
   11. 使用钻头对目标区域的颅骨进行减薄。
       注意：使用轻柔的环形动作，避免钻穿颅骨，以免损伤脑表面。
   12. 如果有出血，用纸巾吸去多余的血液。
       注意：血液过多将难以准确确定 z 坐标。
   13. 加载 ≤2 µ通过毛细作用将病毒液体吸入注射微量移液器中。
   14. 将注射微移液管移至注射位点的 x 和 y 坐标位置。
   15. 根据硬脑膜计算 z 坐标，并缓慢将移液管插入脑组织。
   16. 当到达 z 坐标时，等待 3 min，以使组织适应。
   17. 使用1 mL注射器通过柔性管连接至注射微量移液器后端，施加较低的正压。通过解剖显微镜观察，并以校准刻度为参考，目视监测病毒从注射微量移液器中排出的速度。
       注意：病毒需以缓慢速率注射（<100 nL/min）以避免组织损伤。
   18. 注射完成后，等待5分钟，将注射微移液管回撤0.2 mm，再等待5分钟，以避免病毒回流。
   19. 缓慢而彻底地将注射微移液管从脑组织中撤出，并将其丢弃至装有漂白剂的容器中。
   20. 用生理溶液湿润颅骨，并用3-4针缝合皮肤。
   21. 将庆大霉素软膏涂抹于伤口处。
   22. 将动物单独饲养于清洁的笼具中，提供食物颗粒，并在加热灯下保温，直至其完全恢复。
2. 注射后至少15天，在深度异氟烷麻醉下断头处死动物。
3. 使用充满气体（95% O₂₂，5% CO₂₂) 冰冷的 aCSF 溶液，含有（单位：mM）：123 NaCl，1.25 KCl，1.25 KH₂PO₄，1.5 MgCl₂，1 CaCl₂，25 NaHCO₃₃，2 NaPyruvate 和 18 葡萄糖（渗透压调节至 300 mOsm）。例如，若目标是分析 CA3 至 CA1 锥体神经元的突触传递，则制备海马结构的矢状切片（350 µ微米厚。
   注意：从这一步开始，需在低光照条件下操作，以避免环境光激活光遗传学探针。
4. 让切片在37℃下恢复30分钟 °将脑片置于设计用于容纳脑片的切片室中，使用相同的aCSF溶液。在室温下将脑片保存在同一脑片室中，直至记录。
   注意：使用这些条件，切片可保持健康状态长达6–8小时。
5. 将一片脑片转移至浸没式记录舱中，并以2 mL/min的速度灌流用于恢复的相同aCSF，其中添加1.5 mM CaCl₂₂ 总钙²⁺：2.5 mM）且不含 NaPyruvate。
   注意：切片在低浓度 Ca 条件下制备并维持²⁺ （1 mM）以降低毒性。记录在 2.5 mM Ca²⁺ 促进囊泡释放。
6. 简要检测表达的荧光报告基因信号（例如TdTomato； 图3B以确定感染的定位和强度。
7. 用含有以下成分（单位：mM）的细胞内液填充膜片电极：110 K-葡萄糖酸盐、22 KCl、5 NaCl、0.5 EGTA、3 MgCl₂₂，4 Mg-ATP，0.5 Na₃-GTP，20 K₂-磷酸肌酸，10 HEPES-KOH（pH 7.28，290 mΩ).
   注意：使用移液管电阻为 5–6 mΩ 的膜片电极Ω.
8. 在红外光照下，对接受感染神经元突触输入的神经元建立紧密封接的全细胞记录构型。例如，如果感染了CA3锥体神经元，则对CA1区域近端至中段纤维通路中的锥体神经元进行膜片钳记录。图3C).
   注意：串联电阻可以不进行补偿，但应保持恒定且较低（≤20 MΩ）。Ω).
9. 使用药理学方法分离待研究的突触电流。例如，若旨在研究兴奋性突触传递，可使用10 μM的拮抗剂阻断抑制性突触传递 µM bicuculline
10. 使用与光纤耦合的473 nm蓝光激光器诱发突触电流，例如兴奋性突触后电流（EPSCs）Ø ≤250 µm) 定位于感染神经元的胞体上（例如CA3 锥体神经元
    1. 将刺激时长调整至最短，以降低每次光脉冲诱发多个动作电位的可能性。若使用 ChETA，应将其设置为 2 ms¹⁵.
    2. 调节激光刺激强度，以产生微弱但可清晰检测的突触电流（在-70 mV钳制电位下记录CA3与CA1锥体神经元之间的兴奋性突触电流，其峰值幅度≤50 pA）； 图 3D）。如果使用 ChETA 和直径为 250 的光学纤维 µ直径为 m 时，光纤出口处的刺激强度应为 1–3 mW 较为合适。
       注意：如果无法调节激光强度，请使用中性密度滤光片。
    3. 将473 nm激光照射在感染神经元的胞体上，但避免照射其轴突。例如，将光照射在CA3区的胞体上，避开Schaffer侧支，以防止轴突的直接去极化。
    4. 应用河豚毒素（TTX；0.5 µM），一种钠通道阻断剂，以确认这些通道是由动作电位驱动的。
    5. 在不同的记录中，对所研究的突触电流施加选择性阻断剂，以确认刺激具有选择性。
       注意：例如，使用 NBQX（10 µM）对AMPA型谷氨酸受体介导的兴奋性突触后电流（EPSCs）。
    6. 在相同的急性脑片中，比较对重复刺激（≥2次刺激，≤20 Hz）所诱发的光刺激和电刺激突触电流。当使用对照miR时，光刺激与电刺激应表现出相似程度的突触易化或抑制，提示这两种刺激方式激活了相似的细胞机制。
       注意：上述步骤是必要的，以确保光刺激不会直接引起突触前末梢的去极化，从而避免绕过某些突触传递机制。
11. 比较对照miR与靶向突触前蛋白的miR在单次刺激和重复刺激（≥2次刺激，≤20 Hz）条件下突触传递的差异。

结果

上述步骤提供了一种可靠的方法，用于评估突触前神经元中突触蛋白表达下调对突触传递的影响。以下示例展示了突触前Ca_v2.1（P/Q型）电压门控钙通道不同剪接异构体表达下调如何调控CA3至CA1兴奋性突触的短期突触可塑性。

Ca_v2.1（P/Q型）通道是中枢神经系统大多数快速突触中主要的突触前电压门控钙通道（VGCCs）。Ca_v2.1孔形成α₁亚基（α_1A）中相互排斥的外显子37a和37b的可变剪接产生了两种主要变体：Ca_v2.1[EFa]和Ca_v2.1[EFb]^16,17,18。为了确定Ca_v2.1[EFa]和Ca_v2.1[EFb]是否在大鼠海马锥体神经元中差异性调控突触传递和突触可塑性，我们首先开发了亚型特异性的miR，以选择性敲低Ca_v2.1[EFa]或Ca_v2.1[EFb]⁵。尽管外显子37a和37b序列较短（97 bp）且高度相似（核苷酸水平上具有61.86%的一致性），我们仍成功设计出三条针对大鼠Ca_v2.1[EFa]的miR序列（miR EFa1：TCCTTATAGTGAATGCGGCCG；miR EFa2：ATGTCCTTATAGTGAATGCGG；miR EFa3：TTGCAAGCAACCCTATGAGGA）以及两条针对大鼠Ca_v2.1[EFb]的miR序列（miR EFb1：ATACATGTCCGGGTAAGGCAT；miR EFb2：ATCTGATACATGTCCGGGTAA），预测其具有高效的敲低能力。作为阴性对照（miR Control），我们使用了pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg质粒，该质粒包含一段不靶向任何已知脊椎动物基因的序列。根据在HEK 293细胞中对异源表达通道的初步筛选结果，我们选定了miR EFa1、miR EFa3和miR EFb2，并将其表达盒克隆至载体pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X的3'非翻译区（3'UTR），该载体用于重组腺相关病毒（rAAV）的制备，其中突触素启动子驱动超快通道视紫红质ChETA、红色荧光蛋白TdTomato以及插入的miR的表达（图1）。此外，我们还将miR EFb2的表达盒重复一次，以提高该miR的敲低效率。

接下来，我们为上述四种构建体准备了rAAV1/2，并使用亚型特异性的qRT-PCR在原代大鼠神经元培养物中定量其敲低效率和选择性。miR EFa1和miR EFa3可将内源性Ca_v2.1[EFa]的mRNA降低约70%，但对Ca_v2.1[EFb]的mRNA无影响；而miR EFb可将内源性Ca_v2.1[EFb]的mRNA降低约60%，但对Ca_v2.1[EFa]的mRNA无影响（图2）。

随后，我们将四种rAAV1/2病毒立体定位注射至P18大鼠海马CA3区（相对于前囟的坐标为A-P/M-L/D-V：−2.6/± 2.9/−2.9）（图3A-C）。注射后15至24天，我们制备了注射rAAV1/2病毒的大鼠急性海马脑片，并利用TdTomato荧光确认rAAV的表达与定位情况（图3B）。为了研究在CA3至CA1突触中，突触前Ca_v2.1[EFa]或Ca_v2.1[EFb]的敲低是否影响短时程突触可塑性，我们使用473 nm激光短脉冲（持续2 ms）选择性刺激已被感染的CA3神经元（图3C），并通过膜片钳记录CA1区域近端至中段通路中的锥体神经元所产生的兴奋性突触后电流（EPSCs）（图3C）。我们发现，Ca_v2.1剪接异构体的敲低对成对脉冲刺激的反应产生了相反方向的影响：Ca_v2.1[EFa]（miR EFa1或miR EFa3）的敲低增强了成对脉冲易化（PPF），而Ca_v2.1[EFb]（miR EFb2）的敲低则消除了该效应（图3D，E）。

图 1：联合表达超快光遗传探针 ChETA 与针对 Ca_v2.1[EFa] 和 Ca_v2.1[EFb] 亚型特异性 miR 的构建方案。(A) rAAV 载体 pAAV-Syn-ChETA-TdT-miR-X 的图谱，包含突触素启动子（Syn）、与 TdTomato 融合的超快通道视紫红质 ChETA，以及位于近端 3'非翻译区（3'UTR）的 Ca_v2.1 剪接亚型特异性 miR。图中所示限制性内切酶均为单一切点酶。 (B) 上图：表达盒示意图。突触素启动子驱动 ChETA-TdTomato 和亚型特异性 miR 的共同表达。下图：21 个核苷酸靶序列的反向互补序列，构成 miR 表达盒的一部分。对于 miR EFb2，两个相同的 miR 表达盒以头尾相连的方式串联表达。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 针对Ca_v2.1[EFa]和Ca_v2.1[EFb]亚型特异性miR的敲低效率与选择性评估。 对在6 DIV时感染表达靶向Ca_v2.1[EFa]（miR EFa1和miR EFa3）或Ca_v2.1[EFb]（miR EFb2）的rAAV的17–18 DIV原代培养物中提取的RNA进行亚型特异性qRT-PCR分析。数据经标准化处理，以阴性对照（miR Control）为基准。miR EFa1和miR EFa3显著且选择性地降低了Ca_v2.1[EFa]的mRNA水平（分别为n = 8和7个培养样本），而miR EFb显著且选择性地降低了Ca_v2.1[EFb]的mRNA水平（n = 4个培养样本；***p<0.001；采用单因素方差分析后接Tukey-Kramer多重比较检验）。数据以均值±标准误表示。本图改编自Thalhammer, A. et al.⁵。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 评估Ca在其中的作用_v2.1[EFa] 和 Ca_v通过光遗传学靶向刺激敲低神经元，在天然海马体中研究2.1[EFb]。 （A） 用于rAAV载体的表达盒示意图 体内 感染 （B） 海马切片显示 TdTomato 荧光仅限于 CA3 区域及其投射纤维。 (C) 实验配置：将激光束照射至CA3锥体细胞胞体，同时对CA1锥体神经元进行膜片钳记录。 （D） 2毫秒长的蓝色（473 nm）激光脉冲以20 Hz频率照射可诱发兴奋性突触后电流（EPSCs），其成对脉冲易化（PPF）效应因靶向Ca的miRs而增强_v2.1[EFa] 并被 miR 抑制以作用于 Ca_v2.1[EFb] (E) 双脉冲比值总结，实验条件同（D），显示与miR Control相比，miR EFa1和miR EFa3的PPF增加，而miR EFb2的PPF降低（n = 9 - 11次记录；*p=0.02；**p=0.01；***p<0.0004；协方差分析）。数据以均值 ± 标准误表示。本图改编自 Thalhammer, A. 等⁵. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

共表达一种光遗传学探针和针对特定突触前基因的miR，为在完整的神经环路中表征基因敲低对突触前功能的影响提供了一种强有力的方法。采用该实验策略时，关键在于鉴定并表征在天然系统中对目标基因具有高效率和高选择性的miR。如果可能，应使用两个或更多针对同一目标mRNA的独立miR，以对照可能存在的脱靶效应。此外，可通过挽救实验（即在系统中重新引入对miR具有抗性的基因）作为特异性对照。

使用相同的载体同时表达光遗传学探针和miR，可实现仅对经过遗传操作的突触前神经元进行光学刺激。而电刺激无法做到这一点，因为它无法区分被感染与未被感染的神经元，从而导致结果混杂且信号被稀释。由于光刺激能够诱发多个动作电位¹⁵，因此有必要从日益丰富的光遗传学工具中选择响应速度最快的探针^15,19,20,21。此外，必须确保光刺激不会直接引起突触前末梢的去极化，以避免绕过拟研究的突触传递过程中的某些关键步骤²²。

本文所述的实验方法能够在较短的时间内（4–6个月）并行评估多个突触前基因的生理相关性。然而，需要注意的是，基因敲低通常很难达到100%的效率。此外，重组腺相关病毒（rAAV）需要至少表达两周，以实现最大程度的基因敲低以及光遗传探针的充分表达，这在研究早期发育过程时可能构成时间上的限制。尽管耗时更长，但局限于突触前神经元的条件性基因敲除小鼠模型通常能够完全去除目标基因，因此是一种有效的互补方法。

miR 技术的一个特定优势在于，它能够从同一个启动子驱动多个 miR 的表达。这一特性主要用于通过插入同一 miR 的多个拷贝或针对同一靶基因的不同 miR 来提高基因沉默效率。然而，该特性也可用于同时沉默多个基因，即表达针对不同靶基因的 miR^7,23。这一特性可用于沉默多个突触前蛋白，从而解析突触前信号通路。

在此，我们将光遗传学与人工miR相结合，以表征基因敲降对急性海马脑片中突触前功能的影响。类似的方法也可用于操控和探究神经环路。 体内此外，将人工miR与化学遗传学方法相结合，可实现对神经环路在更长时间尺度上的探究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺	Sigma	丙烯酰胺/双丙烯酰胺，30% 溶液
带加热垫的有毒动物温度控制器	WPI	ATC2000
BCA 蛋白检测试剂盒	ThermoFisher Scientific	23225
BLOCK-iT Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒	ThermoFisher Scientific	K4936-00
脑切片 前室	哈佛仪器	BSC-PC
CCD基于相机的成像仪	Bio-Rad	ChemiDoc™
细胞培养试剂	Life Technologies
化学发光底物	GE Helthcare	ECL 蛋白质印迹试剂，RPN2106
氯仿	Sigma	C2432	毒性
胞嘧啶 &β;-D-阿拉伯呋喃糖苷	Sigma	C6645
钻头	Foredom	K.1030
EGTA	Sigma	E4378
庆大霉素软膏	当地药房
葡萄糖	Sigma	G7021
Hepes	Sigma	54459
注射微量移液器	Narishige	GD1
无机盐和洗涤剂	Sigma
K2-磷酸肌酸	Calbiochem	237911
KGluconate	Fluka	60245
激光	Laserglow Technologies	LRS-0473-GFM-00100-03
膜	Amersham	Protran™ 0.2 µm NC
MgATP	Sigma	A9187
微量移液器支架	Narishige	IM-H1
微量移液器拉拔器	Narishige	PC-100
Na3GTP	Sigma	G8877
NaPyruvate	Sigma	P5280
眼部润滑剂	当地药房	Lacrigel
磷酸盐抑制剂	Sigma	P0044、P5726
蛋白酶抑制剂	Sigma	cOmplete™、不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂 混合物
蛋白质凝胶电泳和印迹装置	Bio-Rad	Mini-Protean III 细胞
Providone 碘	当地药房	Betadine
Qiazol 裂解试剂	Qiagen	79306	Toxic
QuantiTect Reverse 转录试剂盒	Qiagen	205311
RNeasy 微量试剂盒	Qiagen	74004
分光光度计	ThermoFisher Scientific	Nanodrop 2000
立体定向仪	WPI
河豚毒素	Tocris	1069	有毒
徕卡	VT1200S		切片机