小鼠小肠免疫系统淋巴细胞的分离

胃肠道有许多褶皱和突起, 代表着分离内部身体和外部环境的最大界面。肠道免疫系统在维持胃肠道屏障功能方面起着至关重要的作用。它经常接触到膳食抗原、共生细菌和致病微生物。因此, 它必须保持对食物抗原和共生细菌的耐受力, 同时保持对致病微生物的有效免疫反应的能力 (¹)。肠道免疫系统可以解剖划分为诱导点, 在那里天真的淋巴细胞由抗原呈现细胞激活, 携带抗原从肠道粘膜, 和效应部位, 其中活化淋巴细胞发挥特定效应函数²。诱导部位包括 Peyer 斑块 (PP) 的组织淋巴结构, 通过专门的 M 细胞和区域引流肠系膜淋巴结 (MLN) 的作用直接调查肠道腔。效应部位由固有层 (LP) 组成, 它是基底膜下面的结缔组织, 肠上皮, 位于基底膜上方的一个细胞, 含有上皮内淋巴细胞 (IEL)。淋巴细胞是适应性免疫的主要参与者, 它可以调节对感染和癌症的保护, 也可能导致炎症性疾病的免疫病理。研究这些明显的解剖黏膜隔室中的淋巴细胞, 以更好地了解它们的诱导和效应功能, 具有重要的意义。

由于探索肠道中发生的免疫事件的调查人员数量正在加速, 因此需要一个相对简单和统一的隔离这些隔间淋巴细胞的协议。几个研究小组发布了一些协议, 它们共享几个类似的过程, 用于隔离来自小鼠小肠隔间的免疫细胞^3,4,5,6,7.但是, 它们之间存在着一些技术上的差异, 这取决于个别协议的重点。例如, 重点是将免疫细胞从 LP 中分离出来, 一项协议检查了各种酶消解对细胞活力、细胞表面标记表达和孤立免疫细胞组成的影响⁵。另一项协议突出了一种快速、可再生的方法, 用于分离无密度离心的淋巴细胞⁶。最后, 还存在特定的协议, 目的是从小肠的不同组织层分离单个核吞噬⁷。在这里, 一个高度可重复性的协议, 允许从 MLN, PP, LP, 和 IEL 室的小肠的顺序隔离淋巴细胞的数量。

我们专注于从 LP 和 IEL 隔间隔离高度纯净的人群, 这些舱基本上没有来自其他肠道的污染物。这种广泛使用的协议在可接受的时间限制范围内产生的最大纯和可行的淋巴细胞的高收益率^{4,8,9,10,11,12}。该协议还确保从 LP 和 IEL 室隔离淋巴细胞与最小的交叉区划污染, 使一个真正的机会来研究这些不同的舱室淋巴细胞。分离的淋巴细胞可以受到进一步的操作, 如流细胞分析或功能分析。该协议已成功地应用于分离的小鼠小肠和结肠在细菌感染, 如李斯特菌, 伤寒沙门氏菌和耶尔森氏杆菌假结核菌淋巴细胞。感染和炎症条件, 如化学和病原体引起的结肠炎。该协议也可用于分离先天免疫细胞, 如树突状细胞, 巨噬菌, 中性粒蛋白, 单核, 从小鼠小肠和结肠。

所有动物实验都是按照国家卫生研究院的指导方针进行的, 并经石溪大学机构动物护理和使用委员会批准。

注: 确保在执行程序之前授予所有批准。

1. 解决方案准备

1. HGPG (HEPES, l-谷氨酰胺, 青霉素/链霉素, 庆大霉素), 100×
   1. 混合59.6 克 HEPES (500 毫米最后), 14.6 克 l-谷氨酰胺 (200 毫米最终), 1×10⁶ U 青霉素 (2000 U/毫升最终), 1 克链霉素 (2 毫克/毫升最终), 和2.5 毫克庆大霉素 (5 µg/毫升最终)。添加 RPMI 1640 至500毫升。使用氢氧化钠调整 ph 值为 7.5 (在调整前, 缓冲器呈黄色/橙色, pH 值约为 6.0)。使用0.45 µm 过滤器进行杀菌消毒。整除和贮存在-20 摄氏度, 可达1年或4摄氏度, 可达1月。
2. HEPES-碳酸氢钠缓冲器, 10x
   1. 混合23.8 克 HEPES (100 mM 决赛), 21 克 NaHCO ₃ (250 毫米决赛), 并将水添加到1000毫升。用 HCl 将 pH 值调整为 7.2. 使用0.45 微米过滤器进行杀菌消毒。在室温下贮存。pH 值随时间变化。定期重新调整 pH 值。
3. 收获媒介 (~ 1 bottle/2 小鼠)
   1. 500毫升 RPMI 1640, 加入25毫升热灭活胎牛血清 (5% 最后), 和5毫升 100× HGPG。贮存6月至4摄氏度。
4. Dithioerythritol (DTE) 解决方案 (40 毫升/小肠)
   1. 混合50毫升10×汉克斯平衡盐溶液, Ca₂⁺-和 Mg₂⁺无, 50 毫升 10× HEPES-碳酸氢钠缓冲, 50 毫升热灭活胎牛血清 (10% 最后)。添加350毫升 H₂O 和15.4 毫克 dithioerythritol/100 mL (1 毫米决赛)。在使用前准备新鲜的。
5. 乙二胺四乙酸 (EDTA) 溶液 (50 毫升/小肠)
   1. 混合50毫升10×汉克斯平衡盐溶液, Ca₂⁺-和 Mg₂⁺-免费与5毫升 100× HGPG。添加445毫升 H₂o 添加260µL 0.5 M EDTA/100 mL (1.3 毫米决赛)。在使用前准备新鲜的。
6. 胶原酶溶液 (30 毫升/LP)
   1. 到500毫升 RPMI, 添加50毫升血清 (10% 血清最后), 5 毫升 100× HPGP, 1 毫升0.5 米氯化镁₂ (1 毫米决赛) 和1毫升 0.5 M CaCl₂ (1 毫米决赛)。添加胶原酶, I 型 (100 U/毫升最终)。在使用前准备新鲜的。
7. 密度梯度 (DG) 解决方案
   1. 通过混合90毫升的 dg 库存解决方案 (参阅材料表) 与10毫升的 10× PBS 一起准备 1× dg 库存解决方案。保持不育的4摄氏度。
   2. 通过混合44毫升 1× DG 股票溶液和56毫升 RPMI 1640, 准备 44% DG 溶液 (8 毫升/IEL, 8 毫升/LP)。在使用前准备新鲜的。
   3. 通过混合67毫升 1× DG 股票溶液和33毫升 RPMI 1640, 准备 67% DG 溶液 (5 毫升/IEL, 5 毫升/LP)。在使用前准备新鲜的。

2. 肠系膜淋巴结、肠道和 Peyer 斑块的分离

1. 弄死小鼠使用二氧化碳麻醉和继发性颈椎脱位。将鼠标放在背上, 用70% 乙醇喷雾。用剪刀做中线切口, 打开皮肤和腹壁, 露出腹腔。
2. 找到盲肠并使用镊子轻轻拉盲肠下来。使用镊子小心地将小肠移动到右侧, 露出整个 MLN 链, 它与结肠对齐。
   注: 一张肠系膜淋巴结链和肠道淋巴引流图以前被描述为¹³。
3. 识别链中最靠近盲肠的底部节点。使用一组钳来抓住它周围的肠系膜/脂肪, 并轻轻地删除 MLN 链从底部到顶端通过钳法脂肪从周围的淋巴结与另一套钳。
4. 将 MLN 链放在用收获介质浸湿的纸巾上。通过滚动纸塔上的链条, 用两套镊子将脂肪拔开, 以去除肠系膜/脂肪。将 MLN 放在冷收获介质中, 以便以后隔离步骤。
   注: (i) 不鼓励直接处理节点。相反, 抓住他们周围的肠系膜/脂肪。(二) 尽可能多地切除肠系膜/脂肪, 以改善细胞的生存能力是至关重要的。
5. 用剪刀切开幽门括约肌和盲肠以上的小肠。使用一组钳将小肠从回肠缓慢拉出, 并使用另一组钳去除附加的肠系膜/脂肪。
6. 将肚腑放在纸巾上, 用两套镊子蘸上一条沾有收割介质的纸巾, 并戏弄其余的肠系膜/脂肪。
   注: (i) 一定要尽可能多地去除肠系膜/脂肪, 以达到最佳的细胞产量和生存能力。(ii) 定期应用收获培养基, 使肠道湿润, 并采取以下步骤。
7. 收集 Peyer 的补丁, 从肠道取出他们的弯曲剪刀。如果需要, 使用解剖范围或放大镜 (初学者);大多数 Peyer 的补丁应该是可见的训练有素的眼睛。从小肠收集 5-11 (典型) Peyer 的补丁。将 Peyer 的补丁放在冷收割介质中, 以便以后隔离步骤。
   注意: Peyer 的斑块是小的, 主要是圆形突起在外肠壁对面的肠系膜附件。
8. 使用钳的平边和轻轻地从十二指肠向回肠滑动, 以排出粪便内容和粘液。重复一次以去除大部分粘液。
   注: 不完全清除粘液可降低细胞活力和产量。不过, 一定要轻轻滑动小肠, 以避免剥离绒毛或破坏基底膜。
9. 在一个点上使用钝端的细剪刀, 将钝端插入肠道, 并从十二指肠向回肠纵向切开肠道。侧面切开被打开的肚腑入 ~ 2 cm 片断。将肠道部分放置在50毫升圆锥管中, 25 毫升冷收获介质, 用于以后的隔离步骤。
   注意: 把剪刀沾上介质会帮助他们毫不费力地滑过肠道。

3. 从感应部位分离淋巴细胞

1. 使用3毫升注射器的柱塞, 通过70µm 细胞过滤器轻轻游离, 将淋巴细胞从 MLN 中分离出来。用5毫升的冷收获介质冲洗细胞过滤器。
2. 颗粒 MLN 细胞由离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
   注: 红细胞溶解缓冲液可用于去除红细胞中的出血。
3. 通过在5毫升 prewarmed 胶原酶溶液的15毫升锥形管中孵化 Peyer 的斑块, 在37摄氏度和220转30分钟内, 从 Peyer 的斑块中分离出淋巴细胞。
4. 漩涡为十五年代在最大设置和过滤器被消化的组织和上清入50毫升圆锥管通过一个70µm 细胞滤网。用3毫升注射器的柱塞轻轻地将剩余的组织块分开, 用5毫升的冷收获介质冲洗细胞过滤器。
5. 颗粒 Peyer 的补丁细胞由离心在 400 x g 5 分钟在4°c 和并用重悬细胞颗粒在1毫升冷收获媒介。使用台盼蓝排除计数可行细胞。
   注意: Peyer 的斑块分离可能有一些污染的固有的细胞和上皮内淋巴细胞。

4. 小肠上皮内淋巴细胞的分离

1. 用25毫升的冷收获培养基将小肠洗净三次, 通过将管反转10次, 让肠道部分沉淀, 并从上清中倾泻而出。
   注意: 组织件应容易沉淀到管子的底部。如果他们不这样做, 这表明太多的肠系膜/脂肪仍然附着或与气泡有关。
2. 将20毫升的 prewarmed DTE 溶液添加到含有肠道块的50毫升圆锥管中, 并转移到含有搅拌棒的50毫升渗锥形瓶中。搅拌在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器20分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆和转移组织和解决方案回到50毫升圆锥管。
3. 涡流管在最大设置为十年代. 通过70µm 细胞过滤器将上清液转移到新的50毫升锥形管中, 小心地将组织片放在原管中。不要丢弃上清;上清液含有上皮内淋巴细胞。颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。在10毫升的冷收获介质中并用重悬细胞颗粒, 储存在冰上。
4. 将20毫升的 prewarmed DTE 溶液添加到含有肠道片的50毫升圆锥管中, 然后转回到含有搅拌棒的50毫升渗锥形瓶中。搅拌在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器20分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆和转移组织和解决方案回到50毫升圆锥管。
   注意: DTE 是一种能丰富上皮内淋巴细胞的还原剂。
5. 涡流管在最大设置为十年代. 将上清液通过70µm 细胞过滤器转移到前一管, 其中包含第一个 DTE 治疗的上清液 (从步骤 4.3)。
   注意: 其余的肠块用于分离固有层的淋巴细胞。质量控制: 一个组织可以切除和检查组织学, 以确保上皮细胞存在, 基底膜是完整的。
6. 颗粒细胞通过离心上清液在 400 x g 5 分钟在4摄氏度。并用重悬细胞颗粒在8毫升 44% DG 溶液室温 (RT)。
7. 将8毫升 44% DG 溶液/电池悬浮液转移到17毫米直径 x 100 mm 型14毫升聚丙烯圆底管。衬底与5毫升 RT 67% DG 溶液。离心机在 1600 x 克20分钟的 RT 不使用刹车。
   注: 可以用牛血清预处理导管, 防止细胞黏附在管壁上。
8. 请注意, 在44% 到67% 界面上, 存活的细胞形成一条带 (粘液), 死细胞和一些上皮细胞位于梯度顶端的一层膜中, 红血球在颗粒中。通过真空吸尘, 将渐变的顶层移至界面的2厘米以内。使用巴斯德吸管在界面上收获菲比涂层, 并将其转移到含有40毫升冷收获介质的50毫升圆锥管上。
9. 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。

5. 小肠内固有细胞的分离

1. 将25毫升的 prewarmed EDTA 溶液加入含有剩余肠道的烧瓶中, 去除肠道组织块中的上皮细胞。搅拌瓶在37°c 和 220 rpm 上的磁力搅拌器30分钟. 使用大磁铁在瓶的外部举行搅拌杆, 并小心地丢弃上清, 同时保持肠块内的瓶子。
   注: (i.) EDTA 是一种钙离子螯合剂, 它靶向钙依赖的结点, 并促进肠道上皮细胞的脱离。(二) 上清应该是多云的, 并可用于隔离 IEC, 如果他们需要收集。
2. 重复步骤5.1。
   注: 此孵化后上清液应少多云。质量控制: 一个组织可以切除和检查组织学, 以确保肠道上皮细胞已被删除, 基底膜是完整的。从上清液中抽取的样品也可以通过流式细胞仪进行评估, 以确认白细胞 (CD45⁺细胞) 不存在。
3. 在烧瓶中加入50毫升的 RT 收获培养基。用磁铁简单搅拌。让肠道块安定下来, 小心地丢弃上清。
   注: 这一步骤确保在胶原酶消化前, 通过螯合钙对胶原酶的作用至关重要的钝化酶去除 edta。
4. 添加30毫升的 prewarmed 胶原酶溶液的烧瓶, 并在37°c 和 220 rpm 在一个磁性搅拌器45分钟搅动肠道部分。
5. 通过70µm 细胞过滤器, 将消化组织和上清液转移到50毫升锥形管中。使用3毫升注射器的柱塞, 通过过滤器, 轻轻地分离剩余的组织块。用10毫升的冷收获介质冲洗过滤器。
6. 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬8毫升环境温度 44% DG 溶液中的细胞颗粒。
7. 将8毫升 44% DG 溶液/电池悬浮液转移到17毫米直径 x 100 mm 型14毫升聚丙烯圆底管。衬底与5毫升的环境温度 67% DG 溶液。离心机的梯度在室温和 1600 x g 20 分钟, 没有刹车。
8. 用真空吸尘去除上面的脂肪层。使用巴斯德吸管在界面上收获菲比涂层, 并将其转移到含有40毫升冷收获介质的50毫升圆锥管上。
9. 颗粒细胞通过离心在 400 x g 5 分钟在4°c。并用重悬1毫升冷收获介质中的细胞颗粒。使用台盼蓝排除计数可行细胞。

描述了协议的示意图表示形式 (图 1)。肠道粘膜诱导和效应部位的淋巴细胞有明显的组织。Peyer 的斑块 (PP) 和肠系膜淋巴结 (MLN) 在组织良好的 T 细胞区和 B 细胞卵泡中含有淋巴细胞, 而肠道上皮则含有更弥漫分布的淋巴细胞。固有层 (LP) 包含弥漫分布淋巴细胞和淋巴细胞, 如分离的淋巴滤泡 (ILF) 和 cryptopatches 的组织淋巴结构中。每个肠道免疫室也具有独特的淋巴细胞子集组成 (图 2)。MLN 主要由αβ T 细胞 (~ 70%) 组成, 而 PP 淋巴细胞大多为 B 细胞 (~ 80%)。LP 淋巴细胞组成主要由αβ T 细胞和 B 细胞组成。与其他肠道隔间不同, 住在上皮细胞的淋巴细胞主要是γδ t 细胞 (~ 60%) 和αβ t 细胞, 基本上没有 B 细胞。αβ T 细胞亚群的不同比例也存在于不同的肠道解剖位置。LP 中的αβ t 细胞主要是 CD4+ t 细胞 (~ 70%), 而 CD8α+ t 细胞 (~ 85%) 在上皮内淋巴细胞 (IEL) 室中占主导地位。CD8α中的+ αβ t 单元格在 LP 和 IEL 间隔内表示 CD8αα homodimer 或 CD8αβ heterodimer 而感应站点 CD8α+ αβ T 细胞主要表示 CD8αβ heterodimer (图 3)。IEL 室中的大多数γδ t 细胞也表达 CD8α, 而 MLN 缺少 CD8α的γδ t 细胞 (图 3)。无论是笼统的, 淋巴细胞亚群的组成可以变化的小鼠菌株和可能会改变与年龄或疾病。因此, 应在用于实验操作的背景应变中, 对稳态肠道黏膜内淋巴细胞种群进行细致的分析。

根据小鼠的应变和年龄, 以及所使用的实验条件, 细胞产量可能会有很大差异。单, 活细胞可以计数的 hemocytometer 或自动计数机使用台盼蓝排除。淋巴细胞的数量计算为: 4 号门 (图 2) 中 3 x 淋巴细胞 (%) 中的细胞计数 x CD45+单元格 (%)。大约 15 x 106 MLN 淋巴细胞, 5-10 x 106 PP 淋巴细胞, 2-5 x 106 LP 淋巴细胞, 3-6 x 106 IEL 可以从8到12周的天真 C57Bl/6 或 Balb/c 鼠标获得。或者, 基于流的计数珠可以用来量化细胞的数量, 并告诫说, 细胞损失发生在染色过程中。最后, 在实验室中必须保持计数技术的一致性, 以确保在实验中进行适当的比较。

在本协议中, DTE 治疗用于丰富 IEL, 其次是 EDTA 治疗, 以去除 IEC, 以最佳隔离高浓缩淋巴细胞。两个 DTE 治疗足以隔离 > 95% 的 IEL。在 EDTA 治疗中也可以找到极少量的淋巴细胞。这些淋巴细胞类似于 IEL 和 LP 淋巴细胞的混合物 (图 4)。还对 dte 治疗和 dte-EDTA 联合治疗分离 IEL 进行了比较。DTE-EDTA 联合治疗增加了 IEL 制剂中的 IEC 污染 (图 5), 并降低了密度梯度离心后活免疫细胞的最终产量。密度梯度离心是建议, 以隔离淋巴细胞的肠道间隔。它去除死细胞, 许多上皮细胞和粘液, 促进高度丰富的淋巴细胞的分离和大幅减少流式细胞采集时间 (图 6)。

图 1.隔离协议流程图.DTE, dithioerythritol。EDTA, 乙二胺乙酸。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2.肠道组织淋巴细胞群的流式细胞术门策略.从肠系膜淋巴结 (MLN)、固有层 (LP)、Peyer 斑块 (PP) 和上皮内淋巴细胞 (IEL) 室中制备的单细胞悬浮液染色, 其活性染料 (如活/死) 和以下荧光标记抗体: CD45 用于鉴定造血细胞、CD19 B 细胞、CD3ε t 细胞、t 细胞受体 (TCR) βαβ t 细胞、TCRδγδ t 细胞、CD8α CD8α+ αβ t 细胞和 CD4 CD4+ αβ t 细胞。0号门显示了前向散射 (FSC)--a/侧散射 (SSC)--属性。1号门识别出单个细胞。2号门识别活细胞。3号门发现了造血细胞。4号门基于 FSC-a/SSC 的特性确定的淋巴细胞。5号门识别出 T 细胞和 B 细胞。6号门确定αβ t 细胞和γδ t 细胞之间的总 t 细胞。7号门在αβ t 细胞群中确定了 CD8α+和 CD4+ t 细胞。假彩色地块内的百分比 (以红色字体表示) 对应于前面的父母群体中所指明门内的细胞频率。0号门和1号门显示全部事件。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3.表型 ofCD8α+ αβ t 细胞和肠道组织中的γδ t 细胞.CD8β的表达 CD8α+ αβ t 细胞和 CD8α的表达γδ t 细胞描述。直方图内的百分比 (以红色字体表示) 对应于表示父母群体中表示标记的单元格的频率。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4.从 DTE、EDTA 和胶原酶治疗淋巴细胞的组成。家长门策略与在图 2中的相同。5号门识别出 T 细胞和 B 细胞。6号门确定αβ t 细胞和γδ t 细胞之间的总 t 细胞。7号门在αβ t 细胞群中确定了 CD8α+和 CD4+ t 细胞。假彩色地块内的百分比 (以红色字体表示) 对应于前面的父母群体中所指明门内的细胞频率。EDTA 分离的淋巴细胞与从 DTE 和胶原酶治疗分离的 IEL 和 LP 淋巴细胞的混合物相似。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5.dte 治疗与联合 dte-EDTA 治疗 IEL 分离的比较.DTE 治疗根据这项协议执行。IEL 在 DTE 治疗和 EDTA 治疗之前被收集了。DTE-EDTA 联合治疗是在相同浓度的情况下进行的, 但同时使用。CD45+造血细胞的属性、生存能力和百分比显示为 FSC/SSC。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6.密度梯度离心对 IEL 和 LP 淋巴细胞制剂纯度的影响.根据该协议隔离的单细胞悬浮液受密度梯度离心或流式细胞仪直接分析。CD45+造血细胞的属性、生存能力和百分比显示为 FSC/SSC。请单击此处查看此图的较大版本.

作者没有什么可透露的。