微流控装置在极小空间中研究尖端生长植物细胞的伸长能力

Summary

我们描述了一种方法来调查尖端生长的植物细胞, 包括花粉管, 根毛和苔藓 protonemata, 以拉长通过极窄的差距 (约1µm) 在微流控装置。

Abstract

在体内, 尖端生长的植物细胞需要克服一系列物理障碍;然而, 研究人员缺乏在这种限制性条件下可视化细胞行为的方法。为了解决这一问题, 我们开发了生长室, 用于尖端生长的植物细胞, 其中含有一系列狭窄的, 微型制造的缺口 (1 µm) 在一个多甲基 (基板) 基质。这种透明材料允许用户在 microgap 穿透过程中通过时间推移成像监测单个细胞中的尖端伸长率。利用这个实验平台, 我们观察了花粉管的形态学变化, 因为它们穿透了 microgap。在这个过程中, 我们捕获了一个荧光标记的营养细胞核和精子细胞的形状的动态变化。此外, 我们展示了根毛和苔藓 protonemata 的能力, 以穿透1µm 的差距。此体外平台可用于研究单个单元格对物理受限空间的响应方式, 并可提供对尖端生长机制的洞察力。

Introduction

花粉粒在柱头上发芽后, 每粒谷物都会产生一个花粉管, 将精子细胞带到卵细胞和胚珠中的中心细胞进行双重受精。花粉管拉长的风格, 并最终达到胚珠通过感知多个指导线索沿其方式¹。在伸长过程中, 花粉管遇到一系列物理障碍;传送的轨道是充满细胞, 和花粉管必须进入分钟珠孔端打开胚珠达到他们的目标 (图1A) 2.因此, 花粉管必须具有穿透物理障碍物的能力, 同时能耐受周围的压力。根毛发是另一种尖端生长的植物细胞, 它必须经受住环境中的物理障碍, 以填充土壤颗粒 (图 1B) 的形式。

研究了花粉管的各种力学特性, 包括细胞顶端区域的膨压力和刚度, 可以用初始质壁分离^方法3、4和细胞力显微镜来测量.CFM)^5,6分别。然而, 这些方法本身并没有揭示花粉管是否能够通过其生长路径上的物理屏障拉长。一种替代技术, 允许花粉管伸长率被监测体内是两个光子显微镜⁷。然而, 用这种方法很难观察....

Protocol

1. 制备 Microdevice 研究生长的花粉管和苔藓 Protonemata

注: 我们使用了无掩模光刻仪器在硅片上制备了硅烷模具。本手稿中省略了有关系统操作的详细信息。使用光掩模的标准光刻^技术9 也可用于创建本手稿中所描述的注塑模具。

1. 将11克的预聚合物塑料混合物 (弹性体底座: 固化剂的比例为 10:1) 倒入每4英寸的模具中。
2. 将步骤1.1 中准备的模具放在真空室中20分钟。
3. 在非对流式烤箱中固化65摄氏度90分钟后, 将其从模具上剥离, 然后使用活检拳将进入孔的穿孔进入射流通道。
   注: 对于花粉管装置, 必须调整孔的大小以反映雌蕊的直径。因此, 这一价值将因物种而异。在这个实验中, 我们打了一个1毫米孔的雌蕊入口和1.5 毫米孔的液体介质油藏。对于青苔 protonemata 装置, 一个4毫米孔被用于样品水库。
4. 五十年代, 将该层和玻璃底盘 (直径 3.5-5 厘米) 暴露在空气等离子体中。
5. 在非对流式烤箱中按下玻纤层进入玻璃底盘, 加热65摄氏度30分钟, 完全封闭微流控网络。

2. Microdevice 根毛的制备

1. 重复步骤 1.1-1.3 使用模具, 为根和根头发 microdevices 准备两个注塑层。
   ....

Results

如图 1所示, 尖端生长的植物细胞在其生长路径体内中遇到一系列物理屏障。本研究提出的微流控体外细胞培养平台使三种植物细胞 (花粉管、根毛和苔藓 protonemata) 的尖端生长过程能够通过1µm 人工间隙进行检查 (图 3,图 4,图 5)。对于花粉管的研究, 用活细胞成像监测花粉管顶端区域的形态学变化, 以及植物细胞核和精子细胞, 以应对遇到一个非常小的空间 (补充电影1和 2)。

虽然大多数 microgaps 是通过使用此处描述的方法成功地制造出来的, 但我们注意到其中一些已完全关闭 (图 6

Discussion

为了获得上述结果, 必须遵循议定书中的几个关键步骤。首先, 在粘合之前, 必须在足够的时间内用等离子处理该层和玻璃底碟表面。否则, 当尖端生长的细胞穿过 microgaps 时, 该层可能会在本地与玻璃表面分离。根头发和苔藓 protonemata 协议的另一个关键步骤是 microdevice 的灭菌。通常, 根毛和苔藓 protonemata 细胞需要培养在 microdevice 几个星期。在不杀菌设备的情况下, 微生物可能会蓬勃发展, 这可能会影响这些尖端生长细胞的生长。由于实验是在半天内完成的, 花粉管装置的灭菌并不那么重要。我们经常使用的花粉管设备没有绝育, 并没有观察到任何不良影响, 在实验中。

微通道设计应根据感兴趣的细胞进行修改。在我们的工作中, 用于耳根头发实验的通道设计不同于用于 T.. ..........专利protonemata 实验。需要不同的设备, 因为样品有不同的尺寸;例如, 根毛比花粉管和苔藓 protonemata 短得多。因此, 我们设计了根发装置, 使 microgap 区域与主根通道.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PDMS	道康宁公司	Sylgard184
Murashige &Skoog 中型	Wako Pure Chemical	392-00591
MES	Dojindo	345-01625
蔗糖	Wako Pure Chemical	196-00015
50 毫米玻璃底培养皿	松波玻璃	D210402
35 毫米玻璃底培养皿	Iwaki	3971-035
手术刀片	羽毛	11
号活检打孔	Harris		Uni-Core
凝胶加载提示	Bio-Bik	124-R-204
倒置显微镜	奥林巴斯	IX83
CSU-W1	横河电机		否 目录号可用于此定制显微镜
MetaMorph 成像软件	Molecular Devices