从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

摘要

本文详细描述了一种从小肠免疫系统的诱导部位（包括肠道相关淋巴组织派伊尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（包括小肠固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。

摘要

肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面发挥着至关重要的作用，它能够对食物抗原和共生细菌产生耐受性免疫应答，同时对肠道致病微生物启动有效的免疫反应。此外，已有研究明确表明，局部肠道免疫对远端组织及全身性免疫具有深远影响。因此，研究肠道免疫应答的诱导机制及其免疫学结局显得尤为重要。本文详细描述了一种从肠道小肠的诱导部位（如肠相关淋巴组织中的派尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（如固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。该技术可在可接受的时间范围内，从小肠组织中分离出大量具有高纯度、高活性且交叉污染最少的淋巴细胞。成功分离肠道组织中的淋巴细胞及其他免疫细胞，有助于深入理解机体对胃肠道感染、肿瘤以及炎症性疾病的免疫应答机制。

引言

胃肠道（GI）具有许多褶皱和突起，构成了分隔机体内部与外部环境的最大界面。肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面发挥着至关重要的作用。它持续暴露于食物抗原、共生细菌以及致病性微生物之中。因此，该系统必须对食物抗原和共生细菌保持耐受，同时保留对肠道致病微生物迅速产生有效免疫应答的能力¹。肠道免疫系统在解剖结构上可分为诱导部位和效应部位：在诱导部位，由携带来自肠黏膜抗原的抗原呈递细胞激活初始淋巴细胞；在效应部位，活化的淋巴细胞执行特定的效应功能²。诱导部位包括派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PP）这一结构化的淋巴组织，其通过特化的M细胞直接监测肠腔内容物，以及区域引流的肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes, MLN）。效应部位则由固有层（lamina propria, LP）和肠上皮组成，其中固有层位于基底膜下方的结缔组织中，而肠上皮是位于基底膜上方的单层细胞结构，含有上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes, IEL）。淋巴细胞是适应性免疫的主要参与者，可介导针对感染和癌症的保护作用，也可能在炎症性疾病中参与免疫病理过程。深入研究这些不同解剖位置的黏膜区室中的淋巴细胞，对于更好地理解其诱导机制和效应功能具有重要意义且高度相关。

随着越来越多的研究人员关注肠道内发生的免疫事件，迫切需要一种相对简单且统一的方案，用于从这些区室中分离淋巴细胞。已有多个研究团队发表过从小鼠小肠不同区室分离免疫细胞的实验方案^3,4,5,6,7，这些方案在许多操作步骤上具有相似性。然而，由于各方案的具体目标不同，技术细节上仍存在若干差异。例如，针对从小肠固有层（LP）分离免疫细胞的方案中，有一项研究系统评估了不同酶消化方法对细胞活力、细胞表面标志物表达以及所分离免疫细胞组成的影响⁵。另一项方案则强调了一种无需密度梯度离心的快速且可重复的淋巴细胞分离方法⁶。此外，还有专门用于从小肠不同组织层分离单核吞噬细胞的特定方案⁷。本文介绍了一种高度可重复的实验方案，可依次从小鼠小肠的肠系膜淋巴结（MLN）、派尔集合淋巴结（PP）、固有层（LP）以及上皮内淋巴细胞（IEL）区室中分步分离淋巴细胞群体。

我们专注于从固有层（LP）和上皮内淋巴细胞（IEL）区室中分离出高纯度的细胞群体，这些细胞群体基本上不含其他肠道区室的污染物。该广泛使用的方案可在合理的时间范围内获得大量纯度最高且具有活性的淋巴细胞。^{4,8,9,10,11,12}该方案还能确保从固有层（LP）和上皮内淋巴细胞（IEL）区室中分离淋巴细胞时，最大限度地减少不同区室间的交叉污染，从而真实可靠地研究这些不同区室中的淋巴细胞。所分离的淋巴细胞可进一步用于流式细胞术分析或功能分析。该方案已成功应用于小鼠小肠和结肠在细菌感染期间的淋巴细胞分离，例如 单核细胞增生李斯特菌，鼠伤寒沙门氏菌，以及 假结核耶尔森菌 感染和炎症性疾病，如化学物质或病原体诱导的结肠炎。该方案还可用于从小鼠小肠和结肠中分离固有免疫细胞，例如树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞。

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院指南进行，并经石溪大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：在进行任何操作之前，必须确保已获得所有必要的批准。

1. 溶液配制

1. HGPG（HEPES、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和庆大霉素），100×
   1. 混合59.6 g HEPES（终浓度500 mM）、14.6 g L-谷氨酰胺（终浓度200 mM）、1×10⁶ U青霉素（终浓度2,000 U/mL）、1 g链霉素（终浓度2 mg/mL）和2.5 mg庆大霉素（终浓度5 µg/mL）。加入RPMI 1640培养基至总体积500 mL。用NaOH调节pH至7.5（调节前缓冲液呈黄色/橙色，pH约为6.0）。使用0.45 µm滤器过滤除菌。分装后可于-20 °C保存长达1年，或于4 °C保存长达1个月。
2. HEPES-碳酸氢盐缓冲液，10×
   1. ​称取23.8 g HEPES（终浓度100 mM）和21 g NaHCO₃（终浓度250 mM），加水至1,000 mL。用HCl调节pH至7.2。使用0.45 μm滤器过滤除菌。室温保存。该缓冲液pH会随时间变化，需定期重新调节pH。
3. 收获培养基（约1瓶/2只小鼠）
   1. 向500 mL RPMI 1640培养基中加入25 mL热灭活胎牛血清（终浓度5%）和5 mL 100× HGPG。4 °C保存，最长可保存6个月。
4. 二硫苏糖醇（DTE）溶液（40 mL/小肠）
   1. 混合50 mL 10×不含Ca₂⁺和Mg₂⁺的Hanks平衡盐溶液、50 mL 10× HEPES-碳酸氢盐缓冲液和50 mL热灭活胎牛血清（终浓度10%）。加入350 mL H₂O，并加入15.4 mg二硫苏糖醇/100 mL（终浓度1 mM）。使用前新鲜配制。
5. 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（50 mL/小肠）
   1. 将50 mL 10×不含Ca₂⁺和Mg₂⁺的Hanks平衡盐溶液与5 mL 100× HGPG混合，加入445 mL H₂O。再加入260 µL 0.5 M EDTA/100 mL（终浓度1.3 mM）。使用前新鲜配制。
6. 胶原酶溶液（30 mL/固有层淋巴细胞）
   1. 向500 mL RPMI培养基中加入50 mL胎牛血清（终浓度10% FBS）、5 mL 100× HPGP、1 mL 0.5 M MgCl₂（终浓度1 mM）和1 mL 0.5 M CaCl₂（终浓度1 mM）。加入I型胶原酶（终浓度100 U/mL）。使用前新鲜配制。
7. 密度梯度（DG）溶液
   1. 将90 mL DG储备液（参见材料表）与10 mL 10× PBS混合，配制成1× DG储备液。4 °C避光保存，保持无菌。
   2. 将44 mL 1× DG储备液与56 mL RPMI 1640混合，配制成44% DG溶液（每份上皮内淋巴细胞或固有层淋巴细胞样品需8 mL）。使用前新鲜配制。
   3. 将67 mL 1× DG储备液与33 mL RPMI 1640混合，配制成67% DG溶液（每份上皮内淋巴细胞或固有层淋巴细胞样品需5 mL）。使用前新鲜配制。

2. 肠系膜淋巴结、肠道和派尔集合淋巴结的分离

1. 使用二氧化碳麻醉法处死小鼠，并辅以颈椎脱位。将小鼠仰卧放置，用70%乙醇喷洒体表。用剪刀沿中线做切口，切开皮肤和腹壁以暴露腹膜腔。
2. 找到盲肠，用镊子轻轻向下牵拉盲肠。用镊子小心将小肠向右移动，暴露与结肠平行排列的整个肠系膜淋巴结链。
   注意：此前已描绘过肠系膜淋巴结链及肠道淋巴引流的示意图¹³.
3. 找到链中最靠近盲肠的底部淋巴结。用一把镊子夹住其周围的肠系膜/脂肪组织，另一把镊子轻轻夹住淋巴结周围的脂肪，从下至上逐步剥离，将肠系膜淋巴结链完整取出。
4. 将MLN链置于用收获培养基润湿的纸巾上。用两把镊子将MLN链在纸巾上滚动并撕去附着的肠系膜/脂肪组织。将MLN放入冷的收获培养基中，用于后续分离步骤。
   注意：（i）不建议直接操作淋巴结，应抓取其周围的肠系膜/脂肪组织。（ii）尽可能彻底清除肠系膜/脂肪组织对提高细胞活力至关重要。
5. 使用剪刀在幽门括约肌下方和盲肠上方切断小肠。用一把镊子从小肠末端（回肠）向十二指肠方向缓慢拉出肠管，同时用另一把镊子去除附着的肠系膜/脂肪组织。
6. 将肠道置于用收获培养基润湿的纸巾上，用两把镊子轻轻剥离残留的肠系膜或脂肪组织。
   注意：（i）为了获得最佳的细胞产量和活性，务必尽可能去除肠系膜和脂肪组织。（ii）在整个本步骤及后续操作中，需定期加入收获培养基以保持肠道组织湿润。
7. 使用弯头剪刀从肠道上剥离派伊尔结进行收集。如有需要，可借助解剖显微镜或放大镜（初学者建议使用）；经过训练的人员通常可直接肉眼识别大多数派伊尔结。从小肠中收集5–11个（典型数量）派伊尔结。将收集的派伊尔结置于预冷的收获培养基中，用于后续分离步骤。
   注意：派尔集合淋巴结是位于肠壁外侧、与肠系膜附着线相对处的小型、主要呈圆形的隆起结构。
8. 使用镊子的扁平一侧 轻柔地 将内容从十二指肠向回肠方向滑动，以排出粪便和黏液。重复一次，以去除大部分黏液。
   注意：黏液去除不完全会降低细胞活力和得率。然而，务必轻柔滑动肠道，以避免剥离绒毛或损伤基底膜。
9. 使用一端为钝头的精细剪刀，将钝头端插入肠管，沿纵轴从十二指肠至回肠剪开肠管。将打开的肠管横向切成约2厘米长的片段。将肠段放入50 mL锥形管中，加入25 mL冷收获液，用于后续分离步骤。
   注意：用培养基保持剪刀湿润可使其更顺畅地穿过肠道。

3. 诱导位点淋巴细胞的分离

1. 使用3 mL注射器的推杆通过70 µm细胞筛轻轻研磨，从肠系膜淋巴结（MLN）中分离淋巴细胞。用5 mL冷收获培养基冲洗细胞筛。
2. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，收集MLN细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于1 mL冷收获培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。
   注意：若在组织取出过程中发生出血，可使用红细胞裂解缓冲液去除红细胞。
3. 将派伊尔集合淋巴结（Peyer's patches）置于含有5 mL预热胶原酶溶液的15 mL圆底管中，在37 °C、220 rpm条件下孵育30分钟，以分离其中的淋巴细胞。
4. 在最大转速下涡旋震荡15秒，将消化后的组织和上清液通过70 µm细胞筛过滤至50 mL圆底管中。使用3 mL注射器的推杆轻轻研磨残留的组织碎片，并用5 mL冷收获培养基冲洗细胞筛。
5. 在4 °C下以400 × g离心5分钟，收集派伊尔集合淋巴结来源的细胞沉淀，并将细胞沉淀重悬于1 mL冷收获培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。
   注意：派伊尔集合淋巴结的分离过程中可能混有少量固有层淋巴细胞和上皮内淋巴细胞。

4. 小肠上皮内淋巴细胞的分离

1. 将小肠组织块用25 mL冷收获培养基上下颠倒混匀10次，洗涤3次，每次让组织块自然沉降后弃去上清液。
   注意：组织块应能迅速沉降至管底。若不能沉降，表明仍有过多肠系膜/脂肪附着，或组织块附有气泡。
2. 向含有小肠组织块的50 mL锥形管中加入20 mL预热的DTE溶液，转移至含搅拌子的50 mL硅化锥形烧瓶中。在磁力搅拌器上于37 °C、220 rpm条件下搅拌20分钟。使用外部大磁铁固定搅拌子，将组织和溶液转移回50 mL锥形管中。
3. 在最大转速下涡旋震荡管子10秒。通过70 µm细胞筛将上清液转移至新的50 mL锥形管中，注意保留原管中的组织块。切勿丢弃上清液；上清液中含有上皮内淋巴细胞。在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于10 mL冷收获培养基中，并置于冰上保存。
4. 向含有小肠组织块的50 mL锥形管中再次加入20 mL预热的DTE溶液，转移回含搅拌子的50 mL硅化锥形烧瓶中。在磁力搅拌器上于37 °C、220 rpm条件下搅拌20分钟。使用外部大磁铁固定搅拌子，将组织和溶液转移回50 mL锥形管中。
   注意：DTE是一种还原剂，可富集上皮内淋巴细胞。
5. 在最大转速下涡旋震荡管子10秒。将上清液通过70 µm细胞筛转移至前一步骤（步骤4.3）收集第一次DTE处理上清液的锥形管中。
   注意：剩余的小肠组织块用于分离固有层淋巴细胞。质量控制：可取出少量组织进行组织学检查，以确认上皮细胞存在且基底膜完整。
6. 将上清液在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于8 mL室温（RT）的44% DG溶液中。
7. 将8 mL 44% DG溶液/细胞悬液转移至一支17 mm ø × 100 mm、容量为14 mL的聚丙烯圆底管中。在其下方铺加5 mL室温（RT）的67% DG溶液。在室温下以1600 × g离心20分钟，离心过程中不启用刹车功能。
   注意：可预先用牛血清处理管壁，以防止细胞粘附于管壁。
8. 注意活细胞会在44%与67%界面处形成条带（即“血沉棕黄层”，buffy coat），死细胞和部分上皮细胞位于梯度顶部的黏液状薄膜中，红细胞则位于沉淀中。用真空抽吸法移除梯度顶部至界面以上约2 cm处的液体。使用巴斯德移液管收集界面处的血沉棕黄层，并转移至含有40 mL冷收获培养基的50 mL锥形管中。
9. 在4 °C条件下以400 × g离心5分钟，沉淀细胞。将细胞沉淀重悬于1 mL冷收获培养基中。使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

5. 小肠固有层淋巴细胞的分离

1. 向含有剩余肠道组织块的烧瓶中加入25 mL预热的EDTA溶液，以去除肠道组织块中的上皮细胞。将烧瓶置于磁力搅拌器上，在37 °C、220 rpm条件下搅拌30分钟。使用置于烧瓶外的大磁铁固定搅拌子，小心弃去上清液，同时保留烧瓶内的肠道组织块。
   注意：(i) EDTA是一种钙螯合剂，可作用于钙依赖性连接结构，促进肠道上皮细胞的脱落。(ii) 上清液应呈浑浊状，若需收集肠上皮细胞（IEC），可利用此上清液进行分离。
2. 重复步骤5.1。
   注意：此次孵育后上清液应较前次更澄清。质量控制：可取出一小块组织进行组织学检查，以确认肠道上皮细胞已被去除且基底膜保持完整；也可对上清液样本进行流式细胞术分析，以确认其中无白细胞（CD45⁺细胞）存在。
3. 向烧瓶中加入50 mL室温收获培养基。用磁铁短暂搅拌，待肠道组织块沉降后，小心弃去上清液。
   注意：此步骤旨在胶原酶消化前彻底去除EDTA，因为EDTA可通过螯合对胶原酶功能至关重要的钙离子而使其失活。
4. 向烧瓶中加入30 mL预热的胶原酶溶液，在37 °C、220 rpm条件下于磁力搅拌器上搅拌肠道组织块45分钟。
5. 将消化后的组织及上清液通过70 µm细胞筛过滤至50 mL锥形管中。使用3 mL注射器的推杆轻柔压碎残留的组织块使其通过滤网，并用10 mL冷收获培养基冲洗滤网。
6. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于8 mL室温44% DG溶液中。
7. 将8 mL 44% DG溶液/细胞悬液转移至一支17 mm ø × 100 mm、容量14 mL的聚丙烯圆底试管中，在其下方小心铺加5 mL室温67% DG溶液。于室温下以1600 × g离心20分钟，离心时不得启用刹车。
8. 用真空抽吸法去除顶部脂肪层。使用巴斯德吸管收集界面处的白膜层，并转移至含有40 mL冷收获培养基的50 mL锥形管中。
9. 在4 °C条件下，以400 × g离心5分钟收集细胞。将细胞沉淀重悬于1 mL冷收获培养基中，使用台盼蓝排斥法计数活细胞。

结果

该实验方案的示意图如（图1）所示。肠道黏膜的诱导位点和效应位点中的淋巴细胞具有明显不同的组织结构。派尔集合淋巴结（PP）和肠系膜淋巴结（MLN）中的淋巴细胞分布在结构清晰的T细胞区和B细胞滤泡中，而肠上皮内的淋巴细胞则呈更弥散的分布。固有层（LP）既含有弥散分布的淋巴细胞，也含有存在于组织化淋巴结构（如孤立淋巴滤泡（ILF）和隐窝斑块）中的淋巴细胞。每个肠道免疫区室还具有特征性的淋巴细胞亚群组成（图2）。MLN主要由αβ T细胞（约70%）构成，而PP淋巴细胞则主要为B细胞（约80%）。LP淋巴细胞的组成在很大程度上依赖于小鼠品系，但主要由αβ T细胞和B细胞构成。与其他肠道区室不同，位于上皮内的淋巴细胞主要是γδ T细胞（约60%）和αβ T细胞，几乎不含B细胞。不同解剖位置的肠道中，αβ T细胞亚群的比例也各不相同。LP中的αβ T细胞主要为CD4⁺ T细胞（约70%），而上皮内淋巴细胞（IEL）区室中则以CD8α^+<...

讨论

本文提供了一种从肠道黏膜诱导部位（肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结）及效应部位（固有层和上皮内淋巴细胞区室）分离淋巴细胞的详细方案。该方案经过优化，旨在平衡投入（时间）与产出（细胞活力和得率），以最大化实验效率和结果质量。同时，该方案可确保固有层与上皮内淋巴细胞区室之间发生最低程度的交叉污染。

已有多种从小鼠小肠中分离免疫细胞的方案发表^3,4,5,6,7。这些方案大多集中于从小肠固有层（LP）中分离免疫细胞。肠上皮是一个与LP不同的独立区室，直接暴露于外部环境，并含有组成独特的淋巴细胞群体。近年来的研究方法致力于通过同时分析不同肠区室来更全面地评估肠道免疫功能，以理解各区域免疫应答的独特特征及其相互关系。因此，亟需一种可靠的方案，用于从所有这些区室中分离免疫细胞。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	菲舍尔科技	BP310-500
L-谷氨酰胺	西格玛-奥德里奇	G3126-100G
青霉素-链霉素	生命技术公司	15140-122
庆大霉素	生命技术公司	15710-072
氢氧化钠	菲舍尔科技	S318-500
RPMI 1640	生命技术公司	21870-076
碳酸氢钠	菲舍尔科技	S233-500
胎牛血清	生命技术公司	26140-079
10倍浓度 Hank's 平衡盐溶液	西格玛-奥德里奇	H4641-500ML
1,4-二硫赤藓糖醇	西格玛-奥德里奇	D9680-5G
0.5 M EDTA，pH 8.0	生命技术公司	15575-020
六水合氯化钙	西格玛-奥德里奇	21108-500G
六水合氯化镁	西格玛-奥德里奇	M2670-100G
胶原酶 I 型	生命技术公司	17100-017
DG 梯度储备液（Percoll）	GE 医疗集团	17-0891-01
红细胞裂解缓冲液	生物传奇	420301
70-µm 细胞筛	康宁公司	352350
14 mL 聚丙烯圆底管	康宁公司	352059
锥形烧瓶	金布尔	26500R-50mL
磁力搅拌器	赛默飞世尔科技	50094596
搅拌子	菲舍尔科技	14-512-148