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在三维肽支架中培养哺乳动物细胞

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DOI：

10.3791/57259

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2018年6月13日

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1Tissue Engineering Research Laboratory, Department of Bioengineering, IQS-School of Engineering, Ramon Llull University, 2Hebe Biolab

本文内容

摘要

本文介绍了一种在自组装肽支架中建立三维培养系统以促进去分化的成人关节软骨细胞向类软骨组织分化的实验方案。

摘要

本文介绍了一种在自组装纳米纤维三维（3D）支架中培养细胞的实用技术。该培养系统可重建一个在结构特征上高度模拟非极化组织的微环境。此外，该支架特有的内在纳米纤维结构使其对可见光透明，便于在显微镜下直接观察样品。这一优势被广泛用于研究细胞的迁移、排列、增殖和分化，以及通过特异性染料或探针染色来评估其特定细胞功能的发展。此外，本文还描述了该系统在研究体外扩增的人关节软骨细胞向软骨组织再分化过程中的良好性能。将细胞包埋于自组装肽支架中，并在特定条件下培养以促进软骨形成。三维培养在为期4周的实验过程中表现出良好的细胞活力。正如预期，与未诱导的对照组相比，经软骨诱导因子培养的样品对甲苯胺蓝染色呈强阳性（甲苯胺蓝可染色软骨细胞外基质中富含的糖胺聚糖（GAGs）），并且根据Western Blot分析结果，表达特定的分子标志物，包括I型、II型和X型胶原蛋白。该实验方案操作简便，可广泛应用于科研实验室、工业领域以及实验课程教学。

引言

几十年来，由于实际操作和经济方面的因素，哺乳动物细胞培养一直采用传统的二维（2D）培养系统进行实验，尽管这种条件并不符合生理状态。虽然该培养系统有助于研究和理解大多数分子与细胞机制，但如今我们认识到，需要新的细胞培养范式来研究更为复杂的细胞体系。因此，需要三维（3D）培养系统以重建在生物物理、生物力学和生物学特性上更接近天然组织的微环境。近年来，三维（3D）培养系统在科研人员和工业界中日益普及，因为它们提供了一种新的研究或筛选模型，使细胞能够在空间中生长，形成细胞间或细胞与基质间的相互作用，发生迁移，并最终分化为特定的细胞谱系。

该方法学的总体目标是重建一个 体外 更接近细胞的微环境 体内 微环境。特别是，合成自组装肽支架（SAPS）是一类具有独特特性的生物材料；它通过肽分子间的弱相互作用形成纳米级孔径的网络结构，其力学和结构特性与天然细胞外基质相似。换句话说，使用该材料的合理性在于其能够构建真正三维的环境，非常适合获得类三维组织或器官单元。然而最重要的是，三维环境使三维结构获得在二维培养体系中通常不具备的新生物学功能，例如与组织架构、传质现象、细胞排列模式以及最终的组织形态发生相关的特性，这些特性是未来功能性组织与器官研究与开发中的关键因素1,2此外，与天然材料（如胶原蛋白、Matrigel）相比，SAPS 的一个优势在于其在室温下非常稳定，无需特殊的生产后处理、运输或储存条件。3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15SAPS 易于操作，必要时可通过提高离子强度或调节 pH 至中性来简单地获得 3D 凝胶1,2最后，本文所述方法已被广泛使用 体外 促进多种细胞类型的维持、生长和分化，包括软骨细胞、肝细胞、内皮细胞、成骨细胞、神经元细胞以及胚胎干细胞和体细胞干细胞3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15在本研究中，我们描述了一种三维培养系统，用于将人源扩增关节软骨细胞（hACh）分化为类软骨组织，方法如前所述。11.

本文介绍了一种使用自组装肽（SAPs）在三维系统中培养细胞的方法。在这种合成生物材料中，首先将细胞与肽溶液混合，随后诱导其自组装，从而在细胞周围形成纳米尺度的网络结构，由此构建出真正的三维环境（图1）。需要注意的是，细胞行为会受到基质刚度值的影响（例如，增殖、迁移和分化）。因此，一种常见的方法学对照是将细胞接种于具有相同刚度值的肽支架表面进行培养（即二维培养）。

方案

1. 自组装肽支架（SAPS）的制备

  1. 在微量离心管中，配制含有20% (w/v) 蔗糖的0.5% RAD16-I肽溶液。将肽溶液置于超声水浴中，室温（RT）下以最大功率超声处理20分钟，以确保充分混匀。
    注意：所需配制的溶液体积取决于所需的包封次数。RAD16-I肽在此超声条件下不会发生降解。
  2. 用适量10% (w/v) 蔗糖溶液稀释步骤1.1中配制的肽溶液，以获得所需的最终浓度。
    注意：需重点考虑初始肽浓度的调整，因为最终基质的刚度取决于该参数。RAD16-I肽溶液的浓度应为所期望的三维结构最终浓度的2倍。通常使用的最终RAD16-I肽浓度范围为0.15–0.5% (w/v)。
  3. 将含有肽溶液的微量离心管置于室温（RT）下的超声水浴中处理20分钟，以确保充分混匀。
    注意：若肽溶液不立即使用，可在4 °C下保存数月。

2. 细胞悬液制备

  1. 将细胞悬液（胰蛋白酶处理后获得）在室温下以 60 × g 离心 5 分钟。
  2. 使用连接真空泵的巴斯德吸管去除上清液，并用移液器将细胞沉淀重悬于 3–5 mL 的 10% (w/v) 蔗糖溶液中。随后使用手动或自动细胞计数仪进行细胞计数。
    注意：10% (w/v) 蔗糖溶液是一种等渗且非离子型的介质，有助于维持细胞活性，并防止在混合过程中发生多肽凝胶化。
  3. 将细胞悬液在室温下以 60 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，再用适量 10% (w/v) 蔗糖溶液重悬细胞沉淀，使细胞浓度达到目标终浓度的两倍（建议约为 4 × 106 个细胞/mL）。
  4. 在 6 孔板的每个孔中放入所需数量的组织培养小室（每包封过程使用一个小室）。
  5. 将步骤 1 中配制的多肽溶液在室温下以最大功率超声处理 5 分钟。
  6. 用移液器吸取并转移 40 µL 细胞悬液（来自步骤 2.3），每个所需包封样品另加约 10–15% 的额外体积，至标准微量离心管中。

3. 将细胞三维包封至 SAPS 中

  1. 取步骤2中制备的细胞悬液（每包封40 µL），与等体积的10%蔗糖（w/v）RAD16-I溶液（每包封40 µL）混合，得到所需肽浓度（含10%蔗糖）的细胞悬液。用移液器缓慢吹打约10次以充分混匀。混合过程中避免产生气泡。
    注意：此步骤至关重要，必须极其小心操作，因为细胞处于低pH值肽溶液（约3.5–4.0）带来的不利环境中。
  2. 使用微量移液器，将80 µL上述悬液小心加入每个插入式培养小室中。
  3. 向孔板底部加入0.5 mL培养基，润湿插入式培养小室的膜，使培养基扩散促进肽的自组装及水凝胶形成。将肽溶液在生物安全柜中静置约20分钟以形成凝胶。
    注意：凝胶形成期间对样品的任何操作均可能导致凝胶破裂。
  4. 极其缓慢地向插入式培养小室中加入40 µL培养基，使其沿内壁缓缓流下至凝胶表面。
    注意：通常，加入该体积液体应耗时20–30秒。
  5. 将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2，湿化环境）中孵育20分钟。此步骤及后续的培养基添加有助于蔗糖的渗出，并使细胞逐渐适应培养基环境。
  6. 沿插入式培养小室的内壁缓慢加入60 µL培养基，使其沿壁流下。吸除孔中富含蔗糖的培养基，并向孔中加入0.5 mL新鲜培养基。
  7. 缓慢向插入式培养小室中加入60 µL培养基，然后将培养板放入培养箱（37 °C，5% CO2，湿化环境）中孵育10分钟。
  8. 吸除孔中的培养基，向孔中加入2.5 mL新鲜培养基，同时向插入式培养小室中加入200 µL培养基。将培养板放回培养箱（37 °C，5% CO2，湿化环境），以维持细胞在适宜条件下生长。
  9. 每天更换培养基。从孔底部吸除旧培养基，向孔中加入2.5 mL新鲜培养基，向插入式培养小室中加入200 µL新鲜培养基。
    注意：若需诱导细胞分化，则应向培养体系中加入特定的诱导培养基，以实现目标细胞类型的定向分化（见下文细胞分化部分）。

4. 三维SAPS中的细胞活力


  1. 注意：细胞活力检测也被称为活/死细胞 — 存活率/细胞毒性检测。
  2. 在15 mL离心管中，通过涡旋振荡10秒，制备含有2 µM钙黄绿素AM和2 µM乙啶同源二聚体-1（EthD-1）的PBS新鲜溶液。避光保存。
    注意：每份样品所用溶液体积需根据孔板规格确定：6孔板每孔使用2 mL；12孔板每孔使用1 mL；24孔板每孔使用0.5 mL。
  3. 使用移液器，用2 mL PBS对3D-SAPS样品冲洗3次，然后加入步骤4.1中配制的溶液覆盖样品。在室温下避光孵育40分钟。
  4. 使用移液器，用2 mL PBS对构建物冲洗5次。
  5. 使用荧光显微镜，以10倍或20倍放大倍数观察样品。

5. 细胞分化

  1. 在软骨细胞基础培养基（CBM）中加入生长添加剂，于37 °C、5% CO2、湿润的环境中培养细胞。
    注：培养基的配制方法见生产商说明书（参见材料表）。
  2. 在第2天使用含有重组人转化生长因子-β1 [TGFb1]（10 ng/mL）、L-抗坏血酸-2-磷酸酯 [AA2P]（25 µg/mL）和地塞米松（100 nM）的软骨诱导培养基诱导细胞分化。
  3. 将培养物在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中维持培养4周，每隔一天更换一次软骨诱导培养基。

6. 甲苯胺蓝（TB）染色

  1. 用移液器加入 2 mL PBS，然后吸出，对 3D-SAPS 培养物清洗两次。在室温下加入 2 mL 2% (w/v) 的 p-甲醛 PBS 溶液，固定 2 小时。
  2. 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS（PBST）清洗两次，每次 2 mL。
  3. 在 20 分钟内于室温下用 2 mL 浓度为 0.05% 的甲苯胺蓝（TB）水溶液孵育。
  4. 用 2 mL PBS 多次清洗（至少 3 次），直至吸出的 PBS 溶液变得澄清。
  5. 在体视显微镜下通过肉眼观察分析样品11,13,14。
    注意：甲苯胺蓝（TB）可与细胞外基质中的阴离子糖缀合物（如蛋白聚糖（PG）和糖胺聚糖（GAG））形成复合物，这些物质主要由类软骨细胞分泌。阳性样品呈蓝色染色。

7. 蛋白质印迹

注意：本方案中使用的步骤此前已在参考文献11中描述。

  1. 用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液通过移液吹打裂解3D结构。
  2. 根据凝胶电泳设备所需的凝胶体积配制丙烯酰胺凝胶，并在150 V条件下电泳90分钟16。
    注意：丙烯酰胺凝胶的浓度通常为7.5–10%（w/v），具体取决于目标蛋白的分子量。
  3. 在室温下以40 V电压将凝胶中的蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，持续2小时。
  4. 将PVDF膜置于足量的封闭缓冲液（含4%（w/v）脱脂奶粉的PBST）中，在室温下孵育2小时，确保缓冲液完全覆盖膜，容器需单独使用。
  5. 在室温下用PBST稀释一抗至终浓度1 mg/mL，与膜孵育1小时。参见材料表。
  6. 加入二抗，终浓度为1 mg/mL。参见材料表。
  7. 使用化学发光底物对膜进行hP检测前处理16。参见材料表。
  8. 采集化学发光图像16。

结果

本研究介绍了一种利用SAPS进行细胞三维培养的简单且快速的方案，以获得可靠的定性和定量数据。SAPS可构建具有独特性质的三维微环境，使培养的细胞在理想条件下实现细胞维持、增殖和/或分化3,4,5,6,7,8,9,10,11,12。本课题组已开展多项研究，采用人脂肪组织来源的前体细胞（hAPC）、扩增的人关节软骨细胞（hACh）和人正常真皮成纤维细胞（hNDF），在三维条件下进行培养、扩增并诱导其分化为类软骨组织10,11,12。本文描述了扩增后的hACh在三维培养中重新分化为类软骨组织的过程，该方法此前已有报道11。具体而言，我们将细胞包封于3D-SAPS中，并在软骨诱导培养基中进行培养，如图1（及实验方案部分）所示。包封24小时后，采用活/死细胞染色法（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Assay）检测细胞活力。结果显示，包封5天后仅有少量细胞死亡（红色），培养4周后几乎未观察到死细胞（图2）。随后，我们采用甲苯胺蓝染色法对细胞外基质中糖胺聚糖（GAG）的沉积情况进行染色。结果表明，诱导组对处理反应良好，呈现强阳性染色（图2）。

最后，通过蛋白质印迹法分析了软骨形成和肥大相关的分子标志物，包括I型、II型和X型胶原（图3）。I型胶原（COL1）在二维（2D）和三维（3D）体系中均有表达，但约130 kDa的较窄条带（代表加工成熟的COL1蛋白，可组装至细胞外基质）仅在3D体系中观察到。该结果明确表明，在三维环境中分化的细胞其分化过程更接近生理状态。值得注意的是，仅在软骨诱导条件下培养的3D结构中检测到II型胶原（COL2），表现为细胞外基质中预期分子量的单一条带。最后，在软骨诱导条件下培养的2D和3D结构中均检测到X型胶原（COL10），表明经过4周培养后出现一定程度的肥大现象。

用于构建形成的肽支架制备的三维细胞包封方法示意图。
图 1：细胞包封入三维自组装肽支架（3D-SAPS）的示意图。 图示描述了人肾上腺嗜铬细胞（hACh）的包封过程，以获得在三维自组装肽支架（3D-SAPS）中随机分散的细胞。1. 自组装肽支架（SAPS）的制备；2. 细胞悬液的制备；以及3. 将细胞三维包封入SAPS中。请注意，该示意图仅显示了步骤3.1至3.4。

活/死细胞检测，甲苯胺蓝染色；细胞活力、分化；对照组与软骨诱导培养基。
图 2：3D-SAPS 培养中细胞性能及软骨向分化。 在培养 5 天和 4 周后进行活/死细胞染色，并在荧光显微镜下观察（活细胞呈绿色，死细胞呈红色）。比例尺 = 200 µm。通过甲苯胺蓝染色（硫酸化糖胺聚糖呈蓝色）评估在对照培养基和软骨诱导培养基中培养的 3D-SAPS 构建物的总体软骨形成能力。比例尺 = 500 µm。本图经 L. Recha-Sancho 等11 修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

二维与三维软骨形成培养中 COL1、COL2、COL10 和肌动蛋白的 Western 印迹分析
图3：人关节软骨细胞在软骨形成过程中I型、II型和X型胶原的表达。 在软骨诱导培养基中培养4周后，对2D单层和3D-SAPS培养的hACh以及对照组检测了I型胶原（COL1）、II型胶原（COL2）和X型胶原（COL10）的表达。以肌动蛋白表达作为内参对照。该图已根据L. Recha-Sancho修改 等11. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

此前，我们课题组及其他研究团队已报道了利用三维（3D）培养平台结合多种细胞系统的研究方法3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15在本研究中，我们描述了一种简便且可靠的获取三维培养系统的方法，该方法适用于任何类型的哺乳动物细胞，包括各类功能细胞、胚胎或成体干细胞，以及最终从活检或肿瘤组织中分离得到的功能异常细胞等。. 此外，无论干细胞来源于胚胎或成体，它们在三维环境中的谱系定向能力均优于传统的二维培养皿中10,11,12,13,14,15因此，该系统中的细胞培养可分化形成具有功能的类组织结构，在从修复性或再生性生物医学到毒理学和药理学研究平台等多种应用中具有广阔前景。

我们已观察到细胞功能的显著提升，因为该细胞微环境在基质结构以及生物力学、生物物理和生物学参数方面均与天然组织相似。然而，随着系统复杂性的增加，需要调控的参数数量也随之增多，其中包括对外部支撑平台的需求（例如，采用主动灌注系统以避免与传质现象相关的问题）。三维培养的细胞在调控迁移、增殖和分化等关键生命活动方面表现更优。它们能够形成复杂的网络结构，促进细胞间更有效的相互通讯，这是目前三维培养中细胞生长与分化的关键结果之一。事实上，SAPS 能够创造这样的条件 体外 与这些细胞外基质蛋白相似具有优势，因为可以方便地对添加到支架中的每种组分（生长因子、多糖或信号肽）所产生的效应进行系统性研究。

与I型胶原蛋白和Matrigel等其他天然支架材料相比，SAPS具有以下明显优势：1）SAPS是一种合成生物材料，批次间变异极小；2）SAPS可被功能化修饰，携带特定的肽序列；3）SAPS具有较低的生物降解性 体外，可随时间保持三维结构的生物物理、生物力学和结构特性不变。然而，使用SAPS的局限性在于 与 在包封步骤中会遇到其他支架材料所存在的问题，此时细胞处于因低pH值而形成的不利微环境中，因此该步骤是所述方法中的关键环节。此外，在开展任何实验之前，必须针对每种特定细胞类型确定SAPS的浓度。当细胞在这些生物材料上或其中进行培养时，这一点尤为重要，因为不同细胞类型各自具有最适宜的生物力学生长条件。

最后，我们认为，此类生物材料支架的设计与制备将有助于开发出更接近生理状态且可靠的三维组织模型，从而帮助制药行业为再生医学、癌症或任何医学治疗开发出更优的治疗策略。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者的研究工作部分得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号229239以及AO基金会探索性研究合作研究项目急性软骨损伤/病变/缺损（CRP ACI）的资助，项目名称为用于软骨再生的生物活性与仿生支架（BIOCART）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
人关节软骨细胞（Ach）LonzaCC-2550
RAD16-I 肽溶液（PuraMatrix）Corning354250
蔗糖（组织培养级）SigmaS0389
细胞培养插件（0.4 µm 孔径，12 mm 直径）MilliporePICM01250
软骨细胞基础培养基（CBM）LonzaCC-3217
单份生长补充剂（SingleQuots）LonzaCC-4409
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit）InvitrogenL3224
胎牛血清（FBS）LonzaDE14-801F
地塞米松SigmaD8893
L-抗坏血酸-2-磷酸（AA2P）SigmaA8960
人转化生长因子-β1（TGF-β1）MilliporeGF111
RIPA 裂解缓冲液SigmaR0278
蛋白酶抑制剂混合物Roche11836153001
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜InvitrogenLC 2005
SuperSignal West Pico 化学发光底物Thermo Scientific34080
抗肌动蛋白抗体（Anti-Actin）SCBTsc-1615
抗胶原蛋白 I 抗体（Anti-Collagen I）Abcamab138492
抗胶原蛋白 II 抗体（Anti-Collagen II）Abcamab3092
抗胶原蛋白 X 抗体（Anti-Collagen X）Abcamab182563
抗山羊 IgG-HRP 抗体（Antigoat IgG-HRP）Abcamab97100
抗小鼠 IgG-HRP 抗体（Anti-mouse IgG-HRP）Abcamab97023
抗兔 IgG-HRP 抗体（Anti-rabbit IgG-HRP）Abcamab97051

参考文献

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