本文介绍了一种快速、简便且低成本的方法，用于制备定制的聚二甲基硅氧烷模具，该模具可用于制造具有复杂几何结构的基于水凝胶的工程化组织。我们还描述了采用该技术制备的工程化心肌组织的力学性能和组织学评估结果。
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本文内容
摘要
摘要
随着组织工程领域不断发展并趋于成熟，人们对包括组织形态在内的多种组织参数产生了日益浓厚的兴趣。在微米至厘米尺度上调控组织形态，可引导细胞排列方向，改变有效的力学性能，并解决与营养物质扩散相关的局限性。此外，组织制备所用容器可能对组织施加力学约束，从而产生应力场，进一步影响细胞与基质结构。具有高度可重复尺寸的成型组织在 体外 样品尺寸至关重要的检测，例如整个组织的力学分析。
本文描述了一种利用激光蚀刻丙烯酸材料制备的负性母模的替代性 fabrication 方法：该模具与聚二甲基硅氧烷（PDMS）兼容性良好，可实现厘米尺度的结构设计以及特征尺寸小于25 µm的微细结构，且能够在低成本和无需专业技术的条件下快速设计和制备。由于所需时间和成本极低，可对激光蚀刻模具进行快速迭代，直至确定最优设计，并可轻松调整以适应任何感兴趣的检测方法，包括组织工程领域之外的应用。
引言
在过去的二十年中，软光刻技术已被广泛用作支持科学研究的一种制造技术，尤其在微流控、材料研究和组织工程领域1,2,3。复制模塑技术通过使用具有所需形状的负向母模来制备相应形状的物体，为制备可用于成型水凝胶的正向PDMS复制品提供了一种方便且低成本的方法。然而，所需的负向母模通常需借助微加工技术制备，这类方法成本高、耗时长、尺寸受限，且需要洁净室空间和精密设备。尽管3D打印提供了一种潜在的替代方案，但其应用仍受到限制：低成本3D打印机的分辨率有限，且常用3D打印聚合物与PDMS之间存在化学相互作用，可能抑制PDMS的固化过程。
近年来，能够切割和蚀刻塑料、木材、玻璃及金属等材料的激光切割系统价格大幅降低，因此在科研工具的制造中变得更加普及。商用级激光切割机能够制造厘米尺度的物体，其最小特征尺寸可小于25 µm，且使用时所需培训、专业知识和时间均极少。尽管此前已有研究利用激光消融聚二甲基硅氧烷（PDMS）来制备微流控器件，但据我们所知，尚无文献描述通过激光切割负向母模来制备毫米和厘米级模具的方法4。
我们主要利用该技术调控工程化组织的形态，以改善营养物质扩散、细胞排列以及机械性能
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方案
1. 创建矢量格式的母版模具设计
- 使用矢量图形软件（参见材料、设备和软件表）以矢量格式组装所需的模具几何结构。选择文件 | 新建，创建一个具有适当尺寸且采用RGB颜色格式的画布。使用左侧面板中的形状工具创建所需的几何图形：在窗口顶部输入所需的尺寸（如果初始不可见，请点击顶部的变换按钮）以精确定义形状大小。
注意：模具几何结构应在最外层特征边缘与切割线之间预留至少6 mm的边距，以便在模具浇铸后修整PDMS弯月面。这将使成品模具能够与培养皿底部完全贴合。此外，模具几何结构的设计应考虑所用激光切割机型号的相关限制，包括切口宽度（kerf width）和最小特征尺寸。本文所述工作中使用的激光切割机（参见材料、设备和软件表）具有0.2 mm的切口宽度和25 µm的最小蚀刻特征尺寸（最大分辨率为1,000 DPI）。模具尺寸可根据所需的培养容器进行选择，例如10 cm培养皿或6孔板、24孔板。 - 打开窗口左上角的颜色选择器，并定义与激光切割软件兼容的新颜色样本。
注意：我们使用红色（RGB 255, 0, 0）表示切割，蓝色（RGB 0, 0, 255）表示蚀刻。可根据设计需求定义其他颜色样本（例如，若需要多种蚀刻深度）。- 通过选择路径，然后在颜色选择器中为路径颜色选择切割用颜色样本，同时将填充颜色设为[无]，从而....
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结果
激光切割机的光学特性会导致蚀刻区域的尺寸随着蚀刻深度的增加而略微减小，并由于激光束的锥度效应，使模具侧壁形成极轻微的斜面。这有助于脱除浇铸的PDMS模具，但在制作蚀刻较深的负型母模时应予以仔细考虑。>6 mm）是必需的（图1).
在培养过程中，由于基质重塑，细胞化构建体会随时间发生收缩，但其收缩速率和程度取决于支架成分、细胞接种量以及培养条件。
基质重塑可通过周围基质的重新排列和降解（以及新基质的沉积）发生，但通常由于横截面积减小而伴随机械刚度的增加。由1.6 mg/mL胶原和12 x 10⁶6 心肌细胞/mL，我们观察到在浇铸后的四天内，构建物收缩至其初始宽度的19.7 ± 2.8%图2
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讨论
与组织培养兼容的定制化PDMS模具几何结构在调控工程化组织的重要特性（如细胞取向、扩散速率和有效刚度）方面具有重要用途。此外，这些模具在制备需要特定几何形状进行分析应用的组织时也非常有用，例如力学测试16,17。利用激光切割制备的阴模母模来加工这些装置，是一种快速、简便且低成本的方法，尤其相较于传统微加工所需的时间和成本而言更具优势。激光切割还允许更大的最大模具尺寸，仅受限于切割机工作台的尺寸。我们已成功将这些多功能模具应用于多种工程化心肌组织的研究，包括动作电位传播的光学标测、收缩力产生及被动力学特性的评估，以及在心肌梗死大鼠模型中的移植实验13,18。我们认识到，除心血管再生工程这一研究领域外，该技术在组织工程、药物递送和材料研究等领域也具有广泛的应用前景。
尽管模具本身的制备过程在技术上并无太多难点，但构建功能性组织涉及若干关键步骤。如果构建物.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院（NIH R00 HL115123）和布朗大学工程学院提供的资金支持。同时感谢布朗设计工作室和Chris Bull在激光切割机使用方面的培训与支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 项目 | |||
| 牛纤维蛋白原 | Sigma | F8630-5G | 构建物 |
| 牛凝血酶 | Sigma | T6634-250UN | 构建物 |
| 牛抑肽酶 | Sigma | 10820-25MG | 构建物 |
| 大鼠尾胶原 I，4 mg/mL | Advanced Biomatrix | 5153-100MG | 构建物 |
| 氯化钠 | Fisher | BP358-10 | 构建物 |
| PBS | Life Technologies | 14190-250 | 构建物 |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | 11252-20 | 构建物 |
| Sylgard 184 硅酮弹性体 | Corning | 4019862 | PDMS 模具 |
| 实验室胶带 | Fisher | 15-901-5R | PDMS 模具 |
| 丙烯酸，1/4" 厚 | McMaster-Carr | 8560K356 | PDMS 模具 |
| HEPES 缓冲液，1 M | Sigma | H3537-100ML | 构建物 |
| RPMI 1640 培养基，粉末 | Fisher | 31800-089 | 构建物 |
| 氯化钙二水合物 | Fisher | AC423520250 | 构建物 |
| 氯化镁六水合物 | Fisher | M33 500 | 构建物 |
| 氯化钾 | Sigma | P9541-500G | 构建物 |
| 磷酸氢二钠七水合物 | Sigma | S9390-500G | 构建物 |
| 葡萄糖 | Sigma | G5767-25G | 构建物 |
| OCT | VWR | 25608-930 | 组织学 |
| 冷冻包埋模具 | VWR | 25608-916 | 组织学 |
| 苏木精 | Fisher | 3530 1 | 组织学 |
| 伊红 Y | Fisher | AC152880250 | 组织学 |
| 快绿 FCF | Fisher | AC410530250 | 组织学 |
| 软件 | |||
| Illustrator | Adobe Systems | 矢量图形 | |
| Inkscape | (开源) | 矢量图形 | |
| UCP（通用控制面板） | Universal Laser Systems | 激光切割机接口 | |
| 设备 | |||
| PLS6.75 激光切割机 | Universal Laser Systems | 激光切割机 | |
| 微机械分析仪 | Aurora Scientific | 1530A 配 5 mN 负荷传感器 | 力学分析 |
参考文献
- Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5, 491(2010).
- Rogers, J. A., Nuzzo, R. G. Recent progress in soft lithography. Mater. Today. 8, 50-56 (2005).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E.
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重印与许可
