开发微流控装置以研究尖端生长植物细胞在极小空间中的伸长能力

摘要

我们描述了一种方法，用于研究尖端生长的植物细胞（包括花粉管、根毛和苔藓原丝体）在微流控装置中穿过极窄间隙（约1 µm）的伸长能力。

摘要

体内环境中，顶端生长的植物细胞需要克服一系列物理屏障；然而，研究人员目前缺乏在如此受限条件下观察细胞行为的方法学手段。为解决这一问题，我们开发了用于顶端生长植物细胞的生长室，其包含一系列微加工制成的狭窄缝隙（约 1 µm），位于聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底中。这种透明材料使研究者能够通过延时成像技术，实时监测单个细胞在穿越微缝隙过程中顶端延伸的动态过程。利用该实验平台，我们观察到花粉管在穿透微缝隙时发生的形态变化，并捕捉到花粉管中荧光标记的营养核及精子细胞在此过程中形态的动态改变。此外，我们还证实了根毛和苔藓原丝体同样具备穿透 1 µm 缝隙的能力。这一体外实验平台可用于研究单个细胞如何响应物理空间限制，有望为理解顶端生长机制提供新的见解。

引言

花粉粒在柱头上萌发后，每个花粉粒会生成一条花粉管，将精子细胞运送至胚珠中的卵细胞和中央细胞，以完成双受精。花粉管在生长过程中穿过花柱，并通过感知沿途的多种导向信号最终到达胚珠¹。在伸长过程中，花粉管会遇到一系列物理屏障；传递道内充满细胞，花粉管必须进入胚珠微小的珠孔开口才能抵达目标位置（图1A）²。因此，花粉管必须具备穿透物理障碍的能力，同时耐受周围环境施加的压缩应力。根毛是另一种顶端生长的植物细胞，也必须在环境中承受物理障碍，例如紧密排列的土壤颗粒（图1B）。

已研究了花粉管的多种力学特性，包括膨压以及细胞顶端区域的刚度，这些参数可通过初始质壁分离法进行测量^3,4 以及细胞力显微镜（CFM）^5,6分别。然而，这些方法本身并不能揭示花粉管是否能够在生长路径上穿透物理屏障而伸长。一种可替代的技术能够实现对花粉管伸长过程的监测 体内 双光子显微镜⁷然而，使用该方法难以观察....

方案

1. 用于观察花粉管和藓类原丝体生长的PDMS微装置的制备

注意：我们使用无掩模光刻仪器在硅晶圆上制备PDMS模具。本文省略了该系统操作的详细信息。也可采用使用光掩模的标准光刻技术⁹来制备本文所述的PDMS模具。

1. 将11 g预聚体PDMS混合物（弹性体基质与固化剂按10:1比例混合）倒入每个4英寸的模具中。
2. 将步骤1.1制备的模具置于真空腔中脱气20分钟。
3. 在非对流烘箱中于65 °C固化90分钟后，将PDMS层从模具上剥离，并使用活检打孔器在流体通道上打孔以形成通路。
   注：对于花粉管实验装置，孔的尺寸必须根据柱头的直径进行调整，因此该数值因物种而异。本实验中，柱头入口处打1 mm孔，液体培养基储液池处打1.5 mm孔。对于苔藓原丝体装置，样品储液池使用4 mm孔。
4. 将PDMS层和玻璃底培养皿（直径3.5- 5 cm）暴露于空气等离子体中处理50秒。
5. 将PDMS层压合到玻璃底培养皿上，然后在非对流烘箱中于65 °C加热30分钟，以完全密封微流控网络。

2. 根毛用PDMS微装置的制备

1. 使用模具重复步骤 1.1 - 1.3，制备根部和根毛微装置的两层 PDMS。
   注：我们在根部微装置中用于液....

结果

如图所示 图1尖端生长的植物细胞在其生长路径上会遇到一系列物理障碍 体内微流控 体外 本研究中展示的细胞培养平台，通过1 µm的人工间隙，实现了对三类植物细胞（花粉管、根毛和苔藓原丝体）顶端生长过程的观察图3, 图4, 图5）。对于花粉管研究，采用活细胞成像技术来监测花粉管顶端区域在遇到极小空间时所发生的形态变化，以及营养核和精子细胞的相应反应（补充视频1和2).

尽管采用本文所述方法已成功制备出大部分微间隙，但我们注意到其中少数微间隙完全闭合（图6）。由于在硅模具上制备的1 µm宽通道较.......

讨论

为了获得上述结果，必须精确遵循本方案中的若干关键步骤。首先，在键合前，必须对 PDMS 层和玻璃底培养皿表面进行充分时间的等离子体处理。否则，当顶端生长的细胞穿过微间隙时，PDMS 层可能会从玻璃表面局部脱落。在根毛和苔藓原丝体实验方案中，另一个关键步骤是微装置的灭菌。通常，根毛和苔藓原丝体细胞需要在微装置中培养数周。若不灭菌，微生物可能大量繁殖，从而影响这些顶端生长细胞的生长。而对于花粉管实验装置而言，灭菌的重要性较低，因为实验在半天内即可完成。我们常规使用花粉管装置时不进行灭菌，且在实验过程中未观察到任何不良影响。

微通道设计应根据目标细胞进行调整。在本研究中，拟南芥（A. thaliana）根毛实验所用的通道设计，与用于傅氏凤仙花（T. fournieri）花粉管和小立碗藓（P. patens）原丝体实验的通道设计不同。由于样品尺寸不同，需要使用不同的装置；例如，根毛远比花粉管和苔藓原丝体短。因此，我们设计的根毛装置中，微间隙区域紧邻主根通道。除了通道设计外，根毛装置的制备流程也不同于花粉管或苔藓原丝体的制备流程。在花粉管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	Dow Corning Co.	Sylgard184
MS培养基（Murashige & Skoog Medium）	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
蔗糖（Sucrose）	Wako Pure Chemical	196-00015
50 mm 玻底培养皿	Matsunami Glass	D210402
35 mm 玻底培养皿	Iwaki	3971-035
手术刀片	Feather	No.11
活检打孔器	Harris		Uni-Core
凝胶加样吸头	Bio-Bik	124-R-204
倒置显微镜	Olympus	IX83
CSU-W1	Yokogawa Electric		此定制显微镜无目录编号
MetaMorph 成像软件	Molecular Devices