生物银行中猪类 biomedical 模型组织样本的采样策略与处理方法

摘要

本文展示了在生物样本库项目中，为猪动物模型生成具有代表性的组织样本的各种方法的实际应用与性能，适用于多种下游分析，包括体积测定、系统性随机取样，以及针对定性和定量形态学与分子分析类型的组织样本差异处理。

摘要

在转化医学研究中，猪模型的应用日益广泛。考虑到单个动物，尤其是基因修饰猪模型的高价值，以及这些模型可获得的动物数量通常有限，建立经过适当处理的组织样本（生物样本库）集合，以适用于后续多种分析方法（包括采样时未明确规定的分析），是充分挖掘该模型转化价值的有效策略。针对猪的解剖学特点，近期已制定出标准化获取不同猪器官和组织代表性高质量样本的综合指南。这些指南是确保研究结果在不同研究和研究者之间具有可重复性和可比性的基本前提。记录基本数据（如器官重量和体积）、确定取样位置、所需制备的组织样本数量，以及样本的取向、尺寸、处理和修整方向，都是决定样本在分子、定性和定量形态学分析中通用性与可用性的关键因素。本文以图示方式，逐步演示从猪组织制备代表性、多用途生物样本库样本的最重要技术。所述方法包括器官/组织体积和密度的测定、通过点计数法对实质器官应用体积加权系统随机取样程序、确定组织样本在组织学包埋过程中发生收缩的程度，以及制备随机取向的样本用于定量体视学分析，例如采用"Orientator"和"Isector"方法生成的各向同性均匀随机（IUR）切片，以及垂直均匀随机（VUR）切片。

引言

在转化医学中，猪作为大型动物模型的应用日益普遍^1,2,3,4,5，这主要得益于猪与人类在解剖学和生理学上的多种有利相似性，以及已有成熟的分子生物学方法，可构建针对多种疾病状态的定制化基因修饰猪模型^1,4。

然而，与啮齿类动物模型相比，任一特定猪模型在任何时间点可供实验使用的动物数量均有限。这主要是由于猪的世代间隔约为一年，且猪模型的制备以及动物饲养需要耗费大量的资金和时间。因此，猪模型的个体动物及其所能获取的样本均极为珍贵，尤其是在老年个体中研究基因修饰猪模型和/或长期实验问题（例如，慢性疾病的晚期并发症）时尤为如此^2,6,7。

在任何研究过程中，后续可能发现需要进行最初实验设计中未计划的额外分析，例如为解答先前意外发现所引发的新问题。e.g.，若缺乏适用于此类额外实验的合适样本，则可能需要耗费极高的成本和大量时间来培育更多的猪并采集组织样本。为应对这类情况，建立生物样本库，保存各种器官、组织或生物液体的备用样本，且其数量和质量需满足后续多种分析的需求，被视为一种重要策略^2,6,7。为充分发挥猪动物模型的优势，拥有充足的生物样本库样本还提供了独特的机会，可在同一批个体动物中，在多器官层面上对完全相同的样本材料应用多种不同的分析方法，e.g.，通过将样本分发给研究网络中不同课题组的科研人员来实现^2,6,7。此外，生物样本库所采用的“前瞻性”采样策略也有助于减少研究所需的动物数量。猪模型生物样本库的优势最近已在一项多器官、多组学研究中得到证实，该研究利用慕尼黑MIDY猪生物样本库的样本，探索了长期糖尿病遗传修饰猪模型中的器官间相互作用²。

生物样本库样本通常必须满足一些强制性要求，以确保后续分析结果的可靠性和可解释性。样本必须能够被重复制备，并且必须具有代表性。 即，充分反映所取样组织/器官感兴趣的形态学和分子特征⁷为了适用于多种下游分析类型，必须采集足量的样本，并根据不同的分析方法（包括时间与温度条件）进行处理，这些分析方法包括描述性组织病理学分析，如冷冻组织学、石蜡组织学和塑料包埋组织学，以及免疫组织化学。 原位 杂交、超微结构电子显微镜分析、临床实验室诊断分析，以及对DNA、RNA、蛋白质和代谢物的分子分析。

为通过定量体视学分析评估不同组织结构的各种定量形态学参数（如数量、体积、长度或表面积），需要制备相应器官/组织的组织学样本的随机切面。^7,8,9,10,11在定量形态学研究中，需精确定量所取样本的组织、器官或器官分室的总体积，即，参考空间）至关重要^7,9,12 用于计算特定器官、组织或生物体内目标参数的绝对量。最终，还需确定并考虑组织学切片制备过程中因包埋所致的组织收缩效应¹³因此，定量体视学分析，尤其是对存档样本（固定组织样本、包埋组织块、组织学切片）的分析 等等。来自先前研究的数据有时受到严重限制，甚至无法获取¹²，特别是当未对相应器官/组织进行体积测定、未采用适当的取样设计以确保样本具有代表性、可用的个体样本数量和量不足，或样本处理方式不适用于目标定量形态学参数的估计时。由于存在多种可能的影响因素，档案样本材料是否适用于特定定量形态学参数的分析无法一概而论，而需根据每个具体情况进行审慎评估。

因此，由于样本的取材位置、大小、数量、处理方式、修剪方向和取向都可能影响后续分析的结果，这些因素极为重要，必须在任何研究的实验设计中予以充分考虑。针对这些方面以及猪解剖结构的特殊性，近期已制定出适用于猪动物模型的全面、详细且大规模的取样指南，为从50多种不同的猪器官和组织中标准化、可重复且高效地获取充足处理的高质量样本提供了可靠参考^6,7。

本文提供的方法学描述及视频教程以图文并茂、清晰易懂的方式，逐步详细展示了多种用于猪组织与器官体积测量、组织取样以及组织样本处理以适用于不同后续分析方法的操作技术。所介绍的技术包括基于阿基米德原理和卡瓦列里原理测定器官/组织体积与密度的方法。⁹，包括测定不同包埋介质中组织三维收缩的尺寸变化¹⁴ 在进行组织学检查处理过程中，应用可行的体积加权系统随机抽样方法，以及对所采组织样本进行不同后续分析的处理^7,8,9,15以及为潜在的定量体视学分析生成方向适当且经过适当处理的样本^7,8,9,10,11除了在猪类生物样本库项目中的应用外，所展示的方法普遍适用于所有研究器官/组织定量组织形态学特性的研究。此外，系统随机抽样设计在采用分子分析方法检测特定分子丰度变化的实验中，对于生成具有代表性的样本尤为有益， 例如、RNA、蛋白质或代谢物在各种器官和组织中的分布。

接下来的段落将简要介绍这些方法，而其实际操作性能将在实验方案部分进行描述。

器官/组织体积的测定
器官重量和体积的测定在多种实验条件下具有重要意义，因为这些指标可能提示与实验所关注因素相关的潜在变化。器官/组织的总体积也常需用于计算绝对定量参数，例如，总细胞数量），来自体视学估算的数值体积密度（即单位体积组织中的细胞数量^7,12除了使用计算机断层扫描等复杂技术设备的方法外，通常有三种实用方法用于测定器官或组织的绝对体积。器官的体积可通过以下方式确定： "直接体积测量" 根据阿基米德原理， 即，通过测量结构完全浸没时所排开的水或生理盐水的体积来确定。然而，对于体积相对较大的猪器官而言，这些方法不切实际且容易产生误差，因为需要使用非常大的容量瓶或量具。更为便捷的方法是根据器官/组织的重量和密度来计算其体积^7,12,16，可使用以下方法高效测定 "浸入法"^7,12,16 （方案步骤 1.1）也可采用基于容积测量法的方法来估算器官/组织体积 "卡瓦列里原理" （1598–1647）。简而言之，卡瓦列里原理指出：若两个物体被平行于某一基面的平面所截，且在距基面相同距离处所截得的两个截面轮廓面积相等，则这两个物体的体积相等。因此，任意形状物体的体积可估算为：其在一系列平行且等距的截面上的截面轮廓面积之和，乘以截面之间的距离。以下类比有助于理解：设想并排放置两堆数量相同、完全相同的硬币，其中一堆硬币整齐叠放，形成圆柱形的硬币堆；另一堆硬币则每枚均偏心放置图3A）。尽管两堆硬币的形状不同，但它们的体积相同，因为在这两堆硬币中，处于相同高度的各层硬币的面积相等（即，从两个硬币堆中距地面相同距离处切割的平行截面的轮廓面积）相同。利用卡瓦列里原理估算猪器官和组织的体积^7,12,15 在步骤1.2中已描述。

确定与组织学包埋相关的组织收缩程度
在分析通过组织学切片测量的多种定量形态学参数时，必须确定并考虑组织处理过程中因包埋所导致的组织收缩效应。与包埋相关的组织收缩程度可能存在变化，其大小取决于组织类型、处理方式以及包埋介质^{8,13,17,18,19}。通常情况下，与包埋相关的组织样本体积变化（即，主要是收缩）在空间的三个维度上均会发生，因此会影响通过定量体视学分析所估算的所有维度参数⁸。基本而言，以线性组织收缩因子（f_S）表示的与包埋相关的组织收缩程度，可如步骤1.3中所示进行估算，并用于校正（对收缩敏感的）定量形态学参数¹⁴。

器官/组织的体积加权系统随机取样
为建立猪器官/组织样本的生物样本库，体积加权系统随机取样方法（如步骤2所述）已被证明是实用、省时且高效的获取具有代表性、多用途组织样本的技术^7,8,9,15。

用于定量体视学分析的各向同性均匀随机切片与垂直均匀随机切片的制备
生物样本库中的组织样本需要适用于多种不同的定量体视学分析方法，以尽可能估计更多的参数，而这些参数若无适当制备的样本则无法测定。几乎所有定量体视学参数均可通过"各向同性（独立）均匀随机（IUR）切片"^8,9进行测定。在IUR切片中，组织样本的二维切面在三维空间中的取向是随机化的。这种随机化可通过固定切面位置而随机化组织样本相对于切面的位置来实现，例如"Isector"方法¹¹（实验方案步骤3.1）；也可通过固定组织样本位置而随机化切面相对于组织样本的取向来实现，例如"Orientator"方法¹⁰（实验方案步骤3.2）。对于皮肤或黏膜等具有天然存在、或定义明确且可准确识别的垂直轴的组织样本，制备严格限定在垂直轴平面内的"垂直均匀随机（VUR）切片"（实验方案步骤3.3）具有优势^8,20。关于IUR/VUR取样的理论基础以及可能后续开展的定量体视学分析的全面讨论，建议读者参考生命科学领域定量体视学的教科书^8,9。

方案

本文所述所有方法均使用来自死亡动物的组织样本，并完全符合德国动物福利的法律法规。

1. 容积测量

1. 测定组织/器官密度的浸没法图1 和 图2)^7,12,16
   1. 准备材料：手术刀片、纸巾、精细镊子、标准实验室天平、玻璃或塑料烧杯、0.9%生理盐水和自制标本夹持器（图2A).
   2. 切除一块组织（最大尺寸：2 x 2 x 2 cm）³）从器官/组织中，特别是从感兴趣的器官区室中获取。小器官，如垂体或松果体，可直接进行测量 整体上.
      注意：确保样品的尺寸明显小于烧杯的内径（步骤 1.1.5） 等等），并调整其液面高度，使样品在步骤1.1.7中能够完全浸没，且不接触烧杯内壁。
   3. 用纸巾轻轻擦拭样本，以去除多余的血液/组织液。
   4. 使用精密天平称量样品，并记录样品的重量（m_S）。将小组织样本称重至最接近的毫克（mg）图1A).
   5. 将装有室温0.9%生理盐水的烧杯置于天平上。不要将烧杯完全装满，以便在后续步骤中浸没组织样本时不会溢出。
      注意：应根据待测组织样本的大小和重量以及天平的有效测量范围，选用合适尺寸的烧杯。对于最大尺寸为 2 x 2 x 2 cm 的较大样本³对于50–100 mL的烧杯，应配合使用量程约为100 mg至500 g的天平；而对于小样品，则应使用5–10 mL体积的烧杯，并配合量程约为0.1 mg至20 g的精密天平。
   6. 将样品台浸入即，一根足够坚硬的细金属丝环或类似物品， 图2A) 加入生理盐水中至标记位置（图中箭头所示） 图1B, 图2B，以及 图 2C然后，将天平显示屏归零（去皮）。
   7. 小心地将组织样本固定在样本支架上，并将样本完全浸入生理盐水中，直至达到样本支架上的标记位置（箭头所示）。 图1B, 图2B，以及 图2C).
      警告：浸没的样本和样本架不得与烧杯的内壁、底部或盐水表面接触。
   8. 在保持样品架和浸没的样品处于该位置的同时，记录天平上显示的重量（m_L），指组织样本所排开的生理盐水的重量（图1C, 图2B，以及 图 2C).
   9. 计算样品的体积（V_S) 来自 m_L，以及室温（20 °C）下生理盐水的密度（ρ_生理盐水 = 1.0048 g/cm³）作为 V_S = m_L/ρ_生理盐水 [克/克/立方厘米] (图1).
   10. 计算组织样本的密度（ρ_样本) 从重量中减去（即，样品的质量）m_S）及其体积（V_S): ρ_样本 = m_S/V_S [克/立方厘米] (图1).
   11. 对于已测量的器官 整体上重复测量三次，并根据单次测量值计算平均器官密度。对于较大的器官/组织，应使用同一器官/组织/器官区域的不同样本进行多次测量，并根据各单次测量结果相应地计算平均密度。
   12. 根据器官/组织/器官腔室的重量和密度计算其总体积（图1).
2. 应用卡瓦列里法测定猪器官体积⁷
   1. 准备材料：直尺、卡尺、刀、剪刀、镊子、防水笔、塑料透明片、扫描仪、照相机，以及印有网格线的塑料透明片。
   2. 将整个器官/组织置于平坦表面（切割基底）上，测量其长度（l器官沿其长轴的图3B, 图 5A).
   3. 将完整的器官/组织沿与器官纵轴垂直的方向切成等距的平行切片图3C, 图5B）。选择一个距离 d 两个切片之间（即，切片间隔/切片厚度通常约为1 cm，应足够小以获得足够数量的组织/器官切块。将第一个切面随机置于距器官边缘0至切片间隔距离的范围内。在切割过程中，通过肉眼判断每个切面的位置和方向，以获得大致平行且厚度基本均匀的器官/组织切块。
      注意：所需组织/器官切片的数量取决于被检器官/组织的形状和大小。若需将较小的器官或样本切成 ≤5 mm 的薄片，应在切片前将样本包埋于琼脂中（参见步骤 1.3.3），并使用切片仪器对包埋于琼脂中的样本进行切片。大多数猪器官和组织的经验性推荐切片间隔，以及切片装置的示例，详见补充材料 "猪类 biomedical 模型的组织取样指南"⁷.
   4. 将所有器官/组织块放置在切割底座的同一表面上，切面朝下即，始终位于每个器官切片的右侧或左侧切面 图3D, 图5C）并计数平板（n).
   5. 通过以下方法之一获取组织块的切片轮廓：
      1. 将组织块小心地放置在已正确标记的塑料透明片上，同时保持其上下表面的方向一致。使用防水笔在塑料透明片上描出组织块的轮廓图3E1-2).
      2. 拍摄组织切片时，将相机垂直置于切面正上方进行拍照图3F）。校准方法：将尺寸标尺置于组织块旁边。
      3. 使用平板扫描仪扫描组织切片时，需保持其上表面和下表面的方向不变（图3G）。校准步骤：将尺寸标尺置于组织切片旁。
   6. 通过以下方法之一测量所有组织切片（已描记、拍照或扫描）的截面轮廓面积：
      1. 将描出的器官切片轮廓与一张印有等间距十字线、大小合适且经过校准的塑料透明网格图重叠，计数所有落在轮廓区域内的十字点图3E3-4；与……比较 图5D）。通过将击中轮廓区域的交叉点数量乘以每个交叉点对应的面积，计算每个器官切片的轮廓区域。
         注意：为了获得足够精确的体积估算值，应选择相邻交叉点间距足够小的交叉网格，使得在研究中每例样本的单个器官切片表面上平均至少有100个交叉点落点。大多数猪器官和组织的经验性推荐交叉网格尺寸详见补充材料。 "猪类 biomedical 模型的组织取样指南"⁷.
      2. 使用适当的市售或免费形态测量软硬件应用程序，在照片/扫描的数字图像中测量组织切片的面积（图3H），例如商用图像分析系统²¹或 ImageJ²².
         警告：请注意，有一块组织切片（第一个或最后一个）在扫描时以其自然表面接触扫描仪，相应地，其自然表面朝向相机。因此，该组织切片的扫描图像或照片图像不会显示切面表面，因此无法对该组织切片的扫描图像或照片图像测量截面面积轮廓。图3I）。另请注意，在器官/组织切片的扫描图像和照片中存在过度投影现象， 即仅测量实际切片轮廓的面积，而不测量位于切片表面后方的组织在图像中的面积图12G-H).
   7. 将每例所有组织切片中相应断面轮廓面积之和相乘，计算估计的器官体积（即，分别对应右侧或左侧，每个器官切片的上表面或下表面，以及切片的平均厚度（即垂直器官轴测量长度（l）与切片数量的比值¹⁵.
3. 组织学样本处理过程中三维包埋相关组织收缩程度的测定
   1. 准备材料：切片机刀片、镊子、琼脂、金属铸模、数码扫描仪和尺寸尺（例如，坐标纸）
   2. 从固定组织样本上切取一个新鲜的平面切面。
      注意：若使用易变形（柔软）组织（如脂肪组织、胶状组织）的样本，在切片前应将固定后的组织样本包埋于琼脂中图 4A).
   3. 将样品包埋于琼脂中：
      1. 将用于微生物培养基的标准琼脂粉与适量水（约0.5–1 g 琼脂/10 mL 水）加入玻璃烧杯中。搅拌混合物，并在700 W微波炉中加热至沸腾，持续3–5秒。再次搅拌混合物，并重新加热至沸腾3–5秒。
      2. 可选地，为了增强琼脂与组织样本之间的对比度，可对液态琼脂进行染色， 例如，用黑色墨水（将1 mL墨水加入10 mL热液体琼脂中，充分搅拌）。
      3. 将热的琼脂倒入制胶模具中（例如用于石蜡包埋的金属模具 图10A- D）并将固定后的组织样本浸入温热的琼脂中。待琼脂冷却凝固后，取出模具，用切片机或剃刀片切割含有组织的琼脂块。
         警告：操作热液态琼脂时，需佩戴防护眼镜和手套。在通风橱内处理经甲醛溶液固定的组织样本，并佩戴防护眼镜和实验室手套。
   4. 将样本的切面朝下放置在平板扫描仪上， alongside 一把尺寸标尺，扫描其切面图 4A，B).
   5. 确定固定组织样本切面的面积（A_f) 在数字扫描图像中，使用步骤中所述技术之一 1.2.6 (图4B).
   6. 将样品包埋于塑料包埋介质中，例如环氧树脂（例如，环氧树脂（Epon）或甲基丙烯酸羟乙酯/甲基丙烯酸甲酯（GMA/MMA）²³，遵循标准操作规程^23,24,25 (图4C确保在塑料包埋样品中保留上一步（1.3.4）扫描的固定样品的切面表面。
      注意：为在样品处理过程中保持样品切面方向的一致性，应始终将样品的预定切面朝下放入包埋盒或包埋模具中，或使用墨水标记预定切面（或样品的对侧表面）。
   7. 使用切片机从与固定组织样本原始切面（步骤 1.3.2）相对应的塑料包埋块上切下组织学切片图 4D)，将切片置于载玻片上（图4D）并进行常规染色（例如，苏木精-伊红染色，H&E)^24,25.
      注意：为获得与固定组织样本原始切面大致相同平面的组织学切片，在切片前需仔细调整塑料包埋块在切片机夹具中的位置。
   8. 将带有染色切片的玻片连同尺寸标尺一起，切片面朝下放置在平板扫描仪上，扫描该切片（图4E).
   9. 确定塑料包埋组织样本切片的面积（A_e) 在数字扫描图像中，使用步骤 1.2.6 中描述的技术之一（图4F).
   10. 根据塑料包埋前后组织样本切面轮廓的实测面积，计算特定组织及包埋介质相关的平均包埋收缩率。线性收缩系数 f_s 计算为截面轮廓面积商的平方根 n 包埋于塑料包埋介质后的组织样本（A_e) 以及相同组织样本在包埋于塑料包埋介质之前对应切片的截面面积A_f) (图 4G)¹⁴.

2. 通过点计数法进行体积加权的系统随机取样及组织子样本的处理，用于不同类型的下游分析⁷

1. 准备材料：直尺、卡尺、刀、剪刀、镊子、防水笔、印有方格/十字网格的塑料透明片以及随机数字表。
   注：交叉网格（5–60 mm）的复制模板见补充材料 "猪类 biomedical 模型的组织取样指南"⁷.
2. 将器官/组织置于平坦表面（切割基底）上，测量其长度（l器官沿其长轴的）图 5A, 图6A).
3. 将完整的器官/组织沿其长轴垂直方向切成等距的平行切片图5B）。选择一个距离 d 两个切片之间（即，切片间隔/切片厚度通常约为1 cm，需足够小以获得足够数量的组织/器官切片。将第一个切面随机置于距器官边缘0至切片间隔距离之间的位置。在切割过程中，通过肉眼判断每个切面的位置和方向，以获得大致平行且厚度基本均匀的器官/组织切片。
   注意：所需组织/器官切片的数量取决于所检查器官/组织的大小以及取样部位的数量。若需将较小的器官或样本切成 ≤5 mm 的薄片，应在切片前将样本包埋于琼脂中（参见步骤 1.3.3），并使用技术设备对包埋于琼脂中的样本进行切片。大多数猪器官和组织的经验性推荐切片间隔，以及切片设备的示例，详见补充材料 "猪类 biomedical 模型的组织取样指南"⁷.
4. 将所有器官/组织块放置在切割基座的同一表面上，切面朝下图6B).
5. 将印有适当尺寸交叉网格的塑料透明片覆盖在组织块上，使网格最左上角的交叉点对准组织外的一个随机位置图5C- D, 图6B).
   注意：应选择相邻十字之间距离足够小的十字网格，以确保在研究的每个观察样本中，落在待取样组织区室切面区域上的十字数量至少是需从该组织区室获取样本数的两倍。大多数猪器官和组织推荐使用的十字网格尺寸见补充材料。 "猪类 biomedical 模型的组织取样指南"⁷.
6. 标记并计数所有落在组织（或待取样的组织亚区室）上的交叉点。在所有组织切片中，对落在待取样组织区室上的交叉点，应始终采用统一的计数与编号方式。 例如，通过逐行从左至右、从上至下对每行中相应的杂交组合依次编号，或 例如，通过按顺时针方向依次对一块又一块组织切片中的十字标记进行编号，起始于最接近12点钟位置的十字，示例见 图5E.
7. 将击中待取样组织/组织区域的十字数量除以n) 除以待生成的样本数量，以得到系统抽样间隔（i).
8. 通过选择一个随机数来确定第一个采样位置 x 1至 i。为此，使用随机数字表。标记第一个采样位置（x以及每一个后续的 x + i, x + 2i, x + 3i, 等等， 用防水笔在塑料透明纸上标记待取样的组织/组织区域图5F).
   注意：可使用在线随机数生成器方便快捷地生成随机数表。
9. 用镊子轻轻抬起塑料透明膜，将一小片干净的空白彩纸贴在组织切片表面，标记出与已标示的十字相对应的组织位置图 5G, 图6E).
10. 从采样部位切除组织标本（图5H, 图6F, 图7A）并进一步划分为不同类型以进行后续分析（图6G, 图7A-B)，如所述 表1.
11. 采样后，用温水和肥皂清洗塑料透明片，晾干后重复使用。

3. 用于定量体视学分析的各向同性均匀随机（IUR）切片和垂直均匀随机（VUR）切片的制备

1. "Isector" 技术
   1. 准备材料：剃刀或切片机刀片、琼脂、球形包埋模具（例如，用于制作松露巧克力的模具（可从糖果供应商处购得）、回形夹和镊子。
   2. 放置一块大小合适（1 x 1 x 1 cm）的组织³) 固定的、系统性随机取样的组织置于球形铸造模具中，用回形夹固定，并向模具中注入温热的液体琼脂（图8A-).
   3. 移除琼脂球（图8F琼脂凝固后，从铸模中取出。
   4. 将含有组织样本的琼脂球在桌面上滚动，停止后随机位置切片。
      注意：所得切面为IUR切面（图8F-).
   5. 继续将组织样本包埋于塑料树脂（如GMA/MMA）中，保持IUR切面平面的方向（见1.3.5）。
2. "取向器" 技术
   1. 准备材料：剃刀或切片机刀片、琼脂、镊子、随机数表、等角螺旋图和余弦加权圆图。
      注：圆形复制模板见于先前发表的文献^8,26.
   2. 将固定组织样本（或包埋于琼脂中的固定组织样本）置于等角圆形图上，使样本的一边与0–180°方向平行（图9A, 图10E).
   3. 使用随机数字表确定一个随机角度。在样本所放置的等角圆盘的刻度上找到对应的角度标记。利用这些标记，沿样本（或包埋组织样本周围的琼脂）切割一个切面，使切面方向与等角圆盘刻度所示的随机角度方向平行，并垂直于样本的放置表面。图9B- C, 图10F).
   4. 将组织块的切面朝下放置在余弦加权圆上，且支撑面的边缘与1-1方向平行图9D, 图10H).
   5. 重复步骤 3.2.3，使用随机数表确定一个随机角度，通过样品切割一个新的切面图9E- F, 图10I- J).
      注意：所得切面为无方向性均匀随机切面（IUR切面）。
   6. 如适用，测定固定组织样本的IUR切面轮廓面积，以确定包埋相关的组织收缩率图9G- J）按步骤1.3所述操作，并继续将组织样本包埋于塑料树脂（如GMA/MMA）中。
3. 垂直均匀随机（VUR）切片的制备
   1. 准备材料：剃刀或切片机刀片、琼脂、镊子、随机数字表以及等角圆的打印图。
      注意：圆形模板的副本已在先前的出版物中提供^8,26.
   2. 在固定组织样本中定义一个垂直轴，该轴在后续步骤中的样本/切片中始终可识别。
      注：通常选择与组织样本自然表面垂直的轴作为垂直轴。
   3. 如适用，将样本包埋于琼脂中（图11B).
      注意：对于体积小、薄、脆弱或柔软的样品，在进行VUR或IUR切片前，通常建议先进行琼脂包埋。此外，在将VUR切片后的样品进一步包埋于塑料树脂介质中时，也应使用琼脂包埋以方便样品的定位。
   4. 将样本放置在等角圆的印刷图上，其中垂直轴与桌面/纸面平面正交。图11C).
   5. 使用随机数字表确定一个随机角度，在与台面垂直且与垂直轴平行的切面方向上切割样本，以获得VUR切面（图11D).
   6. 如适用，按照步骤1.3所述，测定固定组织样本IUR切面的面积，以确定包埋相关的组织收缩率（参见 图9G- J）并继续将组织样本包埋于塑料树脂（如GMA/MMA）中。

结果

测定组织/器官密度的浸没法

图12A-B展示了使用步骤1.1中所述浸没法测定猪肾脏密度和体积的代表性结果（图1，图2）。其他猪器官和组织密度测量的更多代表性结果见表2。更全面的猪不同组织和器官参考密度列表可参见《猪类 biomedical 模型组织取样指南》⁷。通过同一样本的重复测量以及独立样本的多次测量，可评估浸没法所得组织密度测量值的有效性。大多数猪组织的密度值略高于水（ρ_water ≈ 1.0），而在生理盐水中漂浮的组织（如脂肪组织、肺组织）其密度<1.0。

讨论

从猪动物模型中建立生物样本库样本集，需要采用可靠的技术和方案，以准确测定器官/组织体积，可重复地生成适用于多种不同分析方法的具有代表性且冗余的组织样本，并实现样本切片方向的随机化，以满足定量体视学分析的要求。本文所述方法针对猪器官和组织的尺寸特点而优化设计，能够有效满足上述需求^2,7。这些方法基于公认的科学方法学原则，并已在多项已发表的研究中验证其可行性与实用性^2,7,12,21。所介绍的方法对于各类组织/器官样本研究具有重要意义，因其为获取代表性样本以及多种原本无法测定的参数提供了基础。这些方法操作快速、简便，且几乎兼容所有类型的下游分析。因此，不仅适用于猪动物模型生物样本库项目，也可广泛应用于其他大型动物模型物种（例如，绵羊）组织样本的定量组织形...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	卡尔·罗斯特有限公司，德国	琼脂（粉末），货号：5210.3	将约1 g琼脂溶于10 ml冷水中，置于玻璃或塑料烧杯中，于700 W微波炉中加热，剧烈搅拌下煮沸两次。趁热倒入模具，静置凝固。注意：操作热液态琼脂时，需佩戴防护眼镜和手套。
Caliper	Hornbach 建材市场有限公司，博恩海姆，德国	镀铬/镀镍刮刀 120 mm 货号：3664902	任何类型的卡尺（机械或电子）均可使用。
铸造模具（金属）	恩格尔布雷希特医疗 & 实验室技术，Edermü德国nde	包埋切片ä不锈钢冰盒，14 × 24 × 5 mm，货号：14302b	任何其他用于石蜡包埋的金属铸模也可使用。
复制交叉网格模板（5毫米 - 6厘米）	无可用数据	未提供	提供了交叉网格（5毫米 - 6厘米）的复制模板，详见补充数据文件 <强>Albl 等人  毒理病理学杂志. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
等角与余弦加权圆的模板复制	无可用数据	未提供	等角和余弦加权圆的模板已提供 <强>Nyengaard & Gundersen. 欧洲呼吸评论。15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) 以及在 <强>Gundersen 等人 毒理病理学家的体视学原理与取样程序。载于：哈舍克与鲁索´s《毒理病理学手册》。第3版，215-286页，ISBN: 9780124157590（2013年）。
折叠式夹子（YIHAI 文件夹夹，15 mm 和 19 mm）	中国宁波天虹文具有限公司	Y10006 和 Y10005	其他类型的普通办公用回折夹也可使用。
解剖镊	NeoLab Migge GmbH，德国海德堡	neoLab 标准镊子 130 mm，解剖型，圆形，货号：1-1811	任何类型的解剖镊均可。
4%甲醛溶液	SAV-Liquid Produktion GmbH，德国弗林茨巴赫	甲醛 37/40 %，货号：1000411525005	从浓缩液稀释至4%。用缓冲液调节至中性pH。佩戴适当的眼部、手部和呼吸防护装备。在通风橱内处理经甲醛溶液固定的组织样本，并佩戴防护眼镜和实验室手套。
坐标纸（用于校准）	Büromarkt Böttcher AG，耶拿，德国。www.bueromarkt-ag.de	A4 毫米坐标纸，货号：2514	任何类型的毫米刻度坐标纸均可使用。
实验室烧杯（5 ml，10 ml，50 ml，100 ml）	NeoLab Migge GmbH，德国海德堡	SIMAX烧杯® ，矮型，硼硅酸盐玻璃 3.3，货号：E-1031，E-1032，E-1035，E-1036	任何种类的5毫升玻璃或塑料烧杯 – 100 ml 体积即可。
实验室天平	梅特勒-托利多有限公司，吉ß德国	PM6000	任何标准实验室天平，其称量范围分别为0.1 mg至约20 g，或100 mg至约500 g，均可使用
	萨托里乌斯 AG，Gö德国哥廷根	BP61S
切片机刀片	恩格尔布雷希特医疗 & 实验技术，Edermü德国nde	FEATHER 切片机刀片 S35，货号：14700	任何类型的单次使用切片机刀片均可。
形态测量学/平面测量软件/系统	美国国立卫生研究院（NIH）	ImageJ	从 https://www.imagej.nih.gov/ij/（1997）下载。
蔡司-康特龙，埃兴，德国	VideoplanTM 图像分析系统	缺货
照相机	尼康	D40	任何可安装在三脚架上的数码照相机  将执行。
塑料透明胶片	Avery Zweckform GmbH，德国奥伯兰登	A4 激光覆膜膜片，货号：  3562	任何可（激光）打印的塑料胶片均可使用。
随机数字表	未提供	无可用数据	随机数表可使用随机数生成器（例如：https://www.random.org/）便捷地生成，可设定随机数的数量及数值区间。
剃刀刀片	Plano GmbH，德国韦茨拉尔	T5016	任何类型的剃须刀片均可使用。
尺子	Büromarkt Böttcher AG，耶拿，德国。www.bueromarkt-ag.de	Office-Point 直尺 30 厘米，塑料，透明，货号：ln30	任何一种厘米-毫米刻度的尺子也可以使用。
生理盐水（0.9%）	卡尔·罗斯特有限公司，德国	氯化钠 >99% 货号：0601.1	配制0.9%生理盐水，需将9 g NaCl溶解于1000 ml蒸馏水中，温度为20°C.
手术刀片	Aesculap AG & Co KG，德国图特林根	BRAUN 外科手术刀片 N°22	任何类型的手术刀片均可使用。
扫描仪	惠普	hp scanjet 7400c	任何能够以150-600 dpi分辨率进行扫描的标准办公扫描仪均可使用。
切片装置	未提供	未提供	可在以下找到自制切片装置的示例 <强>克努斯特 等 解剖学记录。292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) 及其补充数据文件中<强> Albl 等人  毒理病理学杂志。44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)。
球形铸造模具（例如，直径 25.5 mm）	Pralinen-Zutaten.de，德国温达赫	牛奶巧克力空心球，25.5 毫米	球形铸造模具可以自行制作，也可从其他糖果供应商处获取（例如用于制作巧克力松露）。此处提到的铸造模具实际上是空心巧克力松露外壳的包装/外皮（先食用松露，再利用其包装来制备i-sector切片）。
细金属丝	手工制作 & Hobby Schobes, Straßfurth，德国。www.bastel-welt.de	细金属丝（0.3 mm）货号：216464742	任何其他类型的细金属丝也可使用。
卫生纸	NeoLab Migge GmbH，德国海德堡	Declcate 白色任务擦拭巾，货号：1-5305	其他类型的实验室用纸巾也可使用。
防水笔	Staedler Mars有限公司 & Co KG，Nürnberg, 德国	Lumocolor 永久性记号笔 313，0.4 mm，S 型，黑色，货号：313-2	其他任何类型的防水笔也可使用。