从小鼠小肠免疫系统中分离淋巴细胞

摘要

本文详细描述了一种从小肠免疫系统的诱导部位（包括肠道相关淋巴组织派伊尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（包括小肠固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。

摘要

肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面发挥着至关重要的作用，它能够对食物抗原和共生细菌产生耐受性免疫应答，同时对肠道致病微生物启动有效的免疫反应。此外，已有研究明确表明，局部肠道免疫对远端组织及全身性免疫具有深远影响。因此，研究肠道免疫应答的诱导机制及其免疫学结局显得尤为重要。本文详细描述了一种从肠道小肠的诱导部位（如肠相关淋巴组织中的派尔集合淋巴结和引流肠系膜淋巴结）以及效应部位（如固有层和肠上皮）分离淋巴细胞的实验方案。该技术可在可接受的时间范围内，从小肠组织中分离出大量具有高纯度、高活性且交叉污染最少的淋巴细胞。成功分离肠道组织中的淋巴细胞及其他免疫细胞，有助于深入理解机体对胃肠道感染、肿瘤以及炎症性疾病的免疫应答机制。

引言

胃肠道（GI）具有许多褶皱和突起，构成了分隔机体内部与外部环境的最大界面。肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面发挥着至关重要的作用。它持续暴露于食物抗原、共生细菌以及致病性微生物之中。因此，该系统必须对食物抗原和共生细菌保持耐受，同时保留对肠道致病微生物迅速产生有效免疫应答的能力¹。肠道免疫系统在解剖结构上可分为诱导部位和效应部位：在诱导部位，由携带来自肠黏膜抗原的抗原呈递细胞激活初始淋巴细胞；在效应部位，活化的淋巴细胞执行特定的效应功能²。诱导部位包括派尔集合淋巴结（Peyer's patches, PP）这一结构化的淋巴组织，其通过特化的M细胞直接监测肠腔内容物，以及区域引流的肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes, MLN）。效应部位则由固有层（lamina propria, LP）和肠上皮组成，其中固有层位于基底膜下方的结缔组织中，而肠上皮是位于基底膜上方的单层细胞结构，含有上皮内淋巴细胞（intraepithelial lymphocytes, IEL）。淋巴细胞是适应性免疫的主要参与者，可介导针对感染和癌症的保护作用，也可能在炎症性疾病中参与免疫病理过程。深入研究这些不同解剖位置的黏膜区室中的淋巴细胞，对于更好地理解其诱导机制和效应功能具有重要意义且高度相关。

随着越来越多的研究人员关注肠道内发生的免疫事件，迫切需要一种相对简单且统一的方案，用于从这....

方案

所有动物实验均按照美国国立卫生研究院指南进行，并经石溪大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：在进行任何操作之前，必须确保已获得所有必要的批准。

1. 溶液配制

1. HGPG（HEPES、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和庆大霉素），100×
   1. 混合59.6 g HEPES（终浓度500 mM）、14.6 g L-谷氨酰胺（终浓度200 mM）、1×10⁶ U青霉素（终浓度2,000 U/mL）、1 g链霉素（终浓度2 mg/mL）和2.5 mg庆大霉素（终浓度5 µg/mL）。加入RPMI 1640培养基至总体积500 mL。用NaOH调节pH至7.5（调节前缓冲液呈黄色/橙色，pH约为6.0）。使用0.45 µm滤器过滤除菌。分装后可于-20 °C保存长达1年，或于4 °C保存长达1个月。
2. HEPES-碳酸氢盐缓冲液，10×
   1. ​称取23.8 g HEPES（终浓度100 mM）和21 g NaHCO₃（终浓度250 mM），加水至1,000 mL。用HCl调节pH至7.2。使用0.45 μm滤器过滤除菌。室温保存。该缓冲液pH会随时间变化，需定期重新调....

结果

该实验方案的示意图如（图1）所示。肠道黏膜的诱导位点和效应位点中的淋巴细胞具有明显不同的组织结构。派尔集合淋巴结（PP）和肠系膜淋巴结（MLN）中的淋巴细胞分布在结构清晰的T细胞区和B细胞滤泡中，而肠上皮内的淋巴细胞则呈更弥散的分布。固有层（LP）既含有弥散分布的淋巴细胞，也含有存在于组织化淋巴结构（如孤立淋巴滤泡（ILF）和隐窝斑块）中的淋巴细胞。每个肠道免疫区室还具有特征性的淋巴细胞亚群组成（图2）。MLN主要由αβ T细胞（约70%）构成，而PP淋巴细胞则主要为B细胞（约80%）。LP淋巴细胞的组成在很大程度上依赖于小鼠品系，但主要由αβ T细胞和B细胞构成。与其他肠道区室不同，位于上皮内的淋巴细胞主要是γδ T细胞（约60%）和αβ T细胞，几乎不含B细胞。不同解剖位置的肠道中，αβ T细胞亚群的比例也各不相同。LP中的αβ T细胞主要为CD4⁺ T细胞（约70%），而上皮内淋巴细胞（IEL）区室中则以CD8α^+<.......

讨论

本文提供了一种从肠道黏膜诱导部位（肠系膜淋巴结和派尔集合淋巴结）及效应部位（固有层和上皮内淋巴细胞区室）分离淋巴细胞的详细方案。该方案经过优化，旨在平衡投入（时间）与产出（细胞活力和得率），以最大化实验效率和结果质量。同时，该方案可确保固有层与上皮内淋巴细胞区室之间发生最低程度的交叉污染。

已有多种从小鼠小肠中分离免疫细胞的方案发表^3,4,5,6,7。这些方案大多集中于从小肠固有层（LP）中分离免疫细胞。肠上皮是一个与LP不同的独立区室，直接暴露于外部环境，并含有组成独特的淋巴细胞群体。近年来的研究方法致力于通过同时分析不同肠区室来更全面地评估肠道免疫功能，以理解各区域免疫应答的独特特征及其相互关系。因此，亟需一种可靠的方案，用于从所有这些区室中分离免疫细胞。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HEPES	菲舍尔科技	BP310-500
L-谷氨酰胺	西格玛-奥德里奇	G3126-100G
青霉素-链霉素	生命技术公司	15140-122
庆大霉素	生命技术公司	15710-072
氢氧化钠	菲舍尔科技	S318-500
RPMI 1640	生命技术公司	21870-076
碳酸氢钠	菲舍尔科技	S233-500
胎牛血清	生命技术公司	26140-079
10倍浓度 Hank's 平衡盐溶液	西格玛-奥德里奇	H4641-500ML
1,4-二硫赤藓糖醇	西格玛-奥德里奇	D9680-5G
0.5 M EDTA，pH 8.0	生命技术公司	15575-020
六水合氯化钙	西格玛-奥德里奇	21108-500G
六水合氯化镁	西格玛-奥德里奇	M2670-100G
胶原酶 I 型	生命技术公司	17100-017
DG 梯度储备液（Percoll）	GE 医疗集团	17-0891-01
红细胞裂解缓冲液	生物传奇	420301
70-µm 细胞筛	康宁公司	352350
14 mL 聚丙烯圆底管	康宁公司	352059
锥形烧瓶	金布尔	26500R-50mL
磁力搅拌器	赛默飞世尔科技	50094596
搅拌子	菲舍尔科技	14-512-148