通过细胞光转化追踪斑马鱼胚胎中的心内膜组织运动

摘要

本方案描述了一种在活体斑马鱼胚胎的心内膜细胞中对Kaede荧光蛋白进行光转化的方法，该方法可用于追踪心内膜细胞在房室管及房室心脏瓣膜发育过程中的动态变化。

摘要

在胚胎发育过程中，细胞的行为会发生动态变化，揭示这些变化背后的细胞机制是发育生物学领域的一个基本目标。光转化蛋白的发现与发展极大地促进了我们对这些动态变化的理解，提供了一种光学标记细胞和组织的方法。然而，尽管光转化、延时显微成像以及后续图像分析在揭示脑或眼等器官的细胞动态方面已取得显著成功，但由于心脏在心动周期中快速运动所带来的技术挑战，该方法通常并未应用于发育中的心脏。本实验方案包含两个部分。第一部分描述了一种用于在斑马鱼房室管（AVC）及房室心脏瓣膜发育过程中对内皮细胞（EdCs）进行光转化并随后追踪的方法。该方法通过使用药物暂时停止心脏跳动，以实现精确的光转化。去除药物后，心脏恢复搏动，胚胎继续正常发育，直至在后续发育时间点再次停止心脏跳动，以便对已光转化的EdCs进行高分辨率成像。方案的第二部分介绍了一种图像分析方法，通过将三维结构中的荧光信号映射到二维图谱上，定量测量早期胚胎AVC中光转化或非光转化区域的长度。该方案的两个部分相结合，可用来研究构成斑马鱼AVC和房室心脏瓣膜的细胞的来源与行为，并有望应用于研究影响AVC和/或瓣膜发育的突变体、形态抑制子或经试剂处理的胚胎。

引言

斑马鱼目前是研究细胞和发育过程最重要的脊椎动物模型之一 体内这主要归因于斑马鱼具有光学透明性且易于进行遗传操作，使其成为应用基于基因编码的光敏蛋白技术等光学方法的强有力模型。¹在心脏发育研究中，斑马鱼可通过扩散获得足够的氧气，因此即使是没有心跳的突变体也能存活至发育的第一周，从而使得研究人员能够分析发育基因以及异常血流对心脏形态发生的影响，而这类研究在大多数脊椎动物中难以实现².

斑马鱼心脏管在受精后24小时（hpf）形成。心脏管形成后不久即开始主动搏动。到36 hpf时，出现明显的缩窄区域，将心房与心室分隔开来。该缩窄区域称为房室管（AVC），此区域的细胞形态由扁平状转变为立方状³。斑马鱼房室瓣膜的形态发生始于受精后约48小时。到受精后5天，两个瓣叶已延伸进入AVC区域，在心脏搏动周期中阻止血液从心室倒流回心房⁴。在AVC及瓣膜形成过程中追踪细胞具有挑战性，因为心脏快速搏动使得通过传统延时显微镜技术难以持续追踪细胞^5,6。本实验方案改编自Steed et al., 2016⁷，描述了一种....

方案

1. 准备模具并固定琼脂糖

1. 使用3D打印机或传统机械加工工具，按照图1所示尺寸制作模具。
2. 用移液器吸取约1.5 mL熔化的1%琼脂糖，加入35 mm塑料制样品托中。将塑料模具放入液态琼脂糖中，注意避免模具与琼脂糖之间产生气泡。将样品托置于4 °C环境中，待琼脂糖凝固（约需5分钟），然后取出塑料模具。
3. 如需将样品托保存以备后续使用，应先盖上盖子，再用封口膜将样品托和盖子紧密包裹。样品托可倒置（盖子朝下）保存于4 °C，最长可保存5天。
4. 在样品固定当天，预先准备含0.7%低熔点琼脂糖的1 mL分装液，置于1.5 mL离心管中备用。
   注意：若未用封口膜紧密包裹样品托，随着水分蒸发，琼脂糖孔结构会随时间发生变形。

2. 获取用于光转换的胚胎

1. 将 Tg(fli1a:gal4FF^ubs, UAS:kaede) 品系进行品内杂交，并将约 200 个胚胎置于胚胎培养基中，在 28.5 °C 黑暗条件下培养。有关斑马鱼品系杂交的更多细节，请参阅 JoVE 科学教育数据库¹¹。
2. 受精后 5 小时至 24 小时之前，用 1-苯基-2-硫脲（PTU）处理胚胎以抑制色素形成（胚胎培养基中含 0.003%....

结果

在48 hpf时进行光转化并在80 hpf时再次成像的胚胎示例见图2、视频1和2。将Kaede暴露于405 nm光下可使其蛋白不可逆地从绿色荧光形式转化为红色荧光形式，从而能够追踪被标记为绿色或红色的细胞在其不同颜色邻近细胞中的行为，以研究瓣膜形成过程。可以看出，在48 hpf时房室管（AVC）中少数被光转化的细胞随后发生增殖，并主要位于瓣叶的一侧。

在心房和心室中对内皮细胞进行光转化后，应用所述图像分析方法在36小时受精后胚胎中可获得的结果示例如图3所示。对房室管（AVC）的分割可实现其三维结构的参数化，随后将其投影为二维图像以便于可视化和分析。该方法可用于量化两个光转化区域之间的距离。通过在不同发育时间点重复此过程，可研究细胞向房室管迁移的情况（Boselli <.......

讨论

光转化时机：尽管在96 hpf时Kaede在EdC中仍能强烈表达，但需注意的是，随着胚胎的发育，激光在到达房室管（AVC）之前会发生更明显的散射，使得Kaede的局限性光转化变得更加困难。在55 hpf之后的胚胎阶段，心室和心房的扩张意味着用于光转化的紫光激光束在到达AVC细胞之前，必须先穿过心房或心室。因此，在55 hpf之后，若要对AVC中的EdC进行光转化，也必然同时对心房和心室中的其他EdC进行光转化。

BDM 与 tricaine：准确的 EdCs 光转化需要暂时停止心脏跳动。BDM（2,3-丁二酮单肟）是一种电-收缩去耦联剂，已知可有效抑制心肌收缩¹²。我们未观察到经过该处理方案的胚胎与正常生长且未为成像而停止心跳的胚胎在形态学上存在差异。然而，药物处理可能影响正常发育的风险仍然存在¹³。高浓度的 tricaine 也可用于暂时停止心脏跳动¹⁴。我们发现，将胚胎置于含有 0.32% trica.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
饲养鱼类和收集鱼卵所需的设备（详见《斑马鱼手册》22）。
体视显微镜
直立式共聚焦显微镜（配备488 nm、561 nm和405 nm激光器，可调谐多光子激光器，以及Leica HCX IRAPO L，25 ×，N.A. 0.95物镜）	Leica	Leica SP8
加热金属块	ThermoScientific	88870001
35 mm × 10 mm 组织培养皿	Falcon	353001
6孔板	Falcon	353046
培养皿
镊子
玻璃移液管
模具
试剂
8 mg/mL 三卡因储备液
1 M BDM 储备液
UltraPure 低熔点琼脂糖	Invitrogen	16520-050
琼脂糖	Lonza	50004
PTU（1-苯基-2-硫脲）	Sigma Aldrich	P7629
胚胎培养基：30x 储备液
软件
配备图像分析、曲线拟合和Bio-Formats工具箱的Matlab	MathWorks
8 mg/mL 三卡因储备液
200 mg 三卡因粉末（甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸）	Sigma-Aldrich	E10521
25 mL Danieau溶液
调pH至7，分装后于-20 °C 保存
1 M BDM 储备液
1 g BDM	Sigma-Aldrich	112135
10 mL ddH2O
分装后于-20 °C保存
胚胎培养基：30x 储备液
50.7 g NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5
0.78 g KCl	Sigma-Aldrich	7447-40-7
1.47 g 硫酸镁	Sigma-Aldrich	7487-88-9
2.1 g 四水合硝酸钙	Sigma-Aldrich	13477-34-4
19.52 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）	Sigma-Aldrich	7365-45-9
调pH至7.2，室温保存
模具
PlasCLEAR 树脂	Asiga
Plus 39 Freeform Pico 3D打印机	Asiga