方法文章

利用两种稳定同位素标记的鞘磷脂物种通过液相色谱-质谱法测定鞘磷脂的定量与定性方法

DOI：

10.3791/57293

⸱

2018年5月7日

 ,  , 
1Faculty of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用多反应监测和串联质谱/三级质谱模式分别对每种鞘磷脂组分进行定量和定性分析的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们介绍一种利用液相色谱-电喷雾电离串联质谱法（LC-ESI-MS/MS）对鞘磷脂（SM）进行定性和定量分析的方法。SM 是一种常见的鞘脂类物质，其亲水部分为磷酸胆碱，疏水部分为神经酰胺。由于神经酰胺中的鞘氨醇长链碱基（LCB）和 N-酰基部分存在多样性，哺乳动物细胞中存在多种 SM 分子种类。本报告中，我们展示了一种基于 MS/MS/MS（MS3）实验中相应碎片离子来推断 LCB 和 N-酰基部分的碳原子数及双键数的方法。此外，我们还介绍了一种使用两种稳定同位素标记的 SM 分子进行 SM 定量分析的方法，有助于确定 SM 定量分析的适用范围。该方法将有助于对生物样本及化妆品等工业产品中的多种 SM 分子种类进行表征。

引言

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鞘磷脂（SM）是哺乳动物细胞中常见的一种鞘脂类物质。SM 在细胞内合成1，并作为其他鞘脂类物质（如1-磷酸鞘氨醇和神经酰胺）的前体，这些物质分别在免疫细胞迁移和皮肤屏障稳态中发挥关键作用2,3。因此，对 SM 代谢的精确分析对于阐明鞘脂类物质在生理和病理过程中的作用至关重要。

鞘磷脂（SM）由神经酰胺和连接在神经酰胺1-羟基上的磷酸胆碱组成，其中神经酰胺进一步由鞘氨醇和一个N-酰基部分构成。鞘氨醇和N-酰基部分中碳原子数和双键数的多样性导致了多种神经酰胺（以及SM）分子种类的存在。近年来液相色谱-电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）技术的发展，使得对SM进行定性和定量分析成为可能4,5。在定性分析中，通过指认鞘氨醇长链碱基（LCB）的碎片离子谱图，可确定SM中LCB部分的碳原子数和双键数。然而，由于尚未有关于N-酰基部分对应碎片离子的报道，因此无法直接获得其结构信息，通常需通过前体离子与LCB对应的碎片离子在正负离子模式下的差值分析来推断N-酰基部分的结构4,

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方案

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使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。佩戴手套以尽量减少皮肤来源的SM对样品的污染。本实验方案适用于在添加了10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1,000 U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素的Eagle最小必需培养基中培养的HeLa细胞。

1. 脂质样品的制备

注意：所有玻璃器皿（包括带聚四氟乙烯衬里螺旋盖的试管）均必须不含洗涤剂。

  1. 采用 Bligh & Dyer 法从细胞匀浆中提取总脂质组分7
    1. 从 10 cm 组织培养皿中移除培养基（或条件培养基），并用 6 mL 冰冷的 PBS 洗涤两次。
    2. 使用 P1000 移液器向 10 cm 组织培养皿中加入 1 mL 冰冷 PBS。用细胞刮刀收集细胞，并转移至 2.0 mL 硅化塑料离心管中。
    3. 离心（1,000 × g，5 分钟，4 °C）后，用 P1000 移液器移除上清液。
    4. 加入 1 mL 甲醇。短暂涡旋振荡管体，并在浴式超声仪中以 200 W 超声处理 5 分钟。
      注：调节浴式超声仪中的水位，以确保细胞沉淀被有效匀浆。
    5. 用移液器将甲醇中的细胞匀浆转移至带聚四氟乙烯衬垫螺旋盖的试管（13 mm × 100 mm）中。
      6. ....

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结果

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采用化学合成的 d18:1/24:0 SM（图1A）以及从 HeLa 细胞中提取的脂质样品中的 d18:1/24:0 SM（图1B）进行 LC-ESI-MS3 分析，分别以 [M+HCOO]- 和 [M-CH3]- 作为第一和第二级母离子。需要注意的是，去甲基化鞘氨醇磷酸胆碱（SPC）（m/z 449）的谱峰强度大于 SM 的 N-酰基部分（m/z 378）。此外，对应于 [M-胆碱-CH3 （鞘氨醇-1-磷酸）]- 的谱图也有助于确定 SM 的长链碱基（LCB）。我们还证实，在本实验的 MS3 分析条件下，去甲基化 SPC（m/z 449）的谱图主要来源于 d18.......

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讨论

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在本定性方法中，我们获得了鞘磷酰胆碱（SPC）和一个N-酰基部分的MS3产物离子。正确指认SPC和N-酰基部分均至关重要。需要注意的是，其他含磷酸胆碱的分子也可能作为MS3产物离子被检测到。二酰基磷脂酰胆碱（PC）和缩醛磷脂-PC在哺乳动物细胞中含量丰富，其疏水性与鞘磷脂（SM）相似。因此，理论上带有同位素（通常为13C）的二酰基-PC和缩醛磷脂-PC可能与SM同时被检测到。在我们的实验中，SM分析时同时观察到了缩醛磷脂-PC的MS3产物离子。了解SPC的谱峰强度大于SM的N-酰基部分的强度，有助于正确选择SM的MS3产物离子（图1A和B）。相反，脂肪酰基部分的强度大于（或几乎等于）去甲基化溶血缩醛磷脂-PC的强度（数据未显示）。

在本定量方法中，准确配制用于构建校准曲线和验证方法的样品至关重要.......

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披露

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作者声明不存在利益冲突。

致谢

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本研究得到了日本文部科学省科学研究费补助金（KAKENHI）对 K.H.（#15K01691）、Y.F.（#15K08625）、K.Y.（#26461532）的资助，以及厚生劳动省难治性疾病研究事业（K.Y. #201510032A）的资助。我们感谢 Edanz Group（www.edanzediting.com/ac）对本文初稿的编辑工作。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PBSThermoFisher10010023
100 mm 细胞培养皿IWAKI3020-100
细胞刮刀IWAKI9000-220
硅化 2.0 mL 管Fisher Scientific02-681-321
试管IWAKITST SCR 16-100
聚四氟乙烯（Teflon）衬垫螺旋盖IWAKI9998CAP415-15
一次性玻璃试管IWAKI9832-1310
CAPCELL PAK C18 ACR 3 µm 1.5 mm 内径 × 100 mmShiseido92223保护柱插入柱套中，并与 C18 柱连接
CAPCELL C18 MGII S-3 2.0 mm × 10 mm 保护柱Shiseido12197
柱套Shiseido12415
乙腈Wako018-19853
2-丙醇（异丙醇）Wako161-09163
甲醇Wako134-14523
甲酸Wako066-00466
28% 氨水Wako016-03146
超声波清洗器（水浴型）SHARPUT-206H
用于玻璃试管的涡旋混合器TAITECMix-EVR
1.4 mL 玻璃小瓶Tomsic500-1982样品储存于带螺旋盖和 8 mm 隔垫密封的 1.4 mL 玻璃小瓶中，保存于 -20°C
8 mm 隔垫Tomsic200-3322分析样品时，将螺旋盖更换为带切口隔垫的螺旋盖
1.4 mm 玻璃小瓶用螺旋盖Tomsic500-2762
带切口隔垫的螺旋盖Shimadzu GLCGLCTV-803
PVDF 0.22 µm 滤膜MilliporeSLGVR04NL
三重四极杆与四极杆线性离子阱质谱仪SCIEXQTRAP4500
用于采集和分析产物离子谱的数据软件SCIEXAnalyst
用于定量分析中数据积分的数据软件SCIEXMultiQuant
高效液相色谱系统ShimadzuNexera
玻璃瓶Sansyo85-0002
d18:1/24:0 鞘磷脂Avanti Polar Lipids860592P
鞘氨醇磷酸胆碱Merck567735
胎牛血清ThermoFisher 26140079
L-谷氨酰胺ThermoFisher 25030081
青霉素和链霉素SigmaP4333
伊格尔（Eagle’s）最低必需培养基SigmaM4655

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huitema, K., van den Dikkenberg, J., Brouwers, J. F., Holthuis, J. C. Identification of a family of animal sphingomyelin synthases. EMBO J. 23 (1), 33-44 (2004).
  2. Kihara, Y., Mizuno, H., Chun, J. Lysophospholipid receptors in drug discovery. Exp Cell Res. 333 (2), 171-177 (2015).
  3. ....

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重印与许可

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标签

HeLa

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