一种简易的大豆原生质体分离方法及其在瞬时基因表达分析中的应用

摘要

我们开发了一种简单高效的方案，用于制备大量大豆原生质体，以研究活细胞中复杂的调控和信号传导机制。

摘要

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是一种重要的农作物，已成为研究遗传和生化途径的豆科植物模式物种。因此，建立一种高效的大豆瞬时基因表达系统具有重要意义。本文报道了一种简单的大豆原生质体制备方法及其在瞬时功能分析中的应用。我们发现，从大豆幼苗的幼嫩单叶可获得大量高质量的原生质体。通过优化聚乙二醇-钙介导的转化方法，利用大豆单叶原生质体实现了高效的转化效率。该系统为在活体大豆细胞中研究复杂的调控和信号传导机制提供了一个高效且多功能的模型，有助于更深入地理解豆科植物多样的细胞、发育和生理过程。

引言

原生质体是去除了细胞壁的植物细胞。由于它们保留了植物细胞的大部分特征和活性，原生质体是观察和评估多种细胞事件的良好模型系统，也是研究体细胞杂交¹和植物再生²的重要工具。原生质体还被广泛用于植物转化^3,4,5，因为细胞壁会阻碍DNA进入细胞。原生质体具备完整植株的部分生理响应和细胞过程，因此在基础研究中具有重要意义，可用于活细胞中亚细胞蛋白定位^6,7,8、蛋白质-蛋白质相互作用^9,10以及启动子活性^11,12,13的研究。

植物原生质体的分离最早于1960年被报道¹⁴....

方案

1. 植物的培养

1. 在温室中，于长日照条件（16 小时光照，光强 1,500 µmol m^-2 s^-1）、25 °C 下，将 5 - 10 粒大豆种子（Williams 82）播种于 13 cm 的花盆中，使用自制的大豆专用土壤混合物（土壤、珍珠岩和粗砂按 1:1:1 比例混合）。

2. 质粒DNA的制备

1. 使用无菌的移液枪头或牙签，挑取一个携带含有目的基因质粒的 E. coli 单菌落或冻存的甘油菌种，接种于装有20 mL添加适当抗生素的Luria-Bertani（LB）液体培养基的50 mL锥形瓶中。
2. 将锥形瓶置于37 °C摇床中过夜培养。于室温下以12,000 × g 离心5分钟收集菌体，弃去上清液。按照质粒提取试剂盒的制造商操作步骤提取并纯化质粒。

3. 原生质体分离

1. 从10日龄的大豆幼苗上剪取新展开的单叶（图1）。
   注意：选择处于适当发育阶段的叶片是成功制备大豆原生质体的关键。仅使用刚刚展开、处于早期发育阶段的叶片。随着叶片成熟，细胞壁将更难消化。
2. 用新的剃须刀片去除单叶的主脉，然后将剩余部分切成0.5–1 mm宽的条状。
   注意：....

结果

对10日龄大豆的不同器官进行了原生质体分离实验（图1），并在显微镜下观察了原生质体产量（图2）。下胚轴和上胚轴的细胞壁几乎无法被消化，部分细胞仍相互粘连（图2B、2C）。子叶（图2D）和根（图2A）中仅少数细胞的细胞壁被去除。相比之下，使用单叶时观察到大量原生质体（图2E–G）。进一步检测了处于不同发育阶段的单叶（图2H）。未展开和刚展开的单叶均能获得较高的原生质体产量，但来自刚展开单叶的原生质体大小更为均一（图2F），而未展开单叶产.......

讨论

本实验方案经过我们实验室的充分验证，适用于大豆原生质体的分离及瞬时表达研究，效果良好。该方法操作简便，仅需常规设备且成本低廉。与此前报道的方法相比，本方案可获得大量均一且高质量的原生质体^{34,35,36,37,38}。然而，由于影响原生质体产量和转化效率的因素较多，强烈建议研究人员根据自身的实验条件、目标结果及所用材料对实验条件进行优化。该系统虽非常适用于研究植物细胞中即时的调控和生化事件，但不适用于观察长期的细胞过程以及组织或个体水平上的生物学事件。

我们发现，在理想发育阶段选择生长旺盛的植物材料是大豆原生质体分离过程中最关键的环节。这不仅决定了原生质体的产量，还影响其质量，进而影响后续的DNA转化效率。大豆植株必须始终在稳定的环境中培养，避免遭受干旱、水涝、.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MES	西格玛奥德里奇	M8250-100G
纤维素酶 CELF	沃辛顿生物公司	LS002611
果胶酶 Y-23	BioWorld	9033-35-6
CELLULASE "ONOZUKA" R-10	yakult	10g
MACEROZYME R-10	yakult	10g
甘露醇	ICN 生物医学公司	152540
CaCl2	费希尔	C79-500g
BSA	NEB	R3535S
DTT	西格玛奥德里奇	D5545-5G
NaCl	西格玛奥德里奇	S7653-1kg
KCl	费希尔	P217-500g
MgCl2	西格玛奥德里奇	M8266-100g
PEG4000	Fluka	81240
尼龙筛网	Carolina	652222N
组织培养板	USA Scientific	CC7682-7506
剃须刀片	费希尔	12-640
血细胞计数板	hausserscientific	1483
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒	Qiagen	27104
EZNA 质粒小提试剂盒	Omega	D6942-01
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0502
离心机 5810	eppendorf	5811000827
离心机 5424	eppendorf	22620401
Jencons Powerpette Plus 移液控制器	Jencons	14526-202
蔡司 710 共聚焦显微镜	Zeiss	N/A
无粘性、无 RNase 微量离心管，1.5 mL	Ambion	AM12450
15 mL 离心管	Denville	C1018-P
50 mL 离心管	Denville	C1060-P
新生小牛血清	Thermo Scientific	16010159
土壤	Ingram's Nursery
珍珠岩	Vigoro	100521091
鱼雷砂	JKS Ventures
LB 肉汤，Lennox（粉末）	费希尔	BP1427-500