我们描述了一种方法，用于研究尖端生长的植物细胞（包括花粉管、根毛和苔藓原丝体）在微流控装置中穿过极窄间隙（约1 µm）的伸长能力。
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摘要
摘要
体内环境中，顶端生长的植物细胞需要克服一系列物理屏障；然而，研究人员目前缺乏在如此受限条件下观察细胞行为的方法学手段。为解决这一问题，我们开发了用于顶端生长植物细胞的生长室，其包含一系列微加工制成的狭窄缝隙（约 1 µm），位于聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底中。这种透明材料使研究者能够通过延时成像技术，实时监测单个细胞在穿越微缝隙过程中顶端延伸的动态过程。利用该实验平台，我们观察到花粉管在穿透微缝隙时发生的形态变化，并捕捉到花粉管中荧光标记的营养核及精子细胞在此过程中形态的动态改变。此外，我们还证实了根毛和苔藓原丝体同样具备穿透 1 µm 缝隙的能力。这一体外实验平台可用于研究单个细胞如何响应物理空间限制，有望为理解顶端生长机制提供新的见解。
引言
花粉粒在柱头上萌发后，每个花粉粒会生成一条花粉管，将精子细胞运送至胚珠中的卵细胞和中央细胞，以完成双受精。花粉管在生长过程中穿过花柱，并通过感知沿途的多种导向信号最终到达胚珠1。在伸长过程中，花粉管会遇到一系列物理屏障；传递道内充满细胞，花粉管必须进入胚珠微小的珠孔开口才能抵达目标位置（图1A）2。因此，花粉管必须具备穿透物理障碍的能力，同时耐受周围环境施加的压缩应力。根毛是另一种顶端生长的植物细胞，也必须在环境中承受物理障碍，例如紧密排列的土壤颗粒（图1B）。
已研究了花粉管的多种力学特性，包括膨压以及细胞顶端区域的刚度，这些参数可通过初始质壁分离法进行测量3,4 以及细胞力显微镜（CFM）5,6分别。然而，这些方法本身并不能揭示花粉管是否能够在生长路径上穿透物理屏障而伸长。一种可替代的技术能够实现对花粉管伸长过程的监测 体内 双光子显微镜7然而，使用该方法难以观察到深藏于胚珠组织内部的单个花粉管的形态变化。此外，利用X射线计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI）可以实现对土壤中根毛生长的可视化观察。8，尽管分辨率较低。本文介绍了一种可在常规显微镜上用于获取细胞形变过程高分辨率图像的方法。
本文所述方法的总体目标是在极小空间内观察顶端生长型植物细胞（包括花粉管、根毛和苔藓原丝体）的伸长能力。由于本论文中介绍的聚二甲基硅氧烷（PDMS）微装置具有光学透明性和透气性，我们可以在装置内培养活细胞，并在显微镜下观察其生长行为。此外，利用模具通过软光刻技术9还可构建微米至纳米尺度的空间。这些特性使我们能够在物理受限的环境中研究顶端生长型植物细胞的伸长能力。
在本研究中，我们构建了微流控装置内宽1 µm（高4 µm）的间隙，并检测了花粉管穿透这些人工障碍物的能力，这些障碍物远小于圆柱形花粉管的直径（约8 µm）。该实验平台使我们能够观察花粉管对微间隙的响应，并获取响应过程的延时图像，以追踪细胞的形变过程。我们还开发了可用于研究根毛和苔藓原丝体穿透能力的微装置。迄今为止，已有若干微装置被报道，可用于高分辨率地观察植物根10,11,12,13和苔藓原丝体14的生长。在我们的装置中，一系列根毛生长通道垂直连接至根生长腔室，单个根毛（直径约7 µm）被引导进入具有1 µm宽间隙的流体通道。我们还在含有微间隙的微装置中培养了苔藓原丝体（直径约20 µm），以检测其对这些物理屏障的响应。这种基于微流控的技术使我们能够探索多种顶端生长的植物细胞在极端狭小空间中伸长的能力，而这一过程是目前其他任何可用方法均无法实现的。
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方案
1. 用于观察花粉管和藓类原丝体生长的PDMS微装置的制备
注意：我们使用无掩模光刻仪器在硅晶圆上制备PDMS模具。本文省略了该系统操作的详细信息。也可采用使用光掩模的标准光刻技术9来制备本文所述的PDMS模具。
- 将11 g预聚体PDMS混合物（弹性体基质与固化剂按10:1比例混合）倒入每个4英寸的模具中。
- 将步骤1.1制备的模具置于真空腔中脱气20分钟。
- 在非对流烘箱中于65 °C固化90分钟后，将PDMS层从模具上剥离，并使用活检打孔器在流体通道上打孔以形成通路。
注：对于花粉管实验装置，孔的尺寸必须根据柱头的直径进行调整，因此该数值因物种而异。本实验中，柱头入口处打1 mm孔，液体培养基储液池处打1.5 mm孔。对于苔藓原丝体装置，样品储液池使用4 mm孔。 - 将PDMS层和玻璃底培养皿（直径3.5- 5 cm）暴露于空气等离子体中处理50秒。
- 将PDMS层压合到玻璃底培养皿上，然后在非对流烘箱中于65 °C加热30分钟，以完全密封微流控网络。
2. 根毛用PDMS微装置的制备
- 使用模具重复步骤 1.1 - 1.3，制备根部和根毛微装置的两层 PDMS。
注：我们在根部微装置中用于液体培养基储液池的孔径为 2 mm。 - 将两层 PDMS 暴露于空气等离子体中处理 50 秒。
- 使用自制的桌面式对准装置，在体视显微镜下组装两层 PDMS。
注：这两层 PDMS 上的微通道必须相对朝向彼此。在组装前，确保两层上的对准标记完全对齐。 - 在非对流烘箱中 65 °C 下加热 30 分钟，以完全密封微流控网络。
- 从构建好的微装置上移除盖玻片，并将该装置置于直径为 5 cm 的玻璃底培养皿中。
3. 准备 体外 花粉管细胞培养基（Torenia fournieri)
- 按先前所述方法制备改良Nitsch培养基15，并在121 °C下高压灭菌20分钟。
注意：改良Nitsch培养基的成分为NH4NO3（80 mg/L）、KNO3（125 mg/L）、Ca(NO3)2‧4H2O（500 mg/L）、MgSO4‧7H2O（125 mg/L）、KH2PO4（125 mg/L）、MnSO4‧4H2O（3 mg/L）、ZnSO4‧7H2O（0.5 mg/L）、H3BO3（10 mg/L）、CuSO4‧5H2O（0.025 mg/L）、Na2MoO4‧2H2O（0.025 mg/L）、蔗糖（50,000 mg/L）和酪蛋白（500 mg/L）。配制好的培养基可在4 °C下保存至少4个月。 - 使用高压灭菌的去离子水配制26%（w/v）聚乙二醇溶液，并用孔径0.3 µm的滤器过滤。
注意：配制好的溶液可在4 °C下保存1个月。 - 将步骤3.1和3.2中配制的试剂按1:1（v/v）比例混合。
注意：该培养基应每次使用前新鲜配制。
4. 准备 体外 根毛细胞培养基拟南芥)
- 在去离子水中配制含有0.215%（w/v）Murashige & Skoog培养基、0.05%（w/v）MES、1%（w/v）蔗糖和1%（w/v）琼脂的溶液。在121 °C下高压灭菌20分钟。
5. 准备 体外 用于苔藓原丝体的细胞培养基（小立碗藓)
- 将藓类原丝体预先在培养皿中的BCDAT培养基中进行预培养16。
注意：BCDAT培养基的成分为1 mM MgSO4、10 mM KNO3、45 µM FeSO4、1.8 mM KH2PO4（用KOH调节pH至6.5）、微量元素溶液（0.22 µM CuSO4、0.19 µM ZnSO4、10 µM H3BO3、0.1 µM Na2MoO4、2 µM MnCl2、0.23 µM CoCl2和0.17 µM KI）、1 mM CaCl2以及5 mM 硫酸二铵(+)-酒石酸盐。 - 在微装置中使用BCDATG培养基培养藓类。
注意：BCDATG培养基即在BCDAT培养基中添加0.5 %（w/v）葡萄糖。配制好的培养基可在4 °C下保存1个月。
6. 体外 培养 T. fournieri 微流控装置中的花粉管
- 将花粉管微装置放入真空室中，抽真空处理 20 分钟。
- 从真空室中取出微装置，使用尖端极细的微量移液器将培养基加入柱头入口。用相同的培养基将其余孔加满至孔口。静置数分钟，待微通道内部形成的负压使所有微通道完全充满培养基。
- 在玻璃底培养皿中放置湿润的纸巾，以维持皿内湿度。
- 用解剖针将野生型 T. fournieri “蓝白”花的花粉粒转移到其柱头上。
注意：我们还使用了转基因 T. fournieri “Crown violet”花（RPS5Ap::H2B-tdTomato 品系17）进行了该实验，其花粉管中含有荧光标记的精细胞和营养核。 - 用刀片切下授粉后的花柱（长约 1 cm）。
- 将切下的花柱插入装置的入口，如 图 2 所示。
- 盖上培养皿盖，并用胶带密封。
- 将装置置于 28 °C 黑暗环境中孵育 5–6 小时。
7. 体外 培养 拟南芥 微装置中的根毛
注意：步骤 7.1 - 7.9（除 7.3 和 7.5 外）应在超净工作台中进行。
- 将拟南芥（A. thaliana）Columbia（Col-0）生态型种子及转基因株系UBQ10pro::H2B-mClover（含荧光核标记）种子置于无菌液体（5%（v/v）家用次氯酸钠溶液和0.02%（v/v）Triton X-100）中浸泡5分钟，进行表面灭菌。
- 用高压灭菌水将灭菌后的种子彻底冲洗干净。
- 将冲洗后的种子置于水中，在4 °C黑暗条件下保存2天。
- 将微流控装置置于紫外灯下灭菌过夜。
- 将微流控装置放入真空腔室中，抽真空处理20分钟。
- 使用微量移液器将培养基加入装置的孔中。静置数分钟，直至真空作用使培养基完全充满所有微通道。
- 在玻璃底培养皿中放入经高压灭菌的湿润纸巾，以维持皿内湿度。
- 将一颗灭菌后的种子转移至装置的进样口。
- 盖上培养皿盖，并用胶带密封。
- 将装置垂直放置于22 °C、持续白光条件下培养箱中培养。
- 培养4至10天后观察根毛生长情况。使用倒置显微镜获取明场和荧光图像。
8. 体外 培养 P. patens （苔藓）微流控装置中的原丝体
注意：步骤 8.2 - 8.6（除 8.3 外）应在超净工作台中进行。
- 预培养 P. patens 株系 Gransden 200418 在25 °C、持续白光条件下，在培养皿中用玻璃纸覆盖的BCDAT培养基上培养一周。
- 在超净工作台中用紫外灯对微装置进行过夜灭菌。
- 将微装置置于真空室中，脱气20分钟。
- 使用微量移液器将培养基加入孔中。等待数分钟，直至真空作用使培养基充满所有微通道。
- 向培养皿中微装置周围的区域加入高压灭菌水，以维持培养皿内的湿度。
- 将一小块苔藓原丝体组织转移至微流控装置的入口，并在25 °C、连续白光条件下于培养箱中培养该组织。
- 孵育2-3周后检查苔藓原丝体的生长情况。使用显微镜获取明场图像。
9. T. fournieri 花粉管生长的延时成像
- 将微装置置于配备图像采集硬件的倒置荧光显微镜上例如，CCD相机）和软件。找到微间隙的位置。
注意：对于图像采集软件，我们使用了一款市售产品（材料表）。开源显微镜软件（如 µManager）也可在线获取（https://micro-manager.org/wiki/Micro-Manager）。我们建议在显微镜上安装聚光镜，以获得更高分辨率的图像。 - 使用显微镜图像采集软件每10秒拍摄一次明场图像。
- 观察花粉管中荧光标记的精细胞和营养核 RPS5Ap::H2B-tdTomato 使用561 nm激光照射样品，并采用带通光学滤光片（578/105 nm）。
注意：尽管频繁采集了花粉管生长的延时图像，成像过程似乎并未影响其生长。然而，为尽量减少荧光探针的光毒性和光漂白效应，始终建议将激光强度、曝光时间和延时成像间隔降至最低。 - 使用 ImageJ 软件（https://imagej.nih.gov/ij/）调整图像的亮度和对比度，并制作视频文件。
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结果
如图所示 图1，尖端生长的植物细胞在其生长路径上会遇到一系列物理障碍 体内微流控 体外 本研究中展示的细胞培养平台使得通过三种植物细胞（花粉管、根毛和苔藓原丝体）的顶端生长过程得以观察 1 µm 人工缺口（图3, 图4, 图5）。对于花粉管研究，采用活细胞成像技术来监测花粉管顶端区域在遇到极小空间时所发生的形态变化，以及营养核和精子细胞的相应反应（补充视频 1 和 2).
尽管采用本文所述方法已成功制备出大部分微间隙，但我们注意到其中少数微间隙完全闭合（图6）。由于在硅模具上制作的1 µm...
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讨论
为了获得上述结果，必须精确遵循本方案中的若干关键步骤。首先，在键合前，必须对 PDMS 层和玻璃底培养皿表面进行充分时间的等离子体处理。否则，当顶端生长的细胞穿过微间隙时，PDMS 层可能会从玻璃表面局部脱落。在根毛和苔藓原丝体实验方案中，另一个关键步骤是微装置的灭菌。通常，根毛和苔藓原丝体细胞需要在微装置中培养数周。若不灭菌，微生物可能大量繁殖，从而影响这些顶端生长细胞的生长。而对于花粉管实验装置而言，灭菌的重要性较低，因为实验在半天内即可完成。我们常规使用花粉管装置时不进行灭菌，且在实验过程中未观察到任何不良影响。
微通道设计应根据目标细胞进行调整。在本研究中，拟南芥（A. thaliana）根毛实验所用的通道设计，与用于傅氏凤仙花（T. fournieri）花粉管和小立碗藓（P. patens）原丝体实验的通道设计不同。由于样品尺寸不同，需要使用不同的装置；例如，根毛远比花粉管和苔藓原丝体短。因此，我们设计的根毛装置中，微间隙区域紧邻主根通道。除了通道设计外，根毛装置的制备流程也不同于花粉管或苔藓原丝体的制备流程。在花粉管...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢H. Tsutsui和D. Kurihara为我们提供了转基因植物，包括T. fournieri RPS5Ap::H2B-tdTomato株系和A. thaliana UBQ10pro::H2B-mClover株系。本工作得到了名古屋大学变革性生物分子研究所和日本先进植物科学网络的支持。本研究的经费由日本科学技术振兴机构（T.H.的ERATO项目资助号JPMJER1004）、创新领域科学研究费（T.H.的资助号JP16H06465和JP16H06464）以及日本学术振兴会（JSPS）挑战性探索研究资助（N.Y.的资助号26600061，Y.S.的资助号25650075和15K14542）提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Dow Corning Co. | Sylgard184 | |
| MS培养基（Murashige & Skoog Medium） | Wako Pure Chemical | 392-00591 | |
| MES | Dojindo | 345-01625 | |
| 蔗糖（Sucrose） | Wako Pure Chemical | 196-00015 | |
| 50 mm 玻底培养皿 | Matsunami Glass | D210402 | |
| 35 mm 玻底培养皿 | Iwaki | 3971-035 | |
| 手术刀片 | Feather | No.11 | |
| 活检打孔器 | Harris | Uni-Core | |
| 凝胶加样吸头 | Bio-Bik | 124-R-204 | |
| 倒置显微镜 | Olympus | IX83 | |
| CSU-W1 | Yokogawa Electric | 此定制显微镜无目录编号 | |
| MetaMorph 成像软件 | Molecular Devices |
参考文献
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