协同药物组合通过实验方法鉴定往往困难且耗时。本文中，我们描述了一种用于鉴定和验证协同作用小分子的方法。
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摘要
摘要
尽管抗菌药物显著延长了20世纪以来人类的寿命并提高了生活质量th 21世纪，抗菌药物耐药性威胁着全社会治疗全身性感染的能力。仅在美国，每年就有约23,000人死于抗生素耐药性感染，额外增加约200亿美元的医疗支出。应对抗菌药物耐药性的一种策略是联合疗法，这种疗法在感染早期尤为有用，此时致病微生物及其耐药谱尚未明确。许多抗菌治疗采用联合用药方案。然而，这些组合大多为相加作用，即联合疗效等于各抗生素单独疗效之和。部分联合疗法具有协同作用，即联合疗效远超相加效应。协同组合特别有价值，因为它们能够抑制耐药菌株的生长。然而，这类协同组合较为罕见且难以发现，原因在于需要两两测试的分子数量极为庞大：一个包含1,000个分子的文库可产生100万种潜在组合。因此，研究人员已致力于开发预测分子协同作用的方法。本文介绍我们用于预测协同小分子对的高通量方法，称为Overlap2 方法（O2M）。O2M利用化学遗传学数据集中的模式，识别对协同作用分子对中的每个分子表现出特异性生长抑制的突变株，而对其他分子无此反应。布朗实验室通过高通量筛选抑制突变株生长但不影响野生型细胞生长的分子，利用这种生长差异。该实验室此前已利用此策略鉴定出与抗生素甲氧苄啶及抗真菌药物氟康唑产生协同作用的分子。本文中，作者提出一种用于筛选新型协同作用组合的方法，该方法可适用于多种微生物。
引言
根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，每年由抗生素耐药性细菌引起的感染超过200万例，导致23,000人死亡1。为应对这些感染，亟需开发新的治疗方法。目前探索新疗法的策略包括研发新型抗菌药物，或将已获批用于其他疾病的药物重新用于治疗微生物感染2,3,4。然而，新药研发成本高昂且耗时漫长。药物再利用策略可能无法发现全新的药物或药物靶点5,6。本实验室专注于第三种策略，即协同组合疗法。当两种小分子联合使用时的疗效超过其各自单独疗效的相加效应时，即产生协同作用7。此外，协同组合不仅对其中一种小分子耐药的病原体仍可能有效，而且具有更少的非预期脱靶效应，因而展现出巨大的应用潜力8,9,10。
协同作用的药物组合较为罕见，仅占所有药物组合的大约4-10%11
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方案
1. 通过重叠分析从化学生物学遗传数据集中鉴定协同作用预测突变体2 方法（O2M）
注意：本方法用于利用 Nichols 发表的数据集鉴定协同作用预测突变体 等.17 在 E. coli然而，该方法可应用于任何化学遗传学数据集及微生物。这些数据集包含一个在超过100种小分子存在下培养的基因敲除突变体文库，为每种小分子中的每个突变体提供定量的生长评分。必须已知一对具有协同作用的小分子组合，且数据集中应包含这两种小分子各自的生长评分。
- 计算所有突变体在单一浓度小分子存在下生长的平均生长评分及标准差。
注意：此步骤可使用任意电子表格软件完成。Brown 实验室使用 Excel，并采用函数 =AVERAGE(B3:B3981) 和 =STDEV(B3:B3981) 计算每列小分子的数据。- 计算每列小分子的均值和标准差，不过如果使用不同的数据集，此方向可能会有所不同。
- 使用 Nichols 的相同数据集计算小分子各浓度的 Z 值 等.17 在电子表格程序中进行计算。其中，负z分数表示为 Z(2.5) = 均值 - 2.5 × 标准差，正z分数表示为 Z(....
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结果
棋盘式实验是一种用于测量协同作用的半定量方法。最终输出的评分FICI可判断药物组合是否具有协同作用（FICI ≤0.5）、无相互作用（0.5 图1展示了如何在棋盘式实验中设置药物梯度。图2展示了常见的实验结果。判断生长情况时（紫色孔），若生长抑制率低于90%，则视为有生长。在测定每块板各孔的OD600后，我们将所有数据归一化至无药物对照孔。任何归一化值>0.1（即对照孔OD600的10%）的孔均记为“生长”。FICI评分可能因所选孔的不同而变化；我们为每块板选择给出最低FICI值的孔。在图2A中，该孔为F9（列用数字编号，行用字母编号），其FICI = 0.07。在图2B中，FICI由孔C3计算得出（FICI = 1.0）。.......
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讨论
协同作用的小分子组合在治疗微生物感染方面具有巨大潜力，但由于协同作用的分子对难以发现，其临床应用潜力尚未得到充分发挥。本文介绍了一种比简单成对组合更快速识别协同作用分子对的方法。通过利用化学遗传学数据集，O2M 可识别出基因敲除的突变体，并以此作为读出系统，用于筛选大量小分子文库，从而预测具有协同作用的分子对。这种预测小分子协同作用的能力使得筛选过程具有高度可扩展性，进而实现大规模识别协同作用的配对分子。在鉴定出协同作用分子对后，可进一步阐明其协同作用背后的分子机制，并据此理性设计更多协同作用的分子组合11。
O2M 方法需要一个化学生物学基因数据集以及一个已知的协同作用配对。幸运的是，目前已有多种微生物的化学生物学基因数据集19,20,21。Brown 实验室先前已证明，O2M 能够在 C. neoformans 和 E........
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了犹他大学病理学系向 J.C.S.B. 提供的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Bioscreen C | 仪器 | Growth Curves USA | |
| Synergy H1 | 仪器 | BioTek | |
| M9 肉汤 | 试剂 | Amresco | J863-500G |
| 酪蛋白氨基酸 | 试剂 | 菲舍尔科技 | BP1424-500 |
| 葡萄糖 | 试剂 | Sigma | G7021-10KG |
| 烟酸 | 试剂 | Alfa Aesar | A12683 |
| 硫胺素 | 试剂 | Acros Organics | 148991000 |
| CaCl2 二水合物 | 试剂 | Fisher | C79-500 |
| MgSO4 七水合物 | 试剂 | Fisher | M63-500 |
| 化学遗传学数据集 | 数据集 | 示例包括 Nichols 等人，Cell，2011；Brown 等人，Cell，2014，以及文中引用的其他研究。 | |
| 甲氧苄啶（示例输入药物；可使用任意药物） | 试剂 | 菲舍尔科技 | ICN19552701 |
| 磺胺甲噁唑（示例测试药物；可使用任意药物） | 试剂 | 菲舍尔科技 | ICN15671125 |
参考文献
- Michael, C. A., Dominey-Howes, D., Labbate, M. The Antimicrobial Resistance Crisis: Causes, Consequences, and Management. Front Public Health. 2, 145(2014).
- Butts, A., Krysan, D. J. Antifungal Drug Discovery: Something Old and Something New. PLOS Pathogens....
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