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方法文章

新生小鼠脑纹状体细胞基因操作的立体定位手术

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DOI：

10.3791/57270

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2018年7月10日

 ,  , 
1Institute of Neuroscience, National Yang-Ming University, 2Brain Research Center, National Yang-Ming University

本文内容

摘要

我们描述了一种使用自制固定装置进行立体定位手术的方案，用于将试剂微量注射到新生小鼠脑的纹状体中。该技术可实现对新生小鼠脑特定区域神经元细胞的遗传操作。

摘要

许多基因在胚胎期大脑中表达，其中一些基因在出生后仍持续在大脑中表达。对于这些持续表达的基因，它们可能在新生儿大脑的发育过程和/或生理功能调控中发挥作用。为了研究特定基因在大脑中的神经生物学功能，必须在大脑中失活这些基因。本文介绍了一种简单的立体定位方法，可在新生期时间窗口内对转基因小鼠纹状体中的基因表达进行失活。通过立体定位脑部手术，将AAV-eGFP-Cre病毒微量注射至出生后第2天（P2）Ai14报告基因小鼠的纹状体中。在P14时检测到纹状体中tdTomato报告基因的表达，表明在AAV转导的纹状体细胞中成功实现了Cre-loxP介导的DNA重组。我们进一步通过将AAV-eGFP-Cre病毒微量注射至P2 Foxp2fl/fl 小鼠体内对该技术进行了验证。GFP与Foxp2的双重标记显示，在P9纹状体中GFP阳性细胞缺乏Foxp2免疫反应性，提示在AAV-eGFP-Cre转导的纹状体细胞中Foxp2蛋白已丢失。综上所述，这些结果表明，通过立体定位微量注射AAV-eGFP-Cre病毒，可在新生期flox小鼠大脑特定神经元群体中实现有效的基因删除。总之，我们的立体定位技术为新生期小鼠大脑的遗传操作提供了一个简便易行的平台。该技术不仅可用于在新生期小鼠大脑特定区域删除基因，还可用于向新生期小鼠纹状体注射药理学药物、神经示踪剂、基因改造的光遗传学和化学遗传学蛋白、神经元活性指示剂及其他试剂。

引言

对大脑结构与功能的现代研究通常需要对神经元细胞中的特定基因进行遗传学操控。为了探究不同基因的功能，研究人员已常规构建了携带突变等位基因（包括基因敲除和基因敲入等位基因）的转基因小鼠。对成年啮齿类动物进行立体定位脑部手术是一种标准方法，可用于将药物、病毒、示踪剂及其他试剂局部递送至啮齿类动物大脑的特定区域1,2。将立体定位脑部手术应用于转基因小鼠，可实现对小鼠大脑中特定神经元群体的基因功能和神经元活性的遗传学操控。这种细胞类型特异性的操控为解析大脑复杂神经回路中神经元功能提供了一种强有力的方法3,4,5。

神经系统的神经发育始于胚胎早期，并在出生后持续进行，直至幼年期。神经系统出生后的成熟过程包括神经回路的精确突触连接，这对大脑的生理功能和认知功能至关重要6。因此，研究新生儿期发生的发育事件，不仅有助于理解正常的神经发育过程，还可能为神经发育障碍和神经精神疾病的发生机制提供重要线索7,8。尽管成年啮齿类动物的立体定位脑手术方法已有广泛报道2,9，但目前互联网上关于新生小鼠立体定位脑手术的实验方案仍十分有限10,11。事实上，对新生小鼠进行试剂的立体定位微量注射具有较大难度，因为新生仔鼠的头部过于脆弱，难以固定在标准的立体定位装置上。然而，立体定位脑手术在转基因小鼠的新生期应用是可行的12。本文中，我们介绍一种使用自制装置对新生小鼠进行立体定位脑手术的简便方法。我们证明，该技术可通过向报告基因小鼠和条件性 floxed 转基因小鼠的纹状体微量注射表达 Cre 重组酶的 AAV，实现对 floxed 基因的条件性敲除。该技术同样适用于向野生型小鼠的新生期纹状体递送各种试剂。

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方案

本研究所涉及的动物实验方案已获得中国台湾阳明大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 新生幼崽在立体定位仪中固定装置的准备

  1. 制作头部托架：将一个1.5 mL离心管的底部（长15 mm）剪裁成适合新生幼鼠头部的形状，通过移除管壁的1/5部分实现。
  2. 取一个尺寸合适、可固定在立体定位仪底座上的移液器吸头盒，移除顶部盖子。使用热熔胶将步骤1.1中制备的头部托架和一个组织包埋盒固定在吸头盒的底座上。组织包埋盒的高度为7 mm，用于在固定幼鼠头部时支撑其颈部和身体。
  3. 将整个装置放置于标准立体定位仪中。

2. 30G 注射用不锈钢针头的准备

  1. 用氯仿浸泡30G注射器针头3天以进行预清洁。
  2. 在化学通风橱中，使用镊子小心且缓慢地将针头从其聚丙烯接头中抽出。
  3. 用无水乙醇清洗针头20分钟，随后用70%乙醇冲洗3次 × 在50 rpm转速下振荡10分钟。让针头自然晾干，并将清洁后的针头置于洁净盒子中，于室温（RT）保存至使用。

3. 准备显微注射管适配器

  1. 将微量注射器通过PE10聚乙烯管（PE10管）连接至30G注射针头。准备一段PE20聚乙烯管（PE20管）作为连接注射针头与微量注射器的转接装置。使用该转接装置是必要的，因为PE10管的直径远小于26G微量注射器针头的直径。
  2. 准备微量注射器用导管：将预先清洁过的30G注射针头与一段5 cm长的PE20管连接，并用瞬干胶密封连接处。此导管转接装置可重复使用。
    注意：若微量注射器针头为30G，则无需进行本步骤（3.1）的制备及后续（3.3）的使用。
  3. 将步骤3.1中制备的导管转接装置与微量注射器（10 µL）连接。
  4. 将一段PE10管（长度不超过60 cm）的一端连接至PE20导管转接装置的30G针头，另一端安装新的30G注射针头。

4. 使用灭菌蒸馏水、染料和病毒填充微量注射管

  1. 取出微量注射器的推杆。使用25G注射器将灭菌蒸馏水注入微量注射器及其连接的PE管中，以排除管路中的空气。
  2. 将推杆重新插入微量注射器，并推动推杆直至注射器筒内剩余2 µL蒸馏水。切勿使蒸馏水体积低于2 µL。
  3. 小心地将微量注射器安装到微流速注射泵上。
  4. 将少量0.1%快绿染料（溶于0.9%生理盐水并用0.22 µm滤器过滤）和病毒液滴加至一片Parafilm上。
  5. 吸取少量空气，使30G注射针与PE10管连接处形成可见气泡，随后将0.7 µL过滤后的快绿染料吸入管路，以检测微量注射管路中液体的流动情况。
  6. 再吸取少量空气形成第二个气泡，随后将病毒液吸入微量注射管路中。
  7. 将30G微量注射针固定在立体定位仪的针臂上并确保牢固。

5. 通过低温对新生小鼠进行麻醉

  1. 将幼鼠放入乳胶手套套管中，并将其浸入碎冰中至颈部，持续5分钟。
  2. 用镊子轻夹幼鼠足部，确认其足部无回缩反应。
  3. 将套有乳胶手套套管的幼鼠置于头部托盘中，并在套管周围放置碎冰，以维持低温，实现低温麻醉。
  4. 如有可能，在麻醉期间于幼鼠眼部涂抹兽用眼膏，以防角膜干燥。

6. 显微注射

  1. 使用70%乙醇彻底擦拭立体定位仪，进行无菌手术准备。将手术器械浸入70%乙醇中进行消毒。
  2. 用70%乙醇擦拭幼鼠头部。在颅骨上定位λ点，并用记号笔标记λ点。将注射针尖对准λ点，并将前后（AP）和内外侧（ML）坐标设为零。
  3. 根据目标位点的X和Y坐标移动注射臂。对于出生后第2天（P2）幼鼠的纹状体，其坐标为：AP，λ点前方+2.4 mm；ML，中线外侧±1.0 mm；背腹（DV），颅骨表面下−1.7 mm。用笔标记PE10管中快绿染料的位置。
  4. 缓慢下放30G注射针，使其穿透皮肤和颅骨，然后将针尖缓慢上提，直至停留在颅骨表面。将DV坐标设为零。
  5. 缓慢下放30G注射针，直至到达目标位点的DV坐标。等待1分钟，使脑实质恢复至正常形态，然后启动微量注射程序（100 nL/min）。
  6. 观察PE管中快绿染料标记的移动，以确认病毒液体正在注入脑内。
  7. 微量注射结束后等待1分钟，然后在30秒内缓慢、逐步将针提至DV深度的一半位置。30秒后，缓慢将针从幼鼠头部完全撤出。
  8. 重复步骤6.2至6.7，直至完成所有目标位点的微量注射。

7. 仔鼠术后恢复

  1. 将幼鼠置于33 °C的培养箱中复温20分钟。每5分钟检查一次幼鼠从低温麻醉中的恢复情况，直至其恢复足够的意识以维持胸卧位。
  2. 待幼鼠完全恢复后，将其放回母鼠身边。

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结果

在第一组实验中，我们将200 nL的AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40病毒（AAV-eGFP-Cre，用Dulbecco's磷酸盐缓冲液稀释至1/10）微量注射到Ai14小鼠出生后第2天（P2）的纹状体中，该病毒可表达与GFP融合的Cre DNA重组酶。Ai14小鼠在Cre介导下发生loxP位点侧翼（floxed）的STOP盒删除后，会表达tdTomato报告基因（图2F）。在出生后第14天（P14）取脑组织，进行GFP和tdTomato的免疫染色。结果显示，大量AAV转导的GFP阳性细胞广泛分布于整个纹状体（图2A、C），表明AAV-eGFP-Cre病毒对纹状体细胞实现了广泛感染。在纹状体中也观察到tdTomato的类似广泛表达（图2B、C）。在高倍显微镜下观察发现，几乎所有GFP阳性的纹...

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讨论

在本研究中，我们展示了一种简单且可靠的立体定位方法，用于将 AAV 病毒注射到新生小鼠脑的纹状体中。我们在出生后第 2 天（P2）将 AAV-eGFP-Cre 病毒微量注射到 Ai14 报告基因小鼠的纹状体中，并在出生后第 14 天（P14）分析报告基因的表达情况。结果显示，在纹状体的吻侧至尾侧各水平均存在 AAV 转导的 GFP 阳性细胞。此外，几乎所有 GFP 阳性细胞均共表达纹状体细胞中的 tdTomato 报告基因，表明 AAV 介导的 Cre 活性成功诱导了 Cre-loxP DNA 重组。为进一步验证该方法的有效性，我们在 P2 时将 AAV-eGFP-Cre 病毒微量注射到 Foxp2fl/fl 小鼠的纹状体中。双标结果显示，在出生后第 9 天（P9）的纹状体中，许多 AAV 转导的 GFP 阳性细胞缺乏 Foxp2 免疫反应性，提示在新生期纹状体中成功实现了 Foxp2 基因的条件性敲除。微量注射 AAV 的体积与感染脑区的大小相关。当注射体积为 200 nL 时，GFP 阳性细胞广泛分布于整个新生期纹状体，部分散在的 GFP 阳性细胞也出现在邻近纹状体的皮层区域...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了科技部资助项目MOST104-2311-B-010-010-MY3、MOST106-2321-B-010-012、国家卫生研究院资助项目NHRI-EX106-10429NI， 以及中国台湾教育部通过阳明大学脑研究中心提供的特色领域研究中心计划资助， 和科技部博士后奖学金资助项目MOST106-2811-B-010-031（S.-Y.C.）、MOST105-2811-B-010-036及MOST106-2811-B-010-030（H.-Y.K.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
30G PrecisionGlide 针头Becton DickinsonREF 305106
氯仿JT Baker9180-03
Hamilton MICROLITER 注射器Hamilton 80300适用于PE10管的30G针头；26G针头需要PE20接头
聚乙烯管 PE20Becton Dickinson427406
聚乙烯管 PE10Becton Dickinson427401
微型流速注射泵Longer Precision Pump Co.TJ-2A（控制器）和 L0107-2A（驱动单元）
25G 注射器Becton DickinsonREF 302105
快绿Sigma-AldrichF-72520.1%
标准立体定位仪RWD生命科学68037不使用 68030 小鼠/新生大鼠适配器
抗FOXP2抗体Abcamab16046兔多克隆抗FOXP2抗体，1:4,000
抗RFP抗体Abcamab65856小鼠抗RFP单克隆抗体，1:1,000
BX63显微镜OlympusBX63
LSM 880 共聚焦显微镜ZeissLSM 880
山羊抗兔Alexa Fluor 594标记抗体杰克逊免疫研究实验室股份有限公司111-585-003
AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40宾夕法尼亚大学载体中心AV-9-PV1848批号 CS0987，5.506x1013 (拷贝数/毫升)
AAV9.鸡肌动蛋白-eGFP中国台湾中央研究院生物医学科学研究所腺相关病毒核心N/A1×1014 (GC/ml)
B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J杰克逊实验室 007914Ai14
B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ杰克逊实验室 026259Foxp2fl/fl
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液康宁 cellgro21-030-CVR

参考文献

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