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方法文章

一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

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DOI：

10.3791/57258

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2018年1月25日

 , 
1Department of Biology, California State University, Northridge

本文内容

摘要

我们开发了一种简单高效的方案，用于制备大量大豆原生质体，以研究活细胞中复杂的调控和信号传导机制。

摘要

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是一种重要的农作物，已成为研究遗传和生化途径的豆科植物模式物种。因此，建立一种高效的大豆瞬时基因表达系统具有重要意义。本文报道了一种简单的大豆原生质体制备方法及其在瞬时功能分析中的应用。我们发现，从大豆幼苗的幼嫩单叶可获得大量高质量的原生质体。通过优化聚乙二醇-钙介导的转化方法，利用大豆单叶原生质体实现了高效的转化效率。该系统为在活体大豆细胞中研究复杂的调控和信号传导机制提供了一个高效且多功能的模型，有助于更深入地理解豆科植物多样的细胞、发育和生理过程。

引言

原生质体是去除了细胞壁的植物细胞。由于它们保留了植物细胞的大部分特征和活性，原生质体是观察和评估多种细胞事件的良好模型系统，也是研究体细胞杂交1和植物再生2的重要工具。原生质体还被广泛用于植物转化3,4,5，因为细胞壁会阻碍DNA进入细胞。原生质体具备完整植株的部分生理响应和细胞过程，因此在基础研究中具有重要意义，可用于活细胞中亚细胞蛋白定位6,7,8、蛋白质-蛋白质相互作用9,10以及启动子活性11,12,13的研究。

植物原生质体的分离最早于1960年被报道14 原生质体的分离与转化方案均已建立并优化。标准的原生质体分离流程包括将叶片切碎后进行酶解消化细胞壁，随后将释放出的原生质体与未消化的组织碎片分离。转化策略包括电穿孔法15,16，显微注射17,18，以及基于聚乙二醇（PEG）的4,5,19 方法。已有大量物种成功用于原生质体分离，包括柑橘属20，芸薹属21，茄科22 及其他观赏植物科23,24尽管在不同物种中使用了多种组织类型，但一种瞬时表达系统在 拟南芥 模式植物叶片中分离的叶肉原生质体（TEAMP） 拟南芥 已得到充分证实25 并已广泛应用于多种领域。

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是最重要的蛋白质和油料作物之一26。与拟南芥和水稻不同，获得转基因大豆植株被认为相当困难且效率较低。农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的侵染方法已广泛用于烟草表皮细胞27以及拟南芥幼苗28,29中的瞬时基因表达研究，而根癌农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）则被用于大豆毛状根的转化30。病毒诱导的基因沉默技术已被用于系统性地下调目标基因31,32以及实现瞬时表达33。原生质体为这些方法提供了宝贵而灵活的替代方案。大豆地上部分材料可被用于制备原生质体，并实现快速且同步的外源基因表达。然而，自1983年首次成功分离大豆原生质体以来34，有关大豆原生质体应用的报道仍十分有限35,36,37,38，主要原因是大豆原生质体的产量相对较低。

本文介绍了一种简单高效的分离大豆原生质体的实验方案及其在瞬时基因表达研究中的应用。利用大豆幼苗的幼嫩单叶，我们可在数小时内获得大量具有活性的原生质体。此外，我们优化了一种聚乙二醇-钙介导的转化方法，该方法操作简便、成本低廉，可高效地将DNA导入大豆原生质体中。

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方案

1. 植物的培养

  1. 在温室中，于长日照条件（16 小时光照，光强 1,500 µmol m-2 s-1）、25 °C 下，将 5 - 10 粒大豆种子（Williams 82）播种于 13 cm 的花盆中，使用自制的大豆专用土壤混合物（土壤、珍珠岩和粗砂按 1:1:1 比例混合）。

2. 质粒DNA的制备

  1. 使用无菌的移液枪头或牙签，挑取一个携带含有目的基因质粒的 E. coli 单菌落或冻存的甘油菌种，接种于装有20 mL添加适当抗生素的Luria-Bertani（LB）液体培养基的50 mL锥形瓶中。
  2. 将锥形瓶置于37 °C摇床中过夜培养。于室温下以12,000 × g 离心5分钟收集菌体，弃去上清液。按照质粒提取试剂盒的制造商操作步骤提取并纯化质粒。

3. 原生质体分离

  1. 从10日龄的大豆幼苗上剪取新展开的单叶（图1）。
    注意：选择处于适当发育阶段的叶片是成功制备大豆原生质体的关键。仅使用刚刚展开、处于早期发育阶段的叶片。随着叶片成熟，细胞壁将更难消化。
  2. 用新的剃须刀片去除单叶的主脉，然后将剩余部分切成0.5–1 mm宽的条状。
    注意：两片单叶在10 mL酶解液中消化可获得足够进行10次以上转化的原生质体。
  3. 用镊子立即将叶条轻柔地转移至15 mL离心管中含10 mL新鲜配制的酶解液（Table 1）的溶液中，在室温下进行真空浸润15分钟。
  4. 在室温、弱光条件下，将叶条在酶解液中以轻微振荡（40 rpm）孵育4–6小时。确保随着原生质体释放，酶解液逐渐变为黄绿色。在显微镜下（×10）观察酶解液/原生质体混合液。
    注意：释放出的原生质体呈球形，而未消化的细胞则呈不规则或椭圆形。
  5. 将10 mL酶解液/原生质体混合液轻柔倾倒入50 mL离心管中，加入10 mL室温W5溶液（Table 1）以终止消化反应。轻轻颠倒混匀数次。将混合液缓慢倾倒在置于50 mL离心管口的洁净75 µm尼龙筛网上，以去除未消化的叶组织。
  6. 将滤过的酶解液/原生质体溶液在50 mL离心管中以100 × g离心1–2分钟（室温）。使用10 mL血清移液管小心吸除上清液，避免扰动原生质体沉淀。
  7. 在显微镜下（×10）使用血细胞计数板计数原生质体数量，用4 °C预冷的W5溶液将原生质体重悬并稀释至浓度为2 × 105 mL-1。将原生质体置于冰上静置30分钟。
  8. 在室温下以100 × g离心悬液1–2分钟，用1 mL移液器小心吸除W5溶液，避免扰动原生质体沉淀。将原生质体在室温下用MMG溶液（Table 1）重悬，调整浓度至2 × 105 mL-1。

4. 原生质体转化

  1. 制备原生质体的100 µL分装液（2 x 104 原生质体在 2 x 105 mL-1) 加入1.5 mL低吸附微量离心管中，使用未剪切的200 µL吸头进行吹打。留出一份等分试样作为阴性对照。向其余每份原生质体等分试样中加入10 µL质粒（10–20 µg）。
  2. 缓慢加入 110 µL 新鲜配制的 PEG 溶液（表1将溶液加入1.5 mL微量离心管内壁，然后轻轻倒置并旋转管子，直至溶液混合均匀。
  3. 将转化混合物在室温下孵育15分钟。
  4. 为终止转化，于室温下缓慢向1.5 mL离心管中加入400 µL W5溶液，轻轻颠倒混匀直至溶液呈均一状态。于室温下以100 g离心1–2 min，随后用移液器弃去上清液。
  5. 加入1 mL WI溶液（表1将溶液加入管中，轻轻吹吸1-2次以重悬。在6孔组织培养板的每孔中加入1 mL 5%（vol/vol）无菌小牛血清，以包被表面，防止原生质体黏附于孔板。
  6. 数秒后，用移液器弃去小牛血清。将重悬的原生质体转移至培养板的孔中。用盖子盖好培养板。

5. 原生质体孵育与收集

  1. 将原生质体在室温下避光孵育1-2天。
    注意：我们发现，与孵育1天相比，孵育2天通常可获得更强的荧光蛋白信号，且荧光蛋白信号可持续达3-4天。
  2. 将原生质体溶液转移至1.5 mL低吸附微量离心管中。在室温下以100 × g离心1-2分钟以收集原生质体。用移液器吸除上清液，并将10 µL原生质体转移至载玻片上。
  3. 在荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察荧光信号。以未转染的原生质体作为阴性对照（不应观察到信号）。

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结果

对10日龄大豆的不同器官进行了原生质体分离实验（图1），并在显微镜下观察了原生质体产量（图2）。下胚轴和上胚轴的细胞壁几乎无法被消化，部分细胞仍相互粘连（图2B、2C）。子叶（图2D）和根（图2A）中仅少数细胞的细胞壁被去除。相比之下，使用单叶时观察到大量原生质体（图2E–G）。进一步检测了处于不同发育阶段的单叶（图2H）。未展开和刚展开的单叶均能获得较高的原生质体产量，但来自刚展开单叶的原生质体大小更为均一（图2F），而未展开单叶产...

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讨论

本实验方案经过我们实验室的充分验证，适用于大豆原生质体的分离及瞬时表达研究，效果良好。该方法操作简便，仅需常规设备且成本低廉。与此前报道的方法相比，本方案可获得大量均一且高质量的原生质体34,35,36,37,38。然而，由于影响原生质体产量和转化效率的因素较多，强烈建议研究人员根据自身的实验条件、目标结果及所用材料对实验条件进行优化。该系统虽非常适用于研究植物细胞中即时的调控和生化事件，但不适用于观察长期的细胞过程以及组织或个体水平上的生物学事件。

我们发现，在理想发育阶段选择生长旺盛的植物材料是大豆原生质体分离过程中最关键的环节。这不仅决定了原生质体的产量，还影响其质量，进而影响后续的DNA转化效率。大豆植株必须始终在稳定的环境中培养，避免遭受干旱、水涝、...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国国家科学基金会植物基因组研究计划（NSF-PGRP-IOS-1339388）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
MES西格玛奥德里奇M8250-100G
纤维素酶 CELF沃辛顿生物公司LS002611
果胶酶 Y-23BioWorld9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10yakult10g
MACEROZYME R-10yakult10g
甘露醇ICN 生物医学公司152540
CaCl2费希尔C79-500g
BSANEBR3535S
DTT西格玛奥德里奇D5545-5G
NaCl西格玛奥德里奇S7653-1kg
KCl费希尔P217-500g
MgCl2西格玛奥德里奇M8266-100g
PEG4000Fluka81240
尼龙筛网Carolina652222N
组织培养板USA ScientificCC7682-7506
剃须刀片费希尔12-640
血细胞计数板hausserscientific1483
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27104
EZNA 质粒小提试剂盒OmegaD6942-01
GeneJET 质粒小提试剂盒Thermo ScientificK0502
离心机 5810eppendorf5811000827
离心机 5424eppendorf22620401
Jencons Powerpette Plus 移液控制器Jencons14526-202
蔡司 710 共聚焦显微镜ZeissN/A
无粘性、无 RNase 微量离心管，1.5 mLAmbionAM12450
15 mL 离心管DenvilleC1018-P
50 mL 离心管DenvilleC1060-P
新生小牛血清Thermo Scientific16010159
土壤Ingram's Nursery
珍珠岩Vigoro100521091
鱼雷砂JKS Ventures
LB 肉汤，Lennox（粉末）费希尔BP1427-500

参考文献

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