我们描述了一种手术暴露并稳定小鼠下颌下唾液腺以进行活体成像的方案，该方案采用直立式活体显微镜技术。此方案可轻松适用于小鼠及其他小型啮齿类动物头颈部其他外分泌腺的活体成像研究。
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摘要
摘要
下颌下腺（SMG）是三大主要唾液腺之一，是细胞生物学、肿瘤学、牙科学和免疫学等多个生物研究领域关注的重要器官。SMG是一种外分泌腺，由分泌性上皮细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、神经以及细胞外基质组成。以往对大鼠和小鼠SMG中的动态细胞过程进行成像时，主要采用倒置多光子显微镜系统。本文介绍一种简便的实验方案，用于在麻醉小鼠中对外科暴露并稳定小鼠SMG，以进行 体内 使用直立式多光子显微镜系统进行成像。我们展示了内源性及过继转移的荧光标记细胞的代表性活体图像，包括血管或唾液导管的标记以及利用二次谐波生成技术对纤维状胶原进行可视化。综上所述，本方案可实现小鼠唾液腺在直立式显微镜系统中的手术制备，此类系统在免疫学领域的活体成像研究中被广泛使用。
引言
唾液由外分泌腺分泌，用于润滑食物、保护口腔黏膜表面，并输送消化酶以及抗菌物质1,2。除了散布于口腔黏膜下的小唾液腺外，根据位置不同，还可分为三对大唾液腺，分别为腮腺、舌下腺和下颌下腺（submandibular gland, SMG）1,2。呈金字塔形的上皮细胞排列成烧瓶状的小囊（腺泡）或半月形结构，周围由肌上皮细胞和基底膜包绕，负责分泌唾液中的浆液性和黏液性成分1。腺泡狭小的管腔汇入闰管，再逐渐汇合成纹状管，最终汇入单一的排泄管1。下颌下腺的主要排泄管称为沃顿管（Wharton's duct, WD），开口于舌下肉阜3,4。因此，下颌下腺的上皮部分构成一个高度分支的结构，具有大量终末分支点，形似一串葡萄1,5,6。下颌下腺的间质由嵌于结缔组织中的血管和淋巴管组成7，其中含有副交感神经8和细胞外基质5。正常的人类和啮齿类动物唾液腺中还含有T细胞、巨噬细胞和树突状细胞9，以及可向唾液中分泌免疫球蛋白A（Immunoglobulin A, IgA）的浆细胞9,10。由于其在健康与疾病状态下的多种功能，下颌下腺已成为多个生物学研究领域关注的对象，包括牙科学4、免疫学11、肿瘤学12、生理学8和细胞生物学3。
对动态细胞过程和相互作用进行成像，是生物研究中一种强大的工具13,14。深层组织成像技术的发展以及基于非线性光学（NLO）显微镜的创新，使得能够直接观察复杂组织中的细胞过程13,15。非线性光学技术依赖于样品对多个光子的散射或吸收。多光子吸收通过低能量光子传递总激发能量，将荧光分子的激发限制在焦平面内，从而在减少离焦激发引起的光损伤和背景噪声的同时，实现更深的组织穿透13,15。双光子显微镜（2PM）正是利用了这一原理，可对荧光样本实现深达1 mm的成像15,16。尽管目前商用的2PM系统已具备良好的易用性和可靠性，活体成像的主要挑战仍在于如何小心地暴露并稳定麻醉小鼠的目标器官，尤其是在进行时间序列成像时。已有多种在数据采集后进行数字漂移校正的方法被报道17,18，我们近期开发了"VivoFollow"，这是一种自动化校正系统，可通过计算机控制的载物台实时补偿缓慢的组织漂移19。然而，要获得高质量的成像结果，仍需尽可能减少组织运动，尤其是由呼吸或心跳引起的快速移动19。目前已有针对多种器官的制备与稳定方法被发表，包括脊髓20、肝脏21、皮肤22、肺23和淋巴结24。此外，大鼠唾液腺成像模型也已建立3,25，并进一步优化，发展出适用于倒置显微镜系统的高分辨率小鼠下颌下腺（SMG）活体成像模型26,27,28。
本文介绍了一种利用直立式非线性显微镜对小鼠颌下腺（SMG）进行活体成像的实用且可调的实验方案，该显微技术在免疫学领域的活体成像研究中被广泛应用。为此，我们改进了一种常用于腘窝淋巴结制备的固定装置。
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方案
所有动物实验均已获得州动物实验委员会批准，并依照联邦指南进行。
1. 麻醉小鼠
- 穿戴个人防护装备，包括实验服和手套。
- 将氯胺酮、赛拉嗪和生理盐水混合，配制成工作浓度分别为20 mg/mL和1 mg/mL的混合溶液。按每克小鼠体重8–10 µL的剂量，进行腹腔内（i.p.）注射。将小鼠放回笼中。
注意：本方案已针对6至40周龄、C57BL/6背景的雄性和雌性小鼠进行过测试。 - 配制浓度为 2.5 mg/mL 的乙酰丙嗪溶液，在氯胺酮-赛拉嗪注射后 15 分钟，按每只小鼠 30 µL 经腹腔注射（75 µg/小鼠）。
- 5–15 分钟后，通过检测反射判断麻醉和镇痛是否充分， 例如，足部退缩反射或角膜反射。
- 在整个实验过程中，大约每 30 分钟检查一次反射情况。若反射呈阳性，应每 60 分钟或更早时间间隔，按每克小鼠体重 1.5 µL 的剂量皮下注射氯胺酮/赛拉嗪。
注意：由于小鼠已被固定，无法使用异氟烷等吸入式麻醉。
2. 去除手术区域的毛发
- 使用电动剃须刀剃除从口部后方约5 mm处向前后肢延伸、并覆盖下颌至双耳区域的毛发。
- 用棉签将脱毛膏涂抹于剃毛区域，3分钟后仔细彻底清除。 例如，用湿巾擦拭。
3. 将小鼠固定在载物台上
注意：本实验方案使用一种定制的载物台（图1），该载物台配备两个可自由调节的盖玻片夹持器（一个通过螺丝固定在载物台上，另一个永久固定在载物台上）；可调节的立体定位耳杆；一根可通过螺丝收紧的绳索；一个可自由调节的金属加热环；以及一个用于放置小鼠躯干的抬高区域。该载物台由腘窝淋巴结载物台改装而成，增加了立体定位夹持器以及用于支撑外置下颌下腺（SMG）的下部盖玻片的支撑结构。如需该载物台的详细设计图或报价，可联系索取。
- 通过移除加热环支架和可拆卸盖玻片支架来准备显微镜载物台。松开耳杆支架和固定盖玻片支架的螺丝。将一块纱布用胶带固定在载物台中央区域，作为小鼠的垫料。
- 使用胶水（参见材料表）将直径为20 mm的盖玻片粘附在圆柱形金属支架的顶部（此为下盖玻片）。将直径为25 mm的盖玻片粘附在平板金属支架的底部（此为上盖玻片）。确保盖玻片与金属支架重叠约2–3 mm，且其余玻璃表面无油脂和胶水残留。
- 将小鼠仰卧于纱布上，身体垂直于拉紧的细线，头部位于耳杆之间并居中。
- 使用手术胶带将小鼠的前肢固定在载物台上。
- 接着，将细线钩住上颌前门齿，并拉紧直至下颌达到水平位置。使用弯头镊子轻轻将舌头从口中拉出少许，以利于呼吸。
- 轻柔但牢固地拉直尾巴，并用胶带将其固定在载物台上。
- 调整耳杆位置，使耳杆与载物台边缘之间形成约30°的夹角。为确保该角度准确，可用三角尺在纸上绘制左右各30°的参考线，然后将透明载物台置于纸上，据此对齐耳杆支架。
- 通过同时向内移动左右耳杆，将下颌固定于耳杆之间，直至下颌无法活动，然后拧紧螺丝。在固定下颌前后及过程中观察胸部运动。若呼吸减弱或消失，表明耳杆压迫了颈部而非下颌骨；此时应立即重新进行固定操作。
- 为小鼠提供加热，e.g.，在附近放置加热灯和/或在载物台下方放置加热垫。
4. 使用体视显微镜进行唾液腺的手术暴露
注意：以下步骤需要使用体视显微镜、精细镊子和手术剪。由于该操作为终末性步骤，无需维持无菌操作条件。经乙醇清洁的器械即可满足要求。
- 通过观察口部后方约15 mm、下颌线内侧约5 mm处皮肤是否有轻微隆起，确定右侧颌下腺叶的大致位置。在隆起中央提起一小褶皮肤，并剪开形成一个长约5 mm的切口。
- 立即在切口周围的皮肤上涂抹一圈高度为4 mm的真空脂。（使用装有真空脂的注射器，配以钝化的25 G皮下注射针头）。
- 用生理盐水填充脂环，以确保组织在手术过程中保持湿润。
- 在体视显微镜下，采用以下步骤破坏结缔组织：用一把精细镊子牢固夹住直接附着于颌下腺的一小块结缔组织，再用第二把镊子牵拉远端结缔组织，直至其断裂。确保部分结缔组织仍附着于颌下腺；这是可取的，因其便于操作。切勿用镊子接触腺体本身，以免引起出血。
- 首先在腺体上方，然后在内侧（颌下腺左右叶之间）重复上述破坏结缔组织的动作。不要将舌下腺与颌下腺分离。
- 继续沿颌下腺周围逆时针方向去除外侧结缔组织（从内侧至尾侧，再到远端，最后至头侧）。
- 确保位于腺体头侧束状结构中的血液供应、输出淋巴管和唾液导管未被破坏。
- 一旦外侧结缔组织被分离，用镊子将附着于颌下腺尾端的结缔组织向上牵拉，以抬起颌下腺尾端。从尾侧开始向头侧方向，破坏颌下腺叶下方的结缔组织。
- 持续操作，直至颌下腺各部位的结缔组织均被去除（头侧部位除外，因其含有主要的供血/引流血管和WD）。
5. 固定腺体
- 确认固定盐水的油脂环至少高 4 mm 且无泄漏（参见步骤 4.2）。
- 通过将金属条连接到其高度可调的支架上，安装下层盖玻片（参见步骤 3.2）。确保盖玻片支架已调节至最高位置，在安装到载物台上时不会触碰到油脂环。从尾侧方向以约 60° 角度将支架放置，使盖玻片覆盖暴露叶的大约三分之二（尾侧和远端部分）。缓慢降低盖玻片，直至其与腺体接触。
- 在盖玻片上方完成油脂环的封闭，形成一个新的盐水储液区。
- 用镊子小心地将下颌下腺叶拉至盖玻片上方，仅接触附着在其上的结缔组织（器官可翻转，使底面朝上）。
- 确保油脂环高度均匀，至少为 4 mm，且无泄漏。如有必要，使用装有盐水的 30 G 注射器补充盐水储液区。
- 确保上层盖玻片的支架处于最高位置。使用螺丝将带有 25 mm 上层盖玻片的金属支架固定在支架上。利用支架的可调螺丝调整盖玻片位置，使下颌下腺位于中央。
- 使用可调支架的螺丝缓慢降低上层盖玻片，直至其直接接触下颌下腺。在此过程中观察腺体的形状和颜色变化。如果腺体表面积变大，或颜色发生变化（例如由粉红色变为白色），应立即抬高盖玻片以减轻对下颌下腺的压力。
- 通过观察储液区外部是否有气泡或盐水液滴，检查盐水储液区是否泄漏。若发现泄漏或气泡，应移除两片盖玻片及所有油脂，并从步骤 2 重新开始。
- 拧紧所有固定螺丝。
6. 固定加热环和温度探头
- 将温度探针插入储液器中，并将其放置在靠近腺体的位置，然后用胶带将探针导线固定在载物台上。
- 在顶盖玻片上涂抹一圈硅脂，将SMG置于中央（硅脂圈的直径应与加热环的直径相匹配）。将加热环置于盖玻片上方，并用硅脂密封。用胶带将加热环的管路固定在载物台上。
7. 成像
注意：我们使用配备可调谐钛宝石激光器的直立双光子显微镜系统，以及带有水浸 20X 或 25X 物镜的荧光显微镜。可通过使用自动载物台和 VivoFollow19 在数据采集期间实时校正组织漂移。这可提高成像的稳定性，但并非必需。
- 打开显微镜制造商提供的配套软件，启动正置显微成像系统。将钛宝石激光器调节至780–900 nm的激发波长。
- 将加热管路连接至加热环。通过蠕动水泵循环热水（将部分管路浸入80°C水浴中加热），使热水流经加热环，以对SMG进行加热。
- 将温度探头连接至数字温度计。若温度不在35-39 °C范围内，需调节蠕动泵的转速。泵速越快，物体温度越高；反之亦然。
- 在开始图像采集之前，对血流速度进行视觉控制。仔细检查白细胞通过毛细血管的情况，或通过注射荧光标记的葡聚糖来观察。
注意：当血流处于生理状态时，静脉注射的荧光葡聚糖会立即充满整个下颌下腺血管系统。在此操作过程中，这种情况几乎始终存在。 - 为追踪免疫细胞，成像深度通常位于SMG表面以下20–150 µm处，该区域由2标识nd 谐波生成信号。以150-300 µm的视野范围采集图像序列，像素分辨率约为512 × 512或更高，z轴深度为20-60 µm，层间间距为2-4 µm。每20-30秒重复采集一次图像序列，总时长为20-60分钟。
- 使用数字温度计在获取一个图像序列后控制最低和最高温度水平。如果最低或最高温度不在37 ± 2 °C范围内，则弃用该图像序列。在图像序列之间补充浸没物镜所需的水。
- 成像结束后，通过 CO2 麻醉下窒息
注意：此操作符合瑞士联邦动物实验指南；其他地区可能适用不同的安乐死指南。
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结果
该方案可实现对下颌下腺（SMG）几乎整个背侧或腹侧表面的成像。视野通常还包括舌下唾液腺，后者在细胞组成上与下颌下腺略有不同。4两个腺体均由纤维状胶原包裹，并被分隔为小叶。大多数双光子显微系统可通过检测纤维状胶原的二次谐波信号，生成无标记成像图像nd 谐波信号，但通常需要荧光分子来可视化细胞和亚细胞结构。例如，普遍存在的绿色荧光蛋白（GFP）转基因表达与2nd 谐波信号足以根据形态学特征识别颌下腺中的腺泡、导管和血管。该装置可用于观察具有细胞类型特异性表达的转基因荧光标记物，以鉴定特定的细胞亚群。 图2 显示表达COL1A1-GFP报告基因的结缔组织成纤维细胞样细胞网络。同时可见通过静脉注射与高分子量葡聚糖偶联的荧光染料标记的血管。导管的管腔腔室也可被标记（图3当染料逆行注入WD时29.
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讨论
本方案提供了一种利用直立式非线性显微镜对小鼠下颌下腺和舌下腺进行体内成像的简便方法，该技术常用于免疫学领域。该方法可适用于头颈部其他外分泌腺的成像。例如，我们实验室已采用类似方法对泪腺进行了成像（未展示）。
去除颌下腺（SMG）周围的结缔组织是本方案中最关键的步骤，因为可能意外造成组织损伤。若损伤了SMG的主要血液供应，则必须立即终止实验，因为SMG组织将发生缺氧。如果SMG组织本身受损，通常会通过凝血自然止血。然而需要考虑的是，损伤会引发无菌性炎症并释放促炎性细胞因子30，这可能影响实验结果的读取。在显微手术过程中更常见但较不严重的并发症是生理盐水储液池出现泄漏。为尽量减少泄漏的发生，务必在干燥、无毛发的皮肤上涂抹润滑脂。修补泄漏通常无效：应彻底清除所有润滑脂，用干燥的棉签清洁皮肤，然后从头重新涂抹。
成像过程中必须维持接近生理体温的温度（C567BL/6 小鼠雄性和雌性均约为 37 °C31）。由于低体温和高体...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由瑞士国家科学基金会（SNF）项目资助，项目编号为31003A_135649、31003A_153457和31003A_172994（资助对象：JVS），以及利奥波第那学会博士后奖学金LPDS 2011-16（资助对象：BS）。本研究受益于伯尔尼大学“显微成像中心”（MIC）的光学设备支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 马立酮 10% （氯胺酮）20 ml（100 mg/ml） | Vetoquinol | 3605877535982 | |
| 鲁马静 2%（赛拉嗪）25 ml（20 mg/ml） | Bayer | 680538150144 | |
| 生理盐水 NaCl 0.9% | B. Braun | 3535789 | |
| 普瑞喹喃 1%（乙酰丙嗪）10 ml（10 mg/ml） | Fatro | 6805671900029 | |
| 电动剃须刀 | Wahl | 9818L | 或类似产品 |
| 脱毛膏 | Veet | 4002448090656 | |
| 杜拉波外科胶带（2.5 cm × 9.1 m 和 1.25 cm × 9.1 m） | Durapore (3M) | 1538-1 | |
| 杜拉波外科胶带（2.5 cm × 9.1 m 和 1.25 cm × 9.1 m） | Durapore (3M) | 1538-0 | |
| 超级胶水 Ultra gel，瞬干胶 | Pattex, Henkel | 4015000415040 | |
| 显微镜盖玻片 20 mm 和 22 mm | Menzel-Gläser | 631-1343/ 631-1344 | |
| 实验室润滑脂 60 g Glisseal N | Borer (VWR 供应商) | DECO514215.00-CA15 | |
| 手术剪 | Fine Science Tools (F.S.T ) | 14090-09 | 或类似产品 |
| 精细镊子 | Fine Science Tools (F.S.T ) | 11252-20 | 或类似产品 |
| 棉签 | Migros | 617027988254 | 或类似产品 |
| 纱布 Gazin 5 × 5 cm | Lohmann and Rauscher | 18500 | 或类似产品 |
| 体视显微镜 | Leica | MZ16 | 或类似产品 |
| 德克萨斯红葡聚糖 70 kDa | Molecular Probes | D1864 | |
| 级联蓝葡聚糖 10 kDa | invitrogen | D1976 | |
| 双光子系统 | LaVision Biotec | TrimScope I 和 II | 或类似产品 |
| XLUMPLANFL 20×/0.95 W 物镜 | Olympus | n/a | 或其他水浸物镜 |
| 数字温度计 | Fluke | 95969077651 |
参考文献
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