本方案描述了使用体成分分析仪和代谢动物监测系统来表征小鼠体成分及代谢参数的方法。以高脂饮食诱导的肥胖模型为例，展示了这些技术的应用。
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本文内容
摘要
摘要
身体成分（脂肪或瘦体重）的变化、代谢参数（如整体耗氧量、能量消耗和底物利用）以及摄食和体力活动等行为，可为疾病潜在机制提供重要信息。鉴于身体成分和代谢在肥胖及其后续并发症发生发展中的重要性，在临床前研究中准确测量这些参数十分必要。过去几十年的技术进步使得能够在啮齿类动物模型中以非侵入性和纵向的方式获取这些测量数据。因此，这些代谢指标在评估基因操作（例如基因敲除或转基因小鼠、病毒介导的基因敲低或过表达）、实验性药物/化合物筛选以及饮食、行为或体力活动干预效果时具有重要应用价值。本文描述了使用动物监测系统在普通饲料喂养和高脂饮食喂养小鼠中测定身体成分和代谢参数的实验方案。
引言
代谢是维持正常细胞、器官及整体生理功能的基石。因此，在多种病理状态下，代谢的改变可能直接导致基础疾病的发生，也可能作为疾病的副作用而受到不利影响。传统上，代谢研究以及能量平衡相关研究主要集中于肥胖及其相关疾病领域，例如胰岛素抵抗、糖尿病前期、葡萄糖耐受不良、心血管疾病和糖尿病。鉴于这些疾病在全球范围内的患病率不断上升，以及它们对个人、社会和经济造成的巨大负担，此类研究具有充分的必要性。因此，开发预防策略和靶向肥胖的新型治疗方法，成为全球各地研究实验室持续追求的目标，而临床前小鼠模型在这些研究中被广泛依赖和使用。
虽然称量小鼠体重可提供体重增加或减少的可靠评估，但无法区分构成整体身体成分的不同组分（如脂肪质量、瘦体质量、游离水以及其他成分如毛发和爪子）。在实验结束且小鼠死亡后称量脂肪垫，虽能准确测量不同脂肪储存部位，但仅能提供单个时间点的数据。因此，通常需要纳入多个队列以研究肥胖随时间的发展过程，这显著增加了动物使用数量、实验时间和成本。双能X射线吸收测定法（DEXA）可用于评估体脂和瘦组织含量，并使研究人员能够纵向获取数据。然而，该方法需要对小鼠进行麻醉1，而反复麻醉可能影响脂肪组织的积累或其他代谢调节过程。EchoMRI利用核磁共振弛豫测量技术来测定脂肪质量、瘦体质量、游离水和总水量。该技术之所以可行，是因为不同组织成分之间可产生对比，通过生成的射频信号在持续时间、振幅和空间分布上的差异，实现对各类组织的区分与定量。该技术的优势在于其无创性、快速、操作简便，无需麻醉或辐射暴露，并且重要的是，其结果已通过化学分析方法得到积极验证2。
肥胖及相关研究的一个关键考虑因素是能量平衡方程。尽管脂肪积累比单纯的能量摄入（食物摄入）与能量消耗（能量支出）之间的关系更为复杂，但这两者仍是必须能够测量的重要因素。每日能量消耗由四个不同组分构成：（1）基础能量消耗（静息代谢率）；（2）食物摄入引起的饮食诱导性热效应所导致的能量消耗；（3）体温调节所需的能量；（4）体力活动所消耗的能量。由于能量消耗会产热，通过测量动物产生的热量（称为直接量热法）可用于评估能量消耗。另一种方法是测量吸入与呼出的O₂和CO₂浓度2 和 CO2，从而实现对全身体氧消耗量的测定2 消耗和CO2 产热，可用于间接测量（间接测热法）热量产生，进而计算能量消耗。食物摄入量的增加或能量消耗的减少将使小鼠倾向于体重增加，对这些参数变化的观察可为特定肥胖模型中可能的作用机制提供有用信息。另一个相关的代谢参数是呼吸交换率（RER），它是底物/燃料利用比例的指标即， 碳水化合物或脂肪）的代谢情况以及其用于产生能量的程度。因此，将食物摄入量（消耗的能量）与体力活动水平、O2 耗氧量、呼吸交换率（RER）和能量消耗可全面反映生物体的代谢特征。获取此类数据的一种方法是使用综合性实验室动物监测系统（CLAMS），该系统基于间接测热法测定能量消耗，同时具备通过测量舱内集成的秤重装置记录摄食量、以及通过光束中断次数评估体力活动水平的功能。
在本实验方案中，我们简明扼要地描述了如何使用体成分分析仪评估小鼠的体成分，以及如何利用代谢动物监测系统测量代谢相关指标。同时将讨论这些技术的应用注意事项与局限性，并提出建议的数据分析方法、结果解读方式及数据呈现形式。
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方案
所述所有实验均经阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物伦理委员会（AMREP AEC）批准，小鼠的饲养和护理均遵循澳大利亚国家卫生与医学研究委员会（NHMRC）关于动物实验的指南。动物可自由摄取指定饮食和饮水（ad libitum），并饲养于温度受控的环境（约21–22 °C），光照周期为12小时光照/12小时黑暗。7周龄雄性小鼠（C57Bl/6J背景）分别喂食普通标准饲料（能量含量14.3 MJ/kg，其中76%能量来自碳水化合物，5%来自脂肪，19%来自蛋白质；参见材料表）或高脂饲料（HFD）（能量含量19 MJ/kg，其中36%能量来自碳水化合物，43%来自脂肪，21%来自蛋白质，Specialty Feeds），持续3周。每周使用EchoMRI仪器测量体重和体成分，代谢监测分析则在喂养3周后通过CLAMS系统进行。
1. 身体成分分析仪操作步骤
注意： 本方案中使用的 EchoMRI 4-in-1 设备应放置在空气温度稳定、无波动的房间内，以确保其最佳运行状态。理想情况下，应持续监测环境温度。应尽量避免移动设备或中断电源。如果电源曾被中断且系统需要重新启动，则在再次使用前应至少让设备预热 2 - 3 小时。在开始操作前，请确保已佩戴适当的个人防护装备。
- 在扫描小鼠之前，对体成分分析仪进行系统测试。该测试需使用校准标准品（称为芥花油系统测试样品，Canola Oil System Test Sample，COSTS），以检测仪器的精确度，并确保其准确性未发生漂移。
- 打开系统软件，然后单击 系统测试工具栏按钮，或同时按下 "Alt + Y"。
- 在计算机执行系统测试前，请等待提示，确认已将正确的COSTS（本例中为小鼠专用COSTS）放置于仪器的扫描架内（图1）。确认无误后，接受并继续进行测试，测试过程需几分钟完成。
- 系统测试通过后，继续进行扫描。
- 若系统测试失败，请重复执行系统测试。
- 若仪器持续超出正常范围（表明已发生偏差），则可能需要进行校准以纠正问题。请按照软件提示或随设备提供的用户手册中的说明完成校准。若问题仍然存在，请查阅手册3，或向制造商技术支持团队报告问题并寻求进一步指导。
- 将小鼠放入小型动物样本架（长圆筒形）中，以确保其在仪器运行期间被安全固定。操作时，先将样本架水平放置，抓取小鼠并将其头部朝前插入圆筒开口中，然后缓慢而小心地将样本架竖直，使小鼠位于圆筒底部，准备进行分析。
- 小鼠放入样本架后，插入分隔器以限制其在测量期间的活动。在某些情况下，对于特别活跃的小鼠，可能需要用指尖固定分隔器。
注意：在首次分析前，应让小鼠预先适应样本架中的放置过程，以减少应激反应。使用红色样本架也可降低潜在的应激反应，因为小鼠会感觉处于黑暗环境中。 - 在软件中选择一个文件夹（文件夹工具栏）用于保存数据，并创建文件名。
- 如有必要，可通过增加扫描的初级累积次数来降低脂肪和瘦组织测量中的随机噪声。软件启动后，初级累积次数默认设置为日常使用推荐值；除非有特定原因需要更改参数，否则默认设置即可为用户提供所需的精确度。
- 若无需获取自由水和总水量数据，可通过选择选项卡设置为“否”来关闭水分检测阶段。此操作将显著缩短扫描时间并提高通量。
- 通过单击"开始扫描"或按键盘上的F5键启动扫描。输入有关动物的所有相关信息（例如，动物编号、体重、等），然后按"确定"或F5键开始扫描，扫描过程约需1分钟。
- 获取数据后，从仪器中取出装有小鼠的样本架，并将动物放回笼中。待所有动物扫描完成后，导出数据以进行进一步分析和汇总。
- 使用前后均应按照制造商的说明彻底清洁样本架。由于这些样本架由丙烯酸塑料制成，应避免使用异丙醇和乙醇，因其可能导致样本架开裂和/或迅速老化，从而增加破损风险。建议使用温热的洗碗水溶液清洗；如需更强的消毒效果，可使用F10消毒剂（1:125稀释）或其他消毒剂或清洁喷雾（参见材料表），然后擦拭干净。
2. 代谢动物监测系统操作步骤
注意：系统需要约 2 小时进行预热和稳定。如果仪器已关闭，则必须提前开机，以使氧化锆电池加热至 725 °C。此外，我们通常在将小鼠放入动物监测系统前 1 天，先将其置于体成分分析仪中，以避免因束缚应激引发的任何问题。
- 确保连接动物监测系统的计算机已开启，并打开控制程序。选择 "Oxymax 工具" 从工具菜单中选择选项以启动泵。
- 用适当的水灌满水瓶，称量小鼠体重并检查其健康状况，同时准备食物。若需在系统中测量食物摄入量，可考虑将食物研磨成粉。通过按压弹簧加载平台，将食物倒入料斗中。确保食物料斗和水瓶完全装满，以保证在规定的实验时间内有充足的食物和水供应。
- 检查干燥剂（Drierite）的状态；若使用的是带颜色指示的干燥剂，其颜色应为蓝色，表示干燥，但若变为粉红色或紫色，则表明已大量吸收水分，需要更换或补充。
- 检查氨气捕集器和苏打石灰的状态，必要时进行更换。若两个氨气捕集器同时连接使用，当第二个捕集器出现颜色变化迹象时，应更换第一个捕集器。二氧化碳水平升高时2 偏移也可能意味着需要更换苏打石灰。
注意：干燥剂可在烘箱中烘干后重复使用，但我们遵循该系统制造商的建议，每次均使用新的干燥剂。 - 组装实验舱。首先将食物漏斗置于天平上，然后将实验舱体放置在上方，确保带孔的平台作为舱底插入到位。小心地将小鼠放入实验舱内，随后用前后卡扣固定系统盖子，并在放置水瓶并扣紧之前确保盖子已牢固固定。作为预防措施，需再次检查所有实验舱盖、小鼠及水瓶（图2A-D).
注意：根据所检测小鼠的体型大小，可能需要调整食槽上方空间的高度，以确保小鼠能够接触到食物，但无法直接在喂食器上方睡觉。 - 由于建议每次实验前对气体传感器进行校准，因此请校准系统。
- 使用已知成分的气体（0.5% CO）2，20.5% O₂2，平衡氮气）。通过减压阀和软管将校准气罐连接至系统。打开气罐，确保输出压力显示为 5 - 10 psi。
注意：某些系统会配备第二个储罐、软管和调节器，用于使用纯氮气 "偏移量" 气体。我们所使用的系统则利用苏打石灰生成CO2 自由空气 - 遵循步骤校准 O2 和 CO2 传感器。选择 "校准" 从工具菜单中依次校准 O2 和 CO2校准前请确保：1）样品气流和参比气流均为0.400 LPM；2）氧化锆氧分析仪的O₂2 传感器温度为 725 °C (± 1 °C)，3）样品和参比干燥器及空气泵已开启，4）校准气体已连接并打开。
- 如有必要，在校准 O2 传感器，轻微调节氧化锆氧传感器前面的偏移控制，以达到所需的 O₂ 浓度2 比值为1.0000（±0.0002），以确保其处于可接受范围内（在计算机屏幕的软件显示中以绿色字体标示）。
- 成功完成O后2 和 CO2 传感器校准完成后，关闭校准气瓶并断开调节器上的软管。校准结束后，O2 参考空气（大气）的读数应为20.92（±00.02）。若校准超出容许范围，应重复校准，并参考制造商提供的故障排除指南。若仍无法解决，请联系制造商以获取进一步指导。
- 使用已知成分的气体（0.5% CO）2，20.5% O₂2，平衡氮气）。通过减压阀和软管将校准气罐连接至系统。打开气罐，确保输出压力显示为 5 - 10 psi。
- 继续进行实验设置。选择 "实验文件打开" 从实验菜单中选择合适的模板（例如， 小鼠）。在 "设置" 在实验菜单中定义应记录的实验参数（例如， 小鼠编号、体重、组别 等等。取消选择未使用的通道，并选择实验数据的保存位置。
- 确保称量设备已归零（若需测量食物摄入量），然后选择开始采集数据 "运行" 在实验菜单中。根据表型、机构关于动物隔离的指南以及系统使用情况，数据采集时长有所不同。
注意：在我们的实验中，通常持续进行48小时，前24小时用于动物对新环境的适应，后24小时用于数据分析。数据采集周期取决于研究者希望单独饲养小鼠的时间长短，并需符合动物伦理审批的要求。或者，如果条件允许，小鼠可在放入系统并连接前，先在检测舱内进行适应性饲养。当使用12舱系统时，每个舱室大约每13分钟被检测一次。 - 定期检查并监测小鼠在系统中时获得的结果，以确保动物福利并收集适当的数据。此阶段可发现任何问题并及时纠正。小鼠在系统中期间，每天早晨和傍晚均需检查每只小鼠的状况。
- 在数据文件页面顶部的代谢标签页中查看每只小鼠的实时采集数据，包括氧气消耗量、呼吸交换比（RER）和能量消耗。同时，光束中断次数和食物摄入量数据可分别在活动和摄食标签页中找到。请确认 "O2 在" 读数约为 20.90 - 20.94， "CO2 在" 约为 0.040 - 0.050，呼吸交换比（RER）在 0.7 至 1 之间，流速恒定在 0.5 - 0.6 L/min。
- 定期检查小鼠是否能够接触食物和水，并确认其摄食和饮水情况。确保小鼠未表现出任何痛苦迹象，例如在穿孔地板上挖掘行为。同时监测显示的实验结果。
- 在分配的实验时间结束时，选择 "停止" 从实验菜单中选择并导出结果（为 CSV 文件，文件>导出>生成用于分析的受试者 CSV 文件。
- 检查小鼠的健康状况，称重后放回原饲养笼。
- 小鼠在分离后再次合笼时可能会相互攻击，因此需密切观察。
- 拆卸笼具，清除食槽中的多余食物，并将笼内粪便、尿液和食物残渣倾倒干净。将水瓶和饮水管浸入稀释的T-bac溶液中浸泡，其他部件用稀释的次氯酸钠溶液清洗。用清水冲洗后，置于空气中自然晾干。
- 使用软件计算代谢参数。该软件利用多个方程式提供最终的数据输出4.
用于计算氧气消耗量和二氧化碳产生量： 氧气消耗：视频片段2 （LPM）= ViO2i - VoO2o; 二氧化碳产生VCO2 （LPM）=VoCO2o- ViCO2i
其中：Vi = 输入通气速率（LPM），Vo = 输出通风速率（LPM），O2i = O2 输入浓度，O2o = O2 输出浓度，CO2i = CO2 输入浓度，CO2o = CO2 输出浓度
呼吸交换率（RER）的计算：RER VCO2 / 视频操作2请注意，未测定蛋白质氧化，因此呼吸交换比（RER）未对此进行校正。
能量消耗的计算：能量消耗：CV = 3.815 + 1.232 × RER
热量（千卡/小时）= CV × VO2. 其中：CV 为热值（热量与耗氧体积之间的关系），该值来源于 "营养科学要素" 由格雷厄姆·卢斯克（Graham Lusk）编制的卢斯克表
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结果
如图3所示，通过EchoMRI测量发现，高脂饮食会导致身体成分参数出现典型变化。在基线时，各测量参数均无组间差异（图3A–F）。然而，在仅进行1周高脂饮食后，HFD组小鼠的体重、脂肪质量及脂肪质量百分比均显著增加（图3A、B、D）。在为期3周的饮食干预期间，两组之间这些指标的差异程度持续加大。瘦体质量、游离水含量和总水含量（图3C、E、F）在任何时间点均未出现组间差异。此外可以看出，普通饲料喂养的小鼠在整个研究期间持续增重（图3A），且该体重增加主要源于瘦体质量的增加（...
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讨论
关键步骤
本文所述方案示例介绍了如何使用体成分分析仪和动物代谢监测系统来测量小鼠的体成分及多种代谢参数。对于这两种技术，确保仪器处于最佳工作状态至关重要。因此，在使用设备前，研究人员必须对体成分分析仪进行系统测试，并使用已知气体成分对动物代谢监测系统进行校准。这将有助于提高实验结果的一致性，并及时发现仪器可能存在的问题。
在代谢动物监测实验中，数据的标准化方式对于确保所获得结果的有效性至关重要。如我们的代表性结果所示（图4A-E），VO2 可以以多种不同方式报告：其绝对速率（L/min）、相对于小鼠体重（mL/kg*min），或在数据可获得的情况下（例如通过体成分分析仪获得）相对于瘦体重（mL/kgLBM*min）。根据表型的不同，采用特定方式对数值进行标准化可能更为合适，以排除任何潜在的偏差。例如，若动物体重增加，则其拥有更多可消耗氧气的组织，因此其能量...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢阿尔弗雷德医学研究与教育园区动物服务（AMREP AS）团队工作人员在本研究中对小鼠的协助与护理，以及维多利亚州政府运营基础设施支持计划提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 四合一系统 | EchoMRI | 四合一系统 | 全身体成分分析仪 |
| 芥花油测试样品（COSTS） | EchoMRI | 小鼠专用（联系公司获取货号） | |
| 动物样本架 | EchoMRI | 103-E56100R | |
| 分隔器 | EchoMRI | 600-E56100D | |
| 12腔系统 | Columbus Instruments | 定制构建 | 代谢笼系统；包含控制程序 |
| 干燥剂（Drierite） | Fisher Scientific | 238988 | CLAMS耗材 |
| 校准气体罐 | Air Liquide | 按订单混合 | 气体校准（0.5% CO2, 20.5% O2, 余量为氮气）。 |
| 普通饲料 | Specialty Feeds | 辐照小鼠和大鼠饲料 | |
| 高脂饲料 | Specialty Feeds | SF04-001 | |
| 天平 | Mettler Toledo | PL202-S | 用于称量小鼠的天平 |
| TexQ 消毒喷雾剂 | TexWipe | ||
| 过氧化氢清洗液 | TexWipe | TX684 |
参考文献
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