通过液体荧光恢复法测定真菌病原体 Ustilago maydis 中的脂质指数

摘要

本文介绍了一种用于获取脂滴指数（LD指数）的实验方案，以研究在高通量培养实验中细胞内三酰甘油的动态变化。LD指数检测是一种简便且可靠的检测方法，采用BODIPY 493/503染料，无需进行繁琐的脂质提取或显微镜分析。

摘要

本文介绍如何实施脂滴指数（LD index）检测方法，这是一种灵敏的微孔板检测法，用于测定脂滴（LDs）中甘油三酯（TAGs）的积累情况。该方法无需进行脂质提取即可获得脂滴指数，能够在不同条件下（如在富营养或氮缺乏培养基中培养）对高通量实验中的脂滴含量进行定量分析。尽管该方法最初是为研究脂滴代谢而首次描述的 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 已成功将其应用于担子菌 Ustilago maydis有趣的是，由于脂滴（LDs）是在真核细胞中系统发育上保守的细胞器，该方法可广泛应用于多种细胞类型，从酵母到哺乳动物细胞均可适用。脂滴指数基于在淬灭条件下通过加入经甲醛固定的细胞，对BODIPY 493/503进行液体荧光恢复检测（LFR）而获得_. 碘化钾用作荧光淬灭剂。荧光与光密度斜率之间的比值称为LD指数。斜率由BODIPY荧光和600 nm处光密度（OD）所得直线计算得出。₆₀₀) 与样品添加量作图。最佳数据质量表现为相关系数等于或高于 0.9（r ≥ 0.9）。由于该方法可在微孔板中进行，因此可同时检测多个样品。由于 BODIPY 493/503 是一种亲脂性荧光染料，可分布于脂滴中，因此可用于多种积累脂滴的细胞类型。

引言

脂滴（LDs）是普遍存在于细胞内的脂肪结构，其核心由中性脂质组成，主要是三酰甘油（TAGs）和甾醇酯（SE）。核心外包裹着一层磷脂单分子层，该单分子层与多种蛋白质相互作用，例如 perilipin 蛋白以及参与中性脂质合成的酶类，如二酰甘油酰基转移酶、乙酰辅酶A羧化酶和酰基辅酶A合成酶¹。由于其动态特性，磷脂单分子层还含有能够水解TAGs和SE的三酰甘油脂肪酶²。根据细胞类型和生物体的不同，储存的中性脂质可用于能量生成，或用于合成磷脂和信号分子。在酵母及其他真菌中，脂滴的内容物会随着培养基中氮/碳比例的变化而改变，表明氮源可用性的降低可能是提高中性脂质产量的关键因素^3,4,5。酵母中大量产生TAGs在生物技术领域具有潜在应用价值，可作为生物燃料的来源，并可用于食品工业。某些储存的脂质含有高比例的多不饱和脂肪酸，如ω-3和ω-6，具有重要的营养和膳食意义^6,7,8,9,

方案

1. 缓冲液和溶液的配制

1. 配制1 L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7），溶解8 g NaCl、0.2 g KCl、1.44 g Na₂HPO₄，0.24 g KH₂PO₄ 在800 mL蒸馏水中，用HCl调节pH至7.0，然后加水定容至1 L。PBS可配制成10x储存液，在室温下保存。
2. 配制10 mL固定液：将1 mL 37%甲醛加入9 mL PBS中，使终浓度为3.7%。该溶液需现用现配。
   注意：操作甲醛溶液时需佩戴手套。
3. 配制淬灭溶液（500 mM）：将8.3 g碘化钾（KI）溶于100 mL蒸馏水中。使用前配制，并于室温保存。
4. 为配制 BODIPY 10 mM 储存液，将 10 mg BODIPY 493/503 溶于 3.8 mL 二甲基亚砜（DMSO）中。保存 100 µL 避光保存于 -70 °C.
5. BODIPY 的制备方法 5 µM淬灭溶液，加入 1 µL 将10 mM BODIPY 493/503加入2 mL 500 mM淬灭溶液中。对于LFR检测，终浓度为 5 µM 需要 BODIPY。
6. 为配制矿物溶液，加入 0.06 g H₃BO₃，0.14 g MnCl₂-4H₂O，0.4 g ZnCl₂₂

结果

LFR，以BODIPY 493/503作为荧光探针，是一种可靠且简便的方法，用于研究脂滴在活细胞中动态积累的过程 U. maydis 无论培养条件如何。当细胞在YPD培养基中培养时，脂滴（LD）指数在对数生长期增加，随后在稳定期下降（图 2A）。相比之下，在氮饥饿条件下培养的细胞中，无论是对数期还是稳定期，脂滴指数（LD index）均呈现持续上升的趋势（图 2B）。由于两种培养物的起始光密度相同（细胞数量相近），结果表明LFR检测法具有高灵敏度，可检测脂质含量的微小变化图2）。该方法的灵敏度通过共聚焦显微镜得到验证：YPD培养的细胞在整个细胞内含有许多小脂滴，而在氮饥饿条件下则显著产生大脂滴，通常每个细胞含有4-5个脂滴，（图2，右侧面板A和B）。由于脂滴指数并非中性脂质含量的绝对值，因此应构建脂滴指数与三酰甘油含量.......

讨论

LFR 是一种新方法，最初被应用于研究 S. cerevisiae 中的脂质代谢，随后成功应用于 U. maydis^20,21。尽管脂滴指数（LD index）不能提供细胞中积累的三酰甘油（TAGs）的绝对数值，但它能快速反映细胞的脂质含量，且在比较两种或多种实验条件下的脂滴指数时，数据解读十分直观。BODIPY 493/503 对中性脂质具有高度特异性，而中性脂质是脂滴的主要成分；其发射光谱较窄，因此在共聚焦显微镜观察细胞时，便于同时检测来自 Mito-tracker 或 CMAC blue 等其他染料的信号²⁶。与许多荧光分子一样，BODIPY 493/503 在荧光显微镜实验中易受光漂白影响，但通过在光照过程中添加抗光漂白试剂，可减轻这一现象²⁷。综上所述，BODIPY 493/503 可广泛用于多种细胞中，以研究中性脂质的积累与动员过程²¹

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分光光度计	Varioskan Lux 多功能微孔板读板仪	D5879	滤光片 493/503 或单色器检测器
Costar 板	Corning 公司	3615	96 孔黑壁透明底板
Costar 板	Corning 公司	3598	96 孔 Costar 细胞培养板
BODIPY 493/503	Invitrogen/Thermofisher	D3922	4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚并
甲醛溶液	Sigma Aldrich	252549	ACS 级试剂，37 wt% 水溶液，含 10-15% 甲醇以防止聚合
碘化钾	Sigma Aldrich	60399	BioUltra，≥ 99.5% (AT)
FB2 玉米黑粉菌（Ustilago maydis）	ATCC	201384	担子菌门-酵母
氯化钠	Sigma Aldrich	746398	ACS 级试剂，无机盐
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	P0662	ACS 级试剂
酵母提取物（Select Yeast Extract）	Sigma Aldrich	Y100	用于培养基的氨基酸、肽类、水溶性维生素和碳水化合物的混合物
N-Z 酪蛋白胨 Plus	Sigma Aldrich	N4642	牛乳酪蛋白酶解水解物
葡萄糖	Sigma Aldrich	G-8270	D (+) 葡萄糖
锥形摇瓶	Pirex	CLS4450250-6EA	硼硅酸盐玻璃
摇床	SEV México	INO650V-7	轨道摇床
台式离心机	Eppendorf	5415C	离心机
微量离心管	Sigma Aldrich	Z606340	Eppendorf
移液器吸头	Axygen Scientific	T-200-Y	带斜面末端的通用移液器吸头，200 微升，非无菌
mLine 多通道移液器	Biohit	725130	8 通道，体积范围 5–100 µL