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方法文章

一种在标准化生物力学条件下分析小鼠软骨内骨折愈合的微创模型

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DOI：

10.3791/57255

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2018年3月22日

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1Department of Trauma, Hand and Reconstructive Surgery, Saarland University, 2Institute for Clinical & Experimental Surgery, Saarland University

本文内容

摘要

本方案描述了一种使用髓内螺钉进行股骨骨折标准化固定的微创接骨技术，可用于分析小鼠的软骨内成骨愈合过程。

摘要

为了改进临床骨折治疗，有必要建立骨愈合模型以分析骨折愈合的复杂机制。近十年来，小鼠模型在骨科研究中的应用显著增加，很可能是因为小鼠模型具有大量基因修饰品系和特异性抗体，可用于分析骨折愈合的分子机制。为了控制生物力学条件，在小鼠中也必须采用经过充分表征的骨固定技术。本文报道了一种用于稳定小鼠股骨骨折的闭合性骨愈合模型的设计与应用。该髓内螺钉由医用级不锈钢制成，通过骨折端加压，提供轴向和旋转稳定性，而目前常用的简单髓内针则几乎不具备轴向和旋转稳定性。髓内螺钉所提供的稳定性使得软骨内成骨愈合过程得以分析。使用螺钉固定后可形成大量骨痂组织，为生化和分子分析提供了理想的组织来源。使用螺钉的另一优势在于，可通过微创技术将其置入股骨，且不会对软组织造成损伤。综上所述，该螺钉是一种独特的植入物，非常适合用于闭合性骨折愈合模型，可提供标准化的生物力学条件。

引言

由于存在大量可用的抗体和基因修饰动物，小鼠骨愈合研究需求广泛，这些条件使得研究骨愈合的分子机制成为可能1。近年来，已开发出多种适用于小鼠的骨愈合模型2。这些模型可分为开放性模型和闭合性模型：在开放性模型中，通过外侧开放手术方式对骨骼进行截骨；而在闭合性模型中，则基于Bonnares和Einhorn提出的骨折模型，采用闭合方式造成骨折3。利用该技术，可通过三点弯曲装置产生标准化的横行骨折，并通过内侧髌旁小切口以微创技术插入髓内植入物，从而避免严重的软组织损伤。

髓内螺钉可用于小鼠闭合性骨折的固定。该螺钉可提供旋转稳定性和轴向稳定性，这是通过近端螺纹和远端头部对骨折部位施加加压而实现的4。螺钉的其他优势还包括手术技术简单、侵入性程度低、植入物重量轻，尤其是与其它髓内植入物相比，具有更高的稳定性，可提供标准化且可控的生物力学条件5。事实上，在大多数闭合性骨折模型中，骨片段仅由简单的针固定，这种方式完全缺乏旋转和轴向稳定性，且存在针移位和骨折再移位的高风险。这可能显著影响愈合过程，导致愈合延迟或骨不连形成。

众所周知，骨折固定的稳定性对愈合过程具有巨大影响6,7。高刚性固定会导致膜内成骨愈合，而较低刚性的固定（可能允许骨折间隙发生微动）则会引发软骨内成骨愈合。采用髓内螺钉固定骨折时，主要表现为软骨内成骨愈合，并形成大量骨痂组织，尤其是在骨折愈合2周后更为明显。大量获取骨痂组织的可能性，使得能够通过多种技术对多个参数进行分析。

本文报道了小鼠髓内螺钉的设计及其应用，以及其在正常软骨内骨愈合实验研究中的优势与局限性。

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方案

所有操作均按照美国国立卫生研究院关于实验动物使用指南进行，并遵循机构指南（德国萨尔布吕肯消费者保护局，官方兽医服务中央机构）。

1. 外科手术器械和植入物的准备

  1. 从显微外科器械盒中选取一把手术刀片（15号）、一个小棉签、精细镊子、27 G针头、不可吸收的5-0缝线、剪刀和持针器。
  2. 取出髓内螺钉、导针（直径0.3/0.2 mm，长度10 cm）、中心定位钻头（直径0.5 mm）和手动钻（图1；参见材料表）。
    注意：髓内螺钉（直径0.5 mm，长度17.2 mm）由医用级不锈钢制成，用于逆行植入股骨。该螺钉近端为螺纹部分（直径0.5 mm，长度4 mm），尖端带有一个鼻部结构（直径0.2 mm，长度0.4 mm），远端为锥形头部（直径0.8 mm，长度0.9 mm），可实现骨折端加压以及轴向和旋转稳定性。
  3. 将植入物及所有手术器械置于消毒液（96%酒精）中浸泡5分钟，或进行灭菌处理（蒸汽灭菌，130 °C，25分钟）。消毒或灭菌后，将器械放置于手术布上，并将手术布紧邻小动物手术台摆放。

2. 动物、麻醉与镇痛

  1. 根据研究问题选择合适品系、年龄和性别的小鼠。
    注：本研究使用12至14周龄的雄性CD-1小鼠。适用于植入髓内螺钉的合适体重范围为25–35 g。
  2. 通过腹腔注射15 mg/kg的赛拉嗪和75 mg/kg的氯胺酮对小鼠进行麻醉。通过夹趾反应确认麻醉效果。使用眼用润滑剂保护动物在麻醉期间的眼睛，防止角膜干燥。麻醉诱导后，将小鼠置于加热灯下以维持恒定的体温。 手术过程中需反复进行夹趾测试，以确保麻醉深度适当。
  3. 术前第1天至术后第3天，在饮水中添加盐酸曲马多（1.0 mg/mL）以提供镇痛。
    注：镇痛和感染预防措施应符合实验所在国家和机构的相关指南要求。

3. 手术操作与髓内螺钉植入

  1. 手术前，剃除右侧后肢整个腿部的毛发，并涂抹脱毛膏。5分钟后，去除脱毛膏并用清水清洗腿部，随后使用含96%酒精的消毒液进行消毒。 可向酒精中添加聚维酮碘或氯己定，以确保完全无菌。
  2. 在无菌条件下，将小鼠仰卧位固定于小型动物手术台上。弯曲右膝，以便从前侧接近膝关节髁部。使用手术刀片在右膝处作一长约5 mm的髌旁内侧切口。
  3. 使用手术刀片和棉签小心游离髌韧带，然后用精细镊子将髌骨向侧方移位，以暴露股骨髁间窝。
  4. 在股骨两髁之间的髁间窝正中央打开骨道，钻孔深度不得超过1.0 mm。
    1. 使用0.5 mm中心定位钻头和手钻，从股骨轴线前侧偏转45°开始手动钻孔（图1C 和 D，图2）。钻孔过程中，持续减小角度至0°偏转（与股骨骨轴平行）。当钻孔深度达到1.0 mm时停止钻孔。
  5. 在髁间窝处打开骨皮质后，将27 G针头沿整个股骨长度插入骨髓腔。通过27 G针头的旋转动作手动扩髓。向前推进针头，穿透近端大转子处的皮质骨。
  6. 取出27 G针头，将导丝经股骨远端插入。
    1. 在导丝近端上方使用手术刀片（15号）做皮肤切口，并推进导丝，直至其两端均露出体外。确保导丝保持原位不动。
  7. 使用落锤装置制造标准闭合性骨折。
    1. 将小鼠置于侧卧位，右腿置于落锤装置下方，确保股骨干部分位于落锤装置中央。
    2. 从25.5 cm的固定高度释放重锤（200 g）。
  8. 使用X射线成像设备（参见材料表）检查骨折形态、骨折位置以及导丝的位置（图3）。
  9. 将髓内螺钉远端的接头连接至0.2 mm导丝，并在持续加压和顺时针旋转下将其插入股骨。
    1. 当达到足够扭矩时，驱动轴自动剪切断开。
    2. 从近端取出导丝。
  10. 复位髌骨，并使用5-0合成单丝不可吸收聚丙烯缝线单针缝合将髌腱固定于肌肉上。使用相同材质和规格的单针缝线逐层关闭切口。使用X射线成像设备（参见材料表）进行影像学检查，确认骨折块复位情况及螺钉位置。
  11. 将动物置于加热灯下直至从麻醉中恢复。在动物未完全恢复意识、无法维持腹侧卧位前，不得离开看护。将动物送回动物房的单笼饲养。即使动物已完全清醒，术后最初24小时内不得与其他动物合笼饲养。
  12. 每日密切观察动物状态。术后前三天，在饮水中添加盐酸曲马多（剂量为1.0 mg/mL）以维持术后镇痛。若术后第4天动物仍表现出疼痛迹象（如发声、躁动、活动减少、不梳理毛发、异常姿势或对周围环境缺乏正常兴趣），则继续给予镇痛治疗。当动物完全无痛时，停止镇痛。
  13. 实验结束时，通过过量巴比妥类药物处死 动物。

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结果

从皮肤切开到伤口闭合的手术操作时间为20分钟。该手术无需使用体视显微镜即可完成。术后每日对动物进行监测。术后镇痛在2天后停止，因为此后所有动物均未表现出疼痛迹象。动物在术后2天内也恢复了正常的负重能力。在整个观察期间未发现伤口感染。

2周后的影像学分析显示，骨折间隙处有明显的骨痂组织形成并连接两端（图4A）。5周后，骨折已愈合，骨膜骨痂几乎完全重塑（图4B）。

骨折后2周对骨痂和骨折区域进行的组织学分析显示，软骨内骨愈合具有典型的组织分布特征，即在软骨形成过程中生成软骨组织，并形成编织骨（图5A）。5周后，软骨组织逐渐消失，编织骨转化为板层骨，以重建骨正常...

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讨论

手术过程中的关键步骤包括：在股骨髁间切迹中部找到螺钉植入的正确进针点，以及在扩髓时使导针方向与骨轴平行以获得最佳角度。为避免进针位置错误，术者应充分显露切迹，直至获得最佳视野。在扩髓过程中为控制方向，应用手指稳固地固定小鼠股骨。另一个关键步骤是沿导丝将螺钉插入股骨，因为导丝可能从近端骨块中滑脱，导致骨折移位。此时，术者可尝试重新对合骨块，但该操作大多不成功，此类动物需从研究中剔除。

此外，手术过程可能会出现一些并发症。例如，为了获得股骨髁的较佳视野而向外侧移位的髌韧带可能发生断裂，这需要在植入螺钉后对韧带进行缝合。在打开股骨髁部位以及扩髓腔的过程中，股骨髁可能发生爆裂。此种情况下无法进行补救，因为螺钉无法在远端有效固定，骨折端的加压也无法实现。另一种并发症是植入的导针发生脱位或位置偏离骨组织。通过谨慎操作，并在导针植入后进行放射影像学分析以确认其正确位置，可降低此类并发症的发生。此外，外科医生应注意确保螺钉完全植入，因为螺钉突出可能限制小鼠的活动能力或减弱骨折端的加压效果。因此，手术过程中必须配备X射线设备。只有在手术结束时经放射影像学确认无误的动物，方可纳入研究方案。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作由瑞士达沃斯的 RISystem AG 资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
小鼠螺钉RISystem AG221,100
导丝RISystem AG521,100
定位钻头RISystem AG590,205
手动钻RISystem AG390,130
棉签（150 mm，小头）Fink Walter GmbH8822428
缝合线（5-0 Prolene）Ethicon8614H
镊子Braun Aesculap AG &CoKGBD520R
剪刀Braun Aesculap AG &CoKGBC100R
持针器Braun Aesculap AG &CoKGBM024R
27 G 针头Braun Melsungen AG9186182
15 号手术刀片Braun Aesculap AG &CoKG16600525
加热辐射器Sanitas605.25
脱毛膏Asid bonz GmbHNDXZ10
眼用润滑剂Bayer Vital GmbH2182442
赛拉嗪Bayer Vital GmbH1320422
氯胺酮Serumwerke Bernburg7005294
曲马多Grünenthal GmbH2256241
消毒液（SoftaseptN）Braun Melsungen AG8505018
CD-1 小鼠Charles River22
X 射线成像设备Faxitron MX-20, Faxitron X-ray Corporation2321A0988
小型骨折造模装置RISystem AG891,100

参考文献

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