本研究中，我们描述了一种鸡胚内实验（in-ovo）系统，作为一种在活体生物中检测胰岛素模拟化合物的有前景工具。其主要优势包括适中的通量水平和可接受的成本，能够用于鉴定具有胰岛素模拟特性的植物化学成分。
本文内容
摘要
摘要
2型糖尿病（T2DM）是一种复杂且多因素的代谢性疾病，其高血糖水平由胰岛素抵抗和β细胞功能衰竭引起。目前已有多种治疗策略，包括注射胰岛素或使用增加胰岛素敏感性的药物，以治疗T2DM或至少缓解其症状。此外，草药化合物的应用也日益受到关注。因此，有必要建立高效的测试系统，用于鉴定和表征具有胰岛素模拟作用的化合物。本文中，我们开发了一种改良的鸡胚模型，可用于检测具有胰岛素模拟特性的合成化合物和草药提取物。通过基于荧光显微镜的初筛方法，定量分析葡萄糖转运蛋白4（Glut4）向细胞膜的转位情况，我们成功鉴定出若干可提高脂肪细胞内葡萄糖浓度的化合物，主要为草药提取物。然而，这些物质的有效性仍需在活体生物中进一步验证。因此，我们采用in-ovo方法来评估其降低血糖的作用。由于鸡胚在胚胎发育前三分之二阶段的使用不被视为动物实验，因此无需伦理委员会审批。本文详细描述了该模型的应用方法。
引言
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍引起1。所有糖尿病病例中约90%属于2型糖尿病（T2DM），患者表现为胰岛素抵抗，大多同时伴有胰岛素缺乏2。已知多种因素可增加全球T2DM发病率，包括生活方式的改变，特别是营养过剩、老龄化和体力活动不足。根据国际糖尿病联盟（IDF）的数据，全球约有4亿人患有糖尿病。预计在未来20年内，这一数字将达到6亿3。
由高血糖和胰岛素抵抗引起的糖尿病并发症，如高血压、血脂异常、葡萄糖耐受不良、冠心病和脑血管疾病，显著降低了患者的预期寿命和生活质量4。患者需要接受降糖药物治疗；然而，诸如二甲双胍5等药物的使用常伴随严重的不良反应6,7,8。因此，亟需开发安全、广泛可及且经济实惠的新型抗糖尿病干预措施。
多种草药化合物、提取物、植物和营养保健品被认为具有胰岛素模拟特性，可通过调节多种细胞功能发挥作用。其中一个重要特征是促进葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内储存区室向质膜转位，从而在无胰岛素的情况下增加肌肉和脂肪组织对葡萄糖的摄取，这一特性被称为胰岛素模拟特性9。此前，我们采用基于荧光显微镜的方法来定量分析GLUT4的转位过程10。利用该检测方法分析了一个提取物文库中的多种植物提取物11，成功鉴定出若干有前景的候选物质。然而，仍需在活体生物中进行进一步验证。本文详细描述了一种改良的鸡胚模型，已被证明是鉴定具有胰岛素模拟特性的物质的有力工具。该模型填补了体外（in-vitro）与体内（in-vivo）研究之间的巨大空白，相较于现有系统具有多项优势，包括成本适中、操作简便以及较高的通量水平。此外，该模型无需获得伦理委员会的批准。
方案
根据指令 2010/63/EU，在胚胎发育的前三分之二阶段内，对未孵化鸟类胚胎进行的实验无需获得伦理委员会的许可。
1. 卵的保存与孵化
- 从当地饲养者处获取受精的鸡卵（材料表）。
注意：卵产下后可在14 °C、加湿环境中储存最多10天，之后用于实验。 - 将卵置于恒温38 °C、平均湿度40 - 60%的孵化箱中孵化10或11天，孵化箱需持续自动翻卵。
2. 卵子的选择
- 孵化最多11天后，使用照蛋灯检查卵子是否受精。将照蛋灯的边缘蘸取印台墨水，然后照射鸡蛋的尖端进行照蛋。
- 为识别气室，请观察鸡蛋顶部亮度的差异。
注意：照蛋时，气室呈现为圆形且较透明的区域，而蛋清部分则较暗。 - 检测到气室后，用之前蘸好墨水的照蛋灯轻轻按压蛋壳，标记气室位置。
- 在此步骤中剔除未受精卵，未受精卵在蛋清与气室之间无明显亮度差异。
3. 物质注射
- 通过将待测物质（例如，草药提取物或胰岛素）用 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）缓冲液稀释至所需浓度来制备样品。例如，将市售的胰岛素类似物配制成 HBSS 中浓度为 3.3 U/mL 的溶液。
- 在施加选定化合物时，用尖头镊子在气室标记区域小心地啄破蛋壳。所形成的孔洞直径不得超过注射器针头的直径。通过注射器将含有待测物质的缓冲液（300 µL）注入啄破的区域。
注意：实验中应使用无菌的一次性 1 mL 注射器、移液器吸头和容器。操作时需佩戴手套和实验服。 - 为评估某物质降低血糖的效果，将鸡蛋分别放回孵育箱中继续孵育 60、120 和 180 分钟。为测定基础血糖水平，应至少设置 10 - 15 枚未经处理的对照组鸡蛋。
4. 毒性测试
- 应用所选化合物24小时后，用磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液（足以覆盖整个蛋壳膜）平衡蛋壳膜至少30秒。
- 倾去多余的PBS缓冲液。
- 用尖头镊子小心地将蛋壳膜剥离。
- 检查血管是否有病变，并确认鸡胚的活性（例如，运动情况）。
注意：参见图1，比较应用有毒草药提取物后有活性与无活性的胚胎。
5. 血糖值的测定
- 在相应时间点，小心移除气室上方的蛋壳，并用 PBS 缓冲液平衡卵壳膜（缓冲液量需足以覆盖整个卵壳膜）。
- 倾去多余的 PBS 缓冲液。
- 用尖头镊子小心揭去卵壳膜。
- 使用显微剪刀剪除并移去绒毛尿囊膜，以充分暴露合适的血管。剪除范围至少为 2–3 cm。注意不要剪破膜上的大血管，以免胚胎发生非预期的失血。
- 找到从胚胎腹部发出的大血管。用闭合的显微剪刀将该血管从蛋清中轻轻挑起，并放置于一条塑料 pH 试纸上。将 pH 试纸移至被显微剪刀夹持的血管下方，然后小心地将显微剪刀撤回。
- 用移液器吸除绒毛尿囊膜下方 1–2 mL 液体，以避免下一步中血液被稀释。在切割血管前，用滤纸将血管和 pH 试纸表面吸干。
- 用显微剪刀在血管一侧小心剪开，切勿完全切断血管。
注意：该血管直径约为 1 mm。剪切深度不应超过血管半径的一半，以防完全切断导致血管滑脱，从而无法收集血液。 - 用移液器将从血管渗出的血液收集至 pH 试纸上。使用血糖仪测定血糖水平需采集 10 微升血液。
6. 统计学评估
- 计算每个时间点至少10个独立卵的平均值，并将这些值归一化至一个对照卵（未处理或缓冲液处理的卵）。
- 随后，确定减少的百分比。此外，使用胰岛素作为阳性对照。
注意：每个实验至少重复三次。
结果
Gluc-HET 方法的描述：
在与目标物质孵育后，将打开受精卵并去除蛋壳以准备采血（图2）。进一步的处理包括平衡并去除蛋壳膜，以暴露绒毛尿囊膜。随后小心切开该膜，以暴露合适的血管进行采血。优选从胚胎腹部延伸出的大血管，将其置于塑料pH试纸上。为避免采血过程中血液被稀释，需用滤纸轻轻吸干血管及pH试纸表面。然后剪断血管，用移液器收集渗出并滴落在pH试纸上的血液用于分析。
选定草药提取物对血糖水平的影响：
利用近期建立的基于GLUT4转位定量的初筛方法，我们能够鉴定具有胰岛素模拟特性的物质10。对数百种水溶性草本提取物进行筛选后，获得了若干阳性结果。这些提取物在我们的in-ovo模型中进行了测试。实验中使用了Combretum indicum（荣花藤）提取物和一种未公开的提取物（代号0845）。我们将提取物溶解于HBSS缓冲液中，浓度为300 mg/L，该浓度在先前的研究中已被证实适宜12,13。将上述物质作用于孵化11天的胚胎。如图3所示，荣花藤提取物在in-ovo条件下未引起显著的血糖降低。然而，使用提取物0845后，血糖浓度在60分钟后出现轻微下降，其效果与市售胰岛素类似物相当。当延长鸡蛋孵化时间时，可观察到更显著的作用效果。
图 1：有毒化合物对胚胎活力的影响。 卵在孵育 11 天后 (A 和 C)，或在第 10 天施加有毒植物提取物处理 24 小时 (B 和 D)。施加该提取物导致绒毛尿囊膜 (D) 和胚胎 (B) 的血管出现严重损伤。
图2：in-ovo 模型示意图。 从左至右：打开并去除蛋壳 (1-2)；平衡并去除蛋壳膜，使绒毛尿囊膜暴露 (3)；将制备好的样本置于pH试纸上 (4)；采集血液并使用血糖仪测量葡萄糖浓度 (5)。改编自 Haselgruebler et al., 201712。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：草本提取物对血糖水平的影响，与未处理或胰岛素处理的卵相比。 卵在11天内孵育，并用指定物质（市售胰岛素类似物：3.3 U/mL；提取物：300 mg/L）溶解于HBSS缓冲液（300 µL体积）中处理，最长处理3小时。使用血糖仪测定血糖水平。结果未显示缓冲液的影响。误差线基于平均值的标准误差。*P <0.05 和 ****P <0.0001，与相同孵育时间的HBSS处理卵相比具有显著降低。改编自Haselgruebler et al., 201712。 请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
HET-CAM 检测是工业界广泛采用的一种替代动物实验的测试体系12。该 在卵内 此处描述的系统是HET-CAM实验的一种改良版本。在原始形式中，HET-CAM实验用于研究化合物及制剂的刺激性，或用于血管生成分析14,15,16我们已调整该方法，用于测试具有假定胰岛素模拟特性的化合物12根据欧盟指令2010/63/EU，在鸟类胚胎发育的前三分之二阶段内对未孵化胚胎进行的实验无需伦理委员会批准，因为此类实验不被视为动物实验。近期研究已证实该方法的适用性 在卵内 用于表征经基于GLUT4转位的初筛所鉴定出的选定草药提取物之功效的系统10，在无胰岛素的情况下降低血糖水平12,13性能良好的关键要点 在卵内 系统包括以下几个关键要素：首先，需要可靠的种鸡来提供受精卵，罗曼褐壳蛋鸡是较为理想的品种选择。其次，必须开展毒性测试，以排除所研究化合物的毒性作用。此外，制备适合采血的血管也至关重要。应避免切割绒毛尿囊膜上的大血管，以免造成不必要的血液流失。再者，在将血液滴加到pH试纸上之前，需用滤纸轻轻吸干血管表面，防止所采集血液被稀释。最后，进行足够数量的实验同样重要。我们建议每个时间点至少使用10枚鸡蛋，并对实验进行三次重复。
显然，这种卵内（in-ovo）方法存在一些局限性。由于物质通过蛋壳膜吸收并与其尿囊绒毛膜密切接触需要长达30分钟，因此无法量化胚胎对所用化合物的快速反应。此外，某些化合物在应用浓度下可能具有毒性，常导致尿囊绒毛膜血管发生病变。因此，基于化合物约24小时长期孵育的细胞毒性检测显得较为合理。最后，我们发现用于化合物施加的缓冲体系对检测结果具有显著影响。12 目前采用HBSS缓冲液，因其对胚胎血糖水平的影响最小。
对于未来应用，可测试除HBSS之外的其他缓冲体系作为替代方案。此外，草药提取物对胆固醇、甘油三酯或脂蛋白等其他血液参数的影响可能是一个值得探讨的问题。
我们新的 in-ovo 系统是一种极具前景且重要的工具，可用于在活体生物中测试具有胰岛素模拟特性的物质，而无需进行动物实验。因此，该系统填补了in-vitro与in-vivo研究方法之间的空白。与现有的in-ovo模型系统17相比，本方法无需通过链脲佐菌素（STZ）处理诱导糖尿病，因为我们使用的是孵化第10或第11天的胚胎。在此阶段，胚胎尚未开始产生胰岛素，但已对胰岛素具有敏感性。此外，若使用孵化14至17天的胚胎，可能需要获得伦理委员会的批准17。再者，与其它替代策略18相比，本文所述的化合物给药方式对胚胎的伤害更小且操作更简便，从而提高了实验通量。
综上所述，如果需要在活体生物中测试胰岛素模拟物质的降血糖作用，这种in-ovo方法是一种具有吸引力的实验体系。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由奥地利研究促进署（FFG；项目编号 850681）、上奥地利应用科学大学基础资助计划（GlucoSTAR 项目）以及医学技术创新中心（TIMed 中心）资助，其中 TIMed 中心获得上奥地利州政府的基础资金支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Biochrom | L1825 | |
| Hank’s平衡盐溶液（HBSS） | Thermo Scientific | SH30268.02 | |
| NovoRapid | Novo Nordisk | 8-0905-82-304-6 | |
| 鸡蛋（Lohmann classic brown 鸡） | 本地养殖者 | ||
| Accu-check performa | Roche | 6454011 | |
| Accu-check Inform II 测试条 | Roche | 5942861 | |
| 孵育箱 HEKA- Turbo 288 | HEKA Brutgeräte | ||
| 1 mL Omnican F 注射器 | Braun | 09161502S | |
| 提取物 | PEKISH 提取物文库 | ||
| 灯泡 Tempo Nr. 119 | ORBAN |
参考文献
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