高通量鉴定协同药物组合的Overlap2方法

摘要

协同药物组合通过实验方法鉴定往往困难且耗时。本文中，我们描述了一种用于鉴定和验证协同作用小分子的方法。

摘要

尽管抗菌药物显著延长了20世纪以来人类的寿命并提高了生活质量^th 21世纪，抗菌药物耐药性威胁着全社会治疗全身性感染的能力。仅在美国，每年就有约23,000人死于抗生素耐药性感染，额外增加约200亿美元的医疗支出。应对抗菌药物耐药性的一种策略是联合疗法，这种疗法在感染早期尤为有用，此时致病微生物及其耐药谱尚未明确。许多抗菌治疗采用联合用药方案。然而，这些组合大多为相加作用，即联合疗效等于各抗生素单独疗效之和。部分联合疗法具有协同作用，即联合疗效远超相加效应。协同组合特别有价值，因为它们能够抑制耐药菌株的生长。然而，这类协同组合较为罕见且难以发现，原因在于需要两两测试的分子数量极为庞大：一个包含1,000个分子的文库可产生100万种潜在组合。因此，研究人员已致力于开发预测分子协同作用的方法。本文介绍我们用于预测协同小分子对的高通量方法，称为Overlap² 方法（O2M）。O2M利用化学遗传学数据集中的模式，识别对协同作用分子对中的每个分子表现出特异性生长抑制的突变株，而对其他分子无此反应。布朗实验室通过高通量筛选抑制突变株生长但不影响野生型细胞生长的分子，利用这种生长差异。该实验室此前已利用此策略鉴定出与抗生素甲氧苄啶及抗真菌药物氟康唑产生协同作用的分子。本文中，作者提出一种用于筛选新型协同作用组合的方法，该方法可适用于多种微生物。

引言

根据美国疾病控制与预防中心（CDC）的数据，每年由抗生素耐药性细菌引起的感染超过200万例，导致23,000人死亡¹。为应对这些感染，亟需开发新的治疗方法。目前探索新疗法的策略包括研发新型抗菌药物，或将已获批用于其他疾病的药物重新用于治疗微生物感染^2,3,4。然而，新药研发成本高昂且耗时漫长。药物再利用策略可能无法发现全新的药物或药物靶点^5,6。本实验室专注于第三种策略，即协同组合疗法。当两种小分子联合使用时的疗效超过其各自单独疗效的相加效应时，即产生协同作用⁷。此外，协同组合不仅对其中一种小分子耐药的病原体仍可能有效，而且具有更少的非预期脱靶效应，因而展现出巨大的应用潜力^8,9,10。

协同作用的药物组合较为罕见，仅占所有药物组合的大约4-10%^11,12,13因此，传统的两两筛选等技术具有挑战性且耗时，仅由一百种分子组成的小型文库就可能产生数千种组合。此外，化合物的单独活性通常无法预测其协同作用。¹⁴然而，作者开发了一种高通量筛选协同作用配对的方法，称为重叠法² 方法（O2M）¹²该方法在此处进行描述，可实现对这些协同配对更快、更高效的识别。O2M方法需要利用已知的协同配对以及化学遗传学数据集。化学遗传学数据集的生成方式是：在多种不同小分子存在条件下培养一系列基因敲除突变体文库。如果已知协同配对中的一个分子，与第二个协同分子在特定基因敲除突变体中诱导出相同的表型，那么任何其他能从该相同突变体中引发该表型的小分子，也应与已知协同配对中的每个成员产生协同作用。布朗实验室已采用这一原理，用于鉴定对病原体具有活性的协同抗生素配对 大肠杆菌（Escherichia coli） 以及对致病性真菌具有协同抗真菌作用的药物组合 新型隐球菌 (C. neoformans)^11,12O2M 不仅适用于多种病原体，还可用于大规模分子文库的筛选，以快速、简便地鉴定协同作用的分子对。利用 O2M 鉴定出的遗传突变体进行筛选，可使我们仅针对预测具有协同效应的小分子进行验证。因此，若对一个包含 2,000 种分子的文库进行两两组合测试，可能需要数月时间；而若该文库中仅有 20 种分子被预测具有协同作用，则协同效应的验证仅需数天即可完成。O2M 无需编程技能，所需设备在大多数实验室或核心设施中均具备。除了关注药物组合的研究人员外，任何已完成药物筛选并希望通过对重要药物-药物相互作用的识别来拓展其筛选结果的研究者，均可受益于 O2M 分析。以下是用于在细菌中鉴定协同作用小分子，以及在已知的常用实验中验证预测协同作用的实验方案^15,16.

方案

1. 利用重叠方法（O2M）从化学生物学数据集中鉴定协同作用预测突变体²

注意：本方法用于利用 Nichols 发表的数据集鉴定协同作用预测突变体 等.¹⁷ 在 E. coli然而，该方法可应用于任何化学遗传学数据集和微生物。这些数据集包含一个在超过100种小分子存在下培养的敲除突变体文库，为每种小分子处理下的每个突变体提供定量的生长评分。分析中必须已知一对协同作用的小分子组合，且数据集中应包含这两种小分子各自的生长评分。

1. 计算所有突变体在单一浓度每种小分子存在下生长得分的平均值和标准差。
   注：此步骤可使用任意电子表格软件完成。Brown 实验室使用 Excel，通过函数 =AVERAGE(B3:B3981) 和 =STDEV(B3:B3981) 计算每列小分子的数据。
   1. 计算每列小分子的均值和标准差，但若使用不同的数据集，此方向可能有所不同。
2. 使用 Nichols et al.¹⁷ 的相同数据集，在电子表格程序中计算每种小分子各浓度的 Z 分数。其中，负 Z 分数定义为 Z(2.5) = 均值 - 2.5×标准差，正 Z 分数定义为 Z(2.5) = 均值 + 2.5×标准差。
3. 确定哪些基因突变体在构成已知协同作用配对的小分子中具有显著的 Z 分数，并确保查看这些分子的所有浓度。如果某突变体的生长得分低于该小分子的负 Z(2.5) 分数，或高于其正 Z(2.5) 分数，则视为显著。
4. 判断这些显著的基因突变体中是否有属于操纵子的。
   注：对于 E. coli，作者建议查阅“Ecoli wiki”以获取基因是否作为多顺反子 RNA 的一部分被转录的相关信息。
5. 识别在不同浓度下多数目标小分子中共同存在的基因/操纵子突变体（例如，在寻找与抗生素甲氧苄啶协同作用的分子时，识别在甲氧苄啶及其已知协同伙伴如磺甲恶唑或磺胺甲噁唑存在下均表现出显著 Z 分数的突变体）。这些即为潜在的协同作用预测突变体。

2. 利用O2M在化学遗传学数据集中预测协同作用分子

1. 返回数据集¹⁷，确定每种能够从协同作用预测突变体中引发显著生长评分的小分子浓度。此步骤通过查看为每种小分子浓度计算的Z评分来完成。同样，显著生长评分是指小于该小分子浓度对应的负Z评分或大于正Z评分的值。
   注意：如果一个分子在其任一浓度下出现显著效应，则该分子被视为预测的协同作用分子；任何未引发显著生长评分的分子则被视为预测的非协同作用分子。

3. 预测协同相互作用的验证

1. 测定预测协同剂的最小抑菌浓度（MIC）。
   1. 在37 °C下，于M9最低培养基中培养过夜的E. coli菌液。
      注意：对于目标微生物，可在适当定义的培养基中培养任何过夜菌液。Brown实验室不推荐使用LB或YPD等营养丰富的培养基。M9最低培养基的成分为：10.5 g/L M9肉汤、0.2% 酪蛋白氨基酸、0.1 M CaCl₂、0.4% 葡萄糖、1 M MgSO₄、0.25% 烟酸和0.33% 硫胺素，溶于H₂O中。
   2. 若在收到小分子化合物后，文献中未找到目标病原体的MIC数据，则将其溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成高浓度溶液（>10 mg/mL）。
   3. 使用96孔板，向每孔加入100 µL M9培养基。在第1列额外多加100 µL M9培养基，使其总量达到200 µL。
   4. 向第1列中加入任意量（约10 µL）的高浓度小分子溶液。每孔对应一种小分子（每块板可测试8种小分子）。
      注意：这些是预测具有协同作用的小分子化合物。Brown实验室通常加入10 µL高浓度小分子溶液，该体积低于可抑制E. coli生长的100% DMSO体积。
   5. 加入小分子后，沿板的x轴方向进行梯度稀释。从第1列取100 µL溶液加入第2列并混匀；再从第2列取100 µL加入第3列并混匀。依此类推，直至将100 µL加入第11列。混匀第11列后，从中取出100 µL弃去。第12列仅保留培养基，用于数据归一化。
   6. 接种培养板。取过夜培养物测定其光密度（OD₆₀₀），用培养物与M9培养基配制OD₆₀₀为0.002的菌液（或对应目标微生物每微升500个细胞的适当浓度）。用移液器向每孔加入2 µL菌液，使每孔含有1,000个细胞。
   7. 轻轻振荡培养板，测定0小时的OD₆₀₀值。将培养板置于37 °C培养24小时，测定24小时的OD₆₀₀值。
      注意：其他目标微生物应使用适当的培养条件。
   8. 使用电子表格程序计算每孔的净生长量。
   9. 计算第12列各孔净生长量的平均值，作为无药物条件下的平均生长量。使用电子表格软件将其他各孔的生长量归一化至该平均值。寻找生长抑制率低于10%的孔以确定MIC90；生长抑制率低于50%的孔指示MIC50。计算这些孔中小分子的浓度。
2. 棋盘法检测协同作用
   1. 如前所述，在M9最低培养基中培养过夜的E. coli菌液。
      注意：其他目标微生物应使用适当的培养条件。
   2. 向96孔板的每孔加入100 µL M9培养基，并在第1列额外多加100 µL。
   3. 向第1列各孔加入待测小分子（浓度约为8倍MIC），并在A1孔中加入双倍浓度（约16倍MIC）（每块板测试一种小分子）。
      注意：该浓度由先前完成的MIC实验确定，不同潜在协同剂的浓度各不相同。
   4. 通过从第1列取100 µL转移至第2列的方式，在x轴方向建立梯度稀释。依此类推，直至向第11列加入100 µL。混匀后，从第11列取出100 µL弃去。第12列不加任何药物（图1A）。
   5. 在y轴方向为输入药物建立第二梯度。向A行各孔加入含2倍MIC输入分子的培养基100 µL。混匀后如前稀释，从A行取100 µL加入B行，依此类推直至G行。混匀后取100 µL弃去，确保H行不加任何输入药物。这样可使H行和第12列分别包含所测试药物组合各自的MIC（图1B）。
   6. 接种培养板。向每孔加入2 µL OD₆₀₀为0.002的E. coli菌液（每孔1,000个细胞）。
   7. 测定每孔0小时的OD₆₀₀值。
   8. 将培养板在37 °C孵育24小时。
   9. 测定24小时后每孔的OD₆₀₀值。
3. 根据棋盘实验计算部分抑菌浓度指数（FICI）
   1. 在电子表格程序中，通过将24小时OD₆₀₀值减去0小时OD₆₀₀值，计算每孔的净生长量。
   2. 在软件中通过将每孔生长量除以H12孔（不含小分子）的生长量进行归一化处理。
   3. 在第12列中找出输入分子的MIC90，在H行中找出潜在协同剂的MIC90。
   4. 查找所有抑制生长达90%的孔。
   5. 使用以下公式计算FICI90，选择低于（协同作用）或高于（拮抗作用）两个MIC90值最显著的孔：
      
   6. 将FICI ≤ 0.5视为协同作用，FICI ≥ 4视为拮抗作用（图2）。
      注意：也可使用MIC50（生长抑制50%）计算基于这些MIC值的FICI50。
4. Bliss独立性实验
   注意：对自身无MIC的潜在协同剂进行Bliss独立性实验。
   1. 如前所述，在37 °C下于M9培养基中培养过夜的E. coli菌液。
      注意：此步骤中也可使用其他目标微生物的适当培养条件。
   2. 准备96孔板，用于测试潜在协同分子、输入分子、联合用药组及未处理对照组。
   3. 制备潜在协同剂板：向每孔加入50 µL M9培养基。向某一行各孔加入含固定浓度（10 µM或100 µM）潜在协同剂的培养基50 µL。每块板可测试8种分子。
   4. 制备输入分子板：向每孔加入50 µL培养基。向第1列各孔加入含4倍MIC输入药物的溶液50 µL。沿x轴方向进行梯度稀释，从第1列取50 µL分散并混入第2列。依此类推至第12列，从第12列弃去50 µL。再向每孔额外加入50 µL培养基，使每孔终体积为100 µL。
   5. 制备联合用药板：使用96孔板，向每孔加入50 µL培养基。向第1列各孔加入含4倍MIC输入药物的溶液50 µL。沿x轴方向稀释，从第1列取50 µL分散并混入第2列。依此类推至第12列，从第12列弃去50 µL。向某一行各孔加入含潜在协同剂（10 µM或100 µM）的培养基50 µL。每行对应一种浓度或药物。
   6. 制备未处理对照：向板中所有孔加入100 µL M9培养基。
   7. 接种所有板：如前所述，向每孔加入2 µL OD₆₀₀为0.002或每孔1,000个细胞的细菌菌液。
   8. 测定每孔0小时和24小时的OD₆₀₀值。
5. 计算Bliss独立性评分
   1. 使用电子表格程序，通过将24小时生长量减去0小时OD₆₀₀值，计算每孔的净生长量。
   2. 在电子表格程序中将各孔生长量归一化至无药物对照板的平均生长量。
   3. 使用电子表格软件，通过从1减去净生长量计算抑制率。
   4. 在电子表格软件中对仅含输入梯度的对照板各列取平均值。
   5. 按以下公式计算每孔的Bliss评分：
      Bliss评分 = (某孔X + 输入列X) – 联合孔X
   6. 在输入药物MIC90以下的孔中寻找负值评分。
      注意：多个浓度下出现负值评分表明存在协同作用。

4. 利用协同作用预测突变体进行高通量筛选以鉴定新型协同作用配对

1. 鉴定协同作用预测突变体
   注意：步骤1.5已鉴定出潜在的协同作用预测突变株。在此，我们确定其中哪些突变株最适合用于高通量筛选协同药物。本实验在Bioscreen仪器中进行，但使用96孔板读板仪也应可行。
   1. 在M9最小培养基中培养每种推测的协同作用预测突变株和野生型细胞。
   2. 在100孔蜂窝板（或96孔板）中分别加入适当的生长培养基、含待测药物的生长培养基、含该待测药物已知协同作用配对药物的生长培养基，以及含已知非协同作用药物的生长培养基。需设置相应的溶剂对照组。
      注意：我们建议每种菌株/药物/浓度设置四个重复孔。
   3. 每孔接种1,000个细胞，包括空白对照孔。
   4. 37 °C 摇床培养 48 小时，测定 OD₆₀₀ 每20分钟一次
   5. 确定在输入药物及其已知协同作用伙伴药物存在的情况下，野生型细胞与协同作用预测突变细胞之间生长差异最大的药物浓度和时间点。在最佳时间点和浓度下，当细胞在已知不与输入药物产生协同作用的药物存在条件下培养时，野生型细胞与协同作用预测突变细胞之间的生长差异应较小。图3).
2. 高通量筛选协同作用药物
   1. 在M9最小培养基中培养野生型细胞和协同作用预测突变细胞。
      注意：使用适合目标生物的适当生长培养基。
   2. 将文库中的药物加入培养基中，使每孔含有100 µL培养基，并含有上一步确定浓度的小分子化合物。设置不含细胞的空白孔以及含载剂对照的孔（vehicle controls）.，DMSO）以排除药物稀释载体对细胞生长的抑制作用。
      1. 每块板至少准备四个溶剂对照孔，理想情况下应分散分布在板上，以消除孔位位置效应的影响。如果检测结果变异性较大，则每行/每列至少包含一个溶剂对照孔，并以每行/每列的对照孔作为控制，用于计算该行/该列的Z分数，而非整块板的Z分数（步骤4.2.5）。
   3. 向每个孔中加入 2 µL 培养物，操作同前。（一个平板用于野生型细菌，一个平板用于预测具有协同作用的突变型细菌）。
   4. 测定 OD₆₀₀ 0 和 18 小时时 E. coli 或 48 小时 C. neoformans.
   5. 使用电子表格软件，通过从OD值中减去初始OD值来计算净增长量₆₀₀ 从空白孔中扣除溶剂对照孔的数值。筛选Z分数为-2.5的孔（Z分数 = 均值 - 2.5×标准差）。这些孔中含有潜在的协同作用小分子。
   6. 使用第3步中概述的方法验证筛选结果。

结果

棋盘法是一种用于测量协同作用的半定量方法。最终输出的评分FICI可判断药物组合是否具有协同作用（FICI ≤0.5）、无相互作用（0.5 图1展示了如何在棋盘实验中设置药物浓度梯度。图2展示了常见的实验结果。判断生长情况（紫色孔）时，以抑制率低于90%为标准。在测定每孔的OD₆₀₀值后，我们将所有数据归一化至无药物对照孔。归一化值大于>0.1（即对照孔OD₆₀₀值的10%）的孔记为“生长”。FICI评分可能因所选孔位不同而变化；我们为每块板选择FICI值最低的孔。在图2A中，该孔为F9（列用数字编号，行用字母编号），其FICI = 0.07。在图2B中，FICI由C3孔计算得出（FICI = 1.0）。对于拮抗作用，应寻找可...

讨论

协同作用的小分子组合在治疗微生物感染方面具有巨大潜力，但由于协同作用的分子对难以发现，其临床应用潜力尚未得到充分发挥。本文介绍了一种比简单成对组合更快速识别协同作用分子对的方法。通过利用化学遗传学数据集，O2M 可识别出基因敲除的突变体，并以此作为读出系统，用于筛选大量小分子文库，从而预测具有协同作用的分子对。这种预测小分子协同作用的能力使得筛选过程具有高度可扩展性，进而实现大规模识别协同作用的配对分子。在鉴定出协同作用分子对后，可进一步阐明其协同作用背后的分子机制，并据此理性设计更多协同作用的分子组合¹¹。

O2M 方法需要一个化学生物学基因数据集以及一个已知的协同作用配对。幸运的是，目前已有多种微生物的化学生物学基因数据集^19,20,21。Brown 实验室先前已证明，O2M 能够在 C. neoformans 和 E....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bioscreen C	仪器	Growth Curves USA
Synergy H1	仪器	BioTek
M9 肉汤	试剂	Amresco	J863-500G
酪蛋白氨基酸	试剂	菲舍尔科技	BP1424-500
葡萄糖	试剂	Sigma	G7021-10KG
烟酸	试剂	Alfa Aesar	A12683
硫胺素	试剂	Acros Organics	148991000
CaCl2 二水合物	试剂	Fisher	C79-500
MgSO4 七水合物	试剂	Fisher	M63-500
化学遗传学数据集	数据集	示例包括 Nichols 等人，Cell，2011；Brown 等人，Cell，2014，以及文中引用的其他研究。
甲氧苄啶（示例输入药物；可使用任意药物）	试剂	菲舍尔科技	ICN19552701
磺胺甲噁唑（示例测试药物；可使用任意药物）	试剂	菲舍尔科技	ICN15671125