方法文章

铜绿假单胞菌 PA14菌株转座子插入突变体有序非冗余文库的复制

DOI：

10.3791/57298

⸱

2018年5月4日

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1Department of Pediatrics, Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital, 2Department of Molecular Biology, Massachusetts General Hospital, 3Department of Genetics, Harvard Medical School, 4Department of Pediatrics, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa 感染在易感宿主中可引起显著的发病率。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）菌株 PA14 的非冗余转座子插入突变体文库（命名为 PA14NR 文库）可用于分析众多生物学过程中的基因功能。本文介绍了一种用于制备高质量 PA14NR 文库拷贝的实验方案。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于人类环境中。P. aeruginosa 能够形成生物膜、产生抗生素耐药性、分泌毒力因子，并在慢性感染过程中快速进化。因此，P. aeruginosa 可引起急性和慢性感染，且难以治疗，导致特定患者群体中出现显著的发病率。P. aeruginosa 菌株 PA14 是一种人类临床分离株，其基因组结构保守，可感染多种哺乳动物和无脊椎动物宿主，使其成为研究该病原体的理想菌株。2006年，研究人员构建了一个非冗余的转座子插入突变体文库，包含5,459个突变体，对应于4,596个预测的PA14基因。自那时起，PA14文库的分发使科研界能够更深入地理解P. aeruginosa中单个基因及复杂通路的功能。为确保文库在复制过程中的完整性，必须进行规范的操作和精确的技术处理。为此，本文提供了详细的实验方案，描述了文库复制、文库质量控制以及单个突变体正确保存的具体步骤。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa 是一种表型和基因型多样且具有高度适应性的革兰氏阴性细菌，广泛存在于土壤、水体、大多数人类生活环境以及皮肤微生物群中。与其他许多细菌物种相比，P. aeruginosa 拥有相对较大的基因组，大小为 5.5–7 Mbp，其鸟嘌呤+胞嘧啶（G+C）含量较高（65–67%）。此外，其大量基因参与代谢适应性，并属于调控网络的一部分，使其在应对环境胁迫时具有极强的灵活性1。P. aeruginosa 表达多种毒力因子，易于形成生物膜，能够通过多条群体感应通路协调反应，并表现出显著的抗生素耐药性和耐受性发展能力2,3,4,5,6,7,8。这些特性为治疗由 P. aeruginosa 引起的感染带来了重大挑战。

慢性P. aeruginosa感染可发生于多种疾病状态中。囊性纤维化（CF）是一种由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因突变引起的遗传性疾病，其特征是气道内形成黏稠的感染性分泌物，导致进行性支气管扩张，最终因呼吸衰竭而死亡9。至成年期，大多数CF患者已长期感染P. aeruginosa，该菌在该疾病的发病与死亡过程中起关键作用10。此外，严重烧伤患者11、气管切开术患者12、接受关节置换术者13或留置导管患者14也存在P. aeruginosa感染风险，这与该细菌形成生物膜并逃避免疫炎症反应的能力有关15。此外，在广谱、序贯性抗菌治疗后，耐药或耐受多种抗生素的菌群被筛选出来，可在无竞争条件下实现定植12,16,17,18。深入理解P. aeruginosa的致病机制，将对多种疾病状态具有重要意义。

已对多种P. aeruginosa临床分离株（包括PAO1、PA103、PA14和PAK菌株）进行了广泛研究，以探讨P. aeruginosa致病性的不同特征。PA14菌株是一种临床分离株，属于全球最常见的克隆群之一19,20，且在实验室中未经过多次传代。PA14在脊椎动物感染模型中具有高度毒力，表现出显著的内毒素特征21、菌毛结构22、致病岛23、III型分泌系统（TTSS）、对哺乳动物细胞的细胞毒性24，以及抗生素耐药性和持留性特征25。此外，PA14在多种宿主-病原体模型系统中也表现出高度毒力，包括植物叶片浸润模型26,27、Caenorhabditis elegans感染模型28,29、昆虫模型30,31，以及小鼠肺炎模型32,33和皮肤烧伤模型34。

全基因组突变体文库是一类非必需基因的同源突变体集合，可通过基因组规模的基因功能分析，成为研究生物体生物学特性的重要工具。目前已有两种在P. aeruginosa中构建的接近饱和的转座子插入突变体文库可供分发使用。这两个文库的转座子插入位点均已确定。这些所谓的非冗余文库显著减少了筛选未表征的随机转座子突变体所需的时间和成本，从而促进了细菌菌株的全基因组研究。P. aeruginosa PAO1转座子突变体文库是在PAO1菌株的MPAO1分离株中利用转座子ISphoA/hah和ISlacZ/hah35构建而成，由华盛顿大学Manoil实验室负责维护。该文库包含9,437个经序列验证的转座子突变体，具有广泛的基因组覆盖度，大多数基因均包含两个突变体36。有关P. aeruginosa PAO1转座子突变体文库的详细信息可通过华盛顿大学Manoil实验室的公共互联网网站获取，网址为http://www.gs.washington.edu/labs/manoil/libraryindex.htm。另一种P. aeruginosa PA14非冗余转座子插入突变体文库（PA14NR Set）是在PA14菌株中利用转座子MAR2xT7和TnphoA37构建而成，目前由麻省总医院儿科系负责分发。PA14NR Set包含5,800多个在非必需基因中具有单个转座子插入的突变体37。PA14NR Set文库的构建细节可在公共互联网网站http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi?section=NR_LIB中查阅，该网站还提供多种在线搜索工具，以方便PA14NR Set的使用。

最初的PA14NR菌株集包含5,459个突变株，这些突变株选自一个约含34,000个随机转座子插入突变株的综合文库，对应于4,596个预测的PA14基因，占所有预测PA14基因的77%37。自2006年该文库构建以来，已陆续新增突变株，目前PA14NR菌株集包含超过5,800个突变株38，代表约4,600个PA14基因。大多数PA14转座子突变株是在野生型背景中构建的37。有关该突变文库中每个成员的详细信息（包括遗传背景），可通过在线数据库查询，或下载非冗余文库电子表格获得，上述功能均可在PA14网站（http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/home.cgi）上获取。大多数突变株使用MAR2xT7（MrT7）转座子构建，少数使用TnPhoA（phoA）转座子构建37。每种转座子均携带抗生素抗性盒，可用于筛选突变株：gentamicin（MrT7）或kanamycin（phoA）。PA14NR突变株集保存在六十三个96孔板中，并包含两个额外的96孔对照板，其中按预设模式交替排列了接种和未接种的野生型PA14孔。96孔板格式结合在线搜索工具，极大地方便了定制化筛选实验的开发，使用户能够轻松识别与突变表型相关的基因。在线搜索工具还可辅助查找和选择进一步研究所需的其他相关突变株。

PA14 和 PAO1 转座子突变文库是科学界极为重要的全球性资源，二者相互补充，可用于验证这种细菌病原体中未知基因和通路的功能。巧合的是，自 PAO1 和 PA14 转座子突变文库构建以来，对大量 P. aeruginosa 分离株进行的全基因组 DNA 测序分析表明，PAO1 和 PA14 分别属于 P. aeruginosa 系统发育树中的不同主要亚克隆群7,39,40,41。由于临床来源的 P. aeruginosa 分离株在系统发育树中分布广泛，PAO1 和 PA14 分属不同的 P. aeruginosa 亚群这一事实，进一步提升了这两个转座子突变文库在比较研究中的价值。

文献中已有大量关于构建和筛选细菌突变体文库的出版物，包括P. aeruginosa文库35,37,42。然而，据我们所知，目前尚无已发表的实验方案详细描述用于细菌突变体文库的复制、保藏和验证的具体步骤与技术。

本文所述的方法包含三个实验方案，用于促进PA14NR文库的使用与维护。第一个方案描述了针对PA14NR文库接收者推荐的文库复制方法。第二个方案提供了利用PA14NR文库鉴定出的单个突变株的划线、培养和保存指南。第三个方案介绍了质量控制技术，包括对转座子突变株进行PCR扩增并随后测序，以确认突变株的身份。这一系列方案也可适用于其他细菌突变文库或菌种集合的复制与维护。强烈建议复制细菌突变文库或菌种集合，以保持"主库"（即最初收到的原始文库）的完整性。为常规实验室使用而复制多份PA14NR文库，可最大限度地降低主库中孔间污染的可能性。

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方案

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注意：处理时应采用标准的 BSL-2 安全措施 P. aeruginosa 一种人类病原体。如果您属于免疫功能低下者，或患有增加细菌感染易感性的任何疾病，在操作该生物体时应格外谨慎 P. 铜绿假单胞菌。在使用PA14 NR文库或细菌病原体突变体文库前，请咨询所在机构的生物安全办公室，并获得医师批准。

使用针式复制器、LB 琼脂平板和培养步骤的灭菌与培养过程示意图。
图 1：方案 I 概述：PA14NR 菌株集的复制。 第 1 天：将来自 PA14NR 菌株集“主库”的冻存突变株接种至 LB 琼脂培养基上，于 37 °C 过夜培养。第 2 天：将 LB 琼脂培养基上的突变株菌落转移至含有 LB 液体培养基的深孔块中，于 37 °C、950 rpm 振荡条件下过夜培养。第 3 天：将过夜培养的 LB 菌液与甘油混合，随后转移至 96 孔储存板中用于长期保存。将 96 孔板平放于 -80 °C 超低温冰箱中。请点击此处查看该图的放大版本。

实验室无菌区域设置示意图；个人防护装备、乙醇、火焰用于维持无菌环境。
图 2：推荐的设置。 应通过采取适当的预防措施来保持无菌性和操作流程的顺畅。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 方案一：PA14NR 菌株集的复制

注意：可通过将 PA14NR 菌种库分为四个子集，每个子集包含十六块平板，分四周连续操作，实现文库的复制。生成 1 至 6 份拷贝时，遵循表 1 中所述的每周工作流程；生成超过 6 份拷贝时，则遵循表 2 中所述的每周工作流程。若要生成 12 份 PA14NR 菌种库拷贝，可在第 2 天和第 3 天（使用第 1 天复制的同一组琼脂平板）分别将相同的 PA14NR 子集接种至液体 LB 培养基中，并在第 3 天和第 4 天分别将过夜培养的突变株转移至拷贝平板中。

第0天第1天第2天第3天
准备日在LB琼脂培养基上培养PA14NR Set突变株在液体LB培养基中培养PA14NR Set突变株将PA14NR Set突变株培养物转移至目标培养板

表1：PA14NR试剂盒1-6个副本的复制时间表。少量副本的复制可遵循每周工作流程。

第0天第1天第2天第3天第4天
准备日在LB琼脂平板上培养PA14NR Set突变株在液体LB培养基中培养PA14NR Set突变株转移第3天的突变株培养物，以生成第一组6份PA14NR Set转移第4天的突变株培养物，以生成第二组6份PA14NR Set
在液体LB培养基中培养PA14NR Set突变株

表2：PA14NR套装最多12份复制品的复制时间表。复制更多份数将需要在每周工作流程中进行分层安排。

  1. 第1天：在LB琼脂平板上培养PA14NR Set主代培养物
    1. 操作PA14NR Set时需佩戴手套、实验服和口罩。
    2. 清理实验台，并用70%乙醇擦拭表面。
    3. 制备LB琼脂培养基43，在高压灭菌器中灭菌25分钟。将培养基冷却至55 °C（水浴中），然后加入15 µg/mL庆大霉素（适用于含有MAR2xT7转座子插入的突变株）或200 µg/mL卡那霉素（适用于含有TnphoA插入的突变株）。
    4. 每块矩形平板倒入约60 mL熔化的LB琼脂。将平板置于无菌操作台中干燥约1小时后使用。确保琼脂表面无冷凝水。如需储存，应置于4 °C保存。
    5. 在经乙醇擦拭的实验台上使用本生灯建立无菌区域，并准备好用于复制针灭菌的适当溶液容器（见步骤1.1.9）。使用开口塑料容器（约5.25英寸长 × 4.25英寸宽 × 1.75英寸高）进行复制针灭菌。使用前需对塑料容器进行高压灭菌。
      注：本生灯火焰产生的热量会形成对流气流，加热火焰上方空间并将空气中的微粒向上带离下方较冷空气，从而保持工作区域无菌。
    6. 从-80 °C冰箱中取出最多四块PA14NR Set主平板（避免不必要的解冻），并将其放置于4 L冰盘中的干冰上。
    7. 将待复制的96孔主平板从干冰上取下，置于实验台上短暂解冻（仅需复制针灭菌所需时间，约3–4分钟）（见步骤1.1.8）。在点样前，先在琼脂平板上标记A1坐标位置。将主平板与琼脂平板对齐，使两者的A1坐标均位于左上角。
    8. 按照以下步骤对复制器“针”进行灭菌。每步操作后轻轻轻敲复制器以去除多余液体。
      1. 将针浸入250 mL 0.3–0.5%次氯酸钠（10%家用漂白剂）中30秒。尽量减少与次氯酸钠溶液的接触，以免损坏针头。随后将针依次浸入250 mL无菌ddH2O或无菌超纯水中10秒，再浸入250 mL 70%乙醇中30秒，最后浸入250 mL 95%乙醇中2分钟。
      2. 将复制器垂直置于本生灯火焰中进行火焰灭菌，缓慢接近火焰直至乙醇点燃，然后立即移开。待乙醇完全燃烧后火焰将自行熄灭。必要时，应备有盖子或类似容器以扑灭燃烧的乙醇。
        注：在火焰附近操作乙醇时需极度小心。切勿将复制器直接置于火焰上方。
      3. 通过将针插入未使用的含LB琼脂培养基的无菌矩形平板中30秒以冷却针头。
    9. 在剥离PA14NR Set主平板的铝封膜前，用手短暂加热铝封膜使其松动。此操作应在冷却复制针的同时进行。小心移除铝封膜，防止其重新接触平板表面。使用镊子去除残留的铝膜碎片。
    10. 将复制器针插入主平板中，轻轻推压并朝四个方向轻微摆动，确保针头与96孔中每一孔的冷冻细菌培养物充分接触。特别注意平板边缘的孔，应将复制器针用力压向边缘孔中的冷冻培养物。
    11. 将复制器针轻轻放置在琼脂平板表面，以轻微的环形运动移动复制器，为每个突变株形成约4–5 mm的微小菌苔。避免菌苔重叠，以防交叉污染。
    12. 用新的无菌铝封膜密封PA14NR Set主平板。切勿触碰铝封膜的粘性面，以防污染。使用平板滚压器确保每个孔及平板边缘完全密封。将96孔板放回干冰中。
    13. 对每块主平板重复上述操作。
    14. 处理完PA14NR Set后，用70%乙醇彻底擦拭所有工作表面。
    15. 将复制后的琼脂平板转移至37 °C培养箱中，过夜培养。
  2. 第2天：在LB液体肉汤中培养PA14NR Set主代培养物
    1. 制备含抗生素的LB液体肉汤43：对于含有MAR2xT7转座子插入的突变株，加入15 µg/mL庆大霉素；对于含有TnphoA插入的突变株，加入200 µg/mL卡那霉素。
    2. 清理超净工作台内不必要的设备，并在开始操作前开启风机至少10分钟。使用70%乙醇擦拭工作台表面及所有放入台内的物品。
    3. 在超净工作台中，使用50–1200 µL 12通道电子移液器，向2 mL深孔板中每孔加入525 µL含适当抗生素的LB液体肉汤。然后将装有培养基的深孔板转移至经乙醇擦拭的实验台上。只要保持无菌条件，可重复使用吸头。
    4. 操作PA14NR Set时需佩戴手套、实验服和口罩。
    5. 清理实验台，并用70%乙醇擦拭表面。
    6. 将过夜培养的突变株琼脂平板移至实验台。
    7. 在经乙醇擦拭的实验台上使用本生灯建立无菌区域，并准备好用于复制针灭菌的适当溶液容器（见下一步）。
    8. 按照以下步骤对复制器“针”进行灭菌。每次浸入后轻轻轻敲复制器以去除多余液体。
      1. 将针浸入250 mL 0.3–0.5%次氯酸钠溶液中30秒。尽量减少针与次氯酸钠的接触，以防损坏。随后将针依次浸入250 mL无菌ddH2O或超纯水中10秒，再浸入250 mL 70%乙醇中30秒，最后浸入250 mL 95%乙醇中2分钟。
      2. 对复制器针进行火焰灭菌，然后通过将针插入未使用的含LB琼脂培养基的矩形平板中30秒以冷却针头。
        注：在火焰附近操作乙醇时需极度小心（参见1.1.8）。
    9. 将复制器针轻轻放置在含有突变株生长的琼脂平板上，确认所有96个突变株均与针接触，然后将针浸入含LB液体肉汤的深孔中。避免针触碰孔壁。
    10. 用无菌透气密封膜密封深孔板。使用平板滚压器确保每个单独的孔均被正确密封。
    11. 对每块琼脂平板重复上述操作。
    12. 处理完PA14NR Set后，用70%乙醇彻底擦拭所有工作表面。
    13. 将接种后的液体培养物在37 °C、950 rpm条件下使用高速摇床培养15–16小时（如有条件）。
      注：若无高速摇床，可在250–300 rpm条件下培养深孔板。然而，在低氧条件下更易出现小菌落变体（SCVs）25。因此，当使用较低转速摇床培养深孔板时，强烈建议将培养时间控制在15–16小时以内。突变孔中SCVs的非预期增殖可能在利用该文库进行遗传筛选时改变突变表型。
      PA14NR Set中的某些孔含有生长缓慢/不生长的突变株、缺失克隆或未接种的培养基。这些孔的位置已被记录，可在本出版物附带的补充文件“PA14NR Set Wells Information”中查询。
  3. 第3天：将PA14NR Set过夜培养物转移至目标平板
    1. 清理超净工作台，并在开始操作前开启风机至少10分钟。使用70%乙醇擦拭工作台表面及所有放入台内的物品。
    2. 打印防水粘性标签（标签模板见补充文件“PA14NR Set Labels”）。在超净工作台内将96孔板从塑料包装中取出。撕下平板标签，将其贴在目标板靠近A1至H1孔的一侧边缘。略微抬起目标板盖子，将标签贴在底部边缘，以便盖上盖子后仍可看到标签。
    3. 制备3.5 L 60%（v/v）甘油溶液，并在高压灭菌器中灭菌20分钟。
    4. 操作PA14NR Set时需佩戴手套、实验服和口罩。从高速或常规摇床中取出深孔板。
    5. 将深孔板转移至无菌超净工作台，小心移除透气密封膜，更换为铝封膜。以极低速度离心收集冷凝液（50–150 × g下离心30秒，然后开启离心机制动功能快速减速）。
    6. 将深孔板重新放回无菌操作台，使用50–1200 µL 12通道电子移液器和无菌滤芯吸头，向每孔加入525 µL甘油/LB液体肉汤混合液（等体积LB液体肉汤与60%甘油溶液混合）。使用电子移液器轻轻吹打300 µL上下三次以混匀。在弹出吸头前将吸头轻触孔壁，防止滴漏。弹出吸头后继续下一行操作，直至完成整块深孔板。
    7. 使用12通道电子重复移液器和滤芯吸头，吸取900 µL突变株培养物，向每个96孔目标板中分配150 µL，共制备6份文库板副本。为防止滴漏，在开始向目标板转移培养物前，先将吸头轻触孔壁。若无重复移液器，可使用多通道移液器，按照上述方法向六个96孔板的每一孔中分配150 µL，以防止滴漏。
    8. 使用无菌铝封膜覆盖平板，并用平板滚压器完全密封板边和所有孔。注意不要用铝封膜覆盖标签标识。切勿震荡平板，以防培养物溅到孔壁或铝封膜上。
    9. 将密封好的平板从操作台取出，平放在-80 °C冰箱中的平整表面上。
    10. 处理完文库后，用70%乙醇彻底擦拭所有工作表面。
    11. 在文库复制完成后以及使用文库进行遗传筛选后，均应执行质量控制检查（见方案III）。

2. 方案二：PA14NR 菌株集单个突变体的处理与保存

  1. 第1天：划线接种目标突变株
    1. 通过PA14NR文库链接 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS 或从链接 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi 下载的Nonredundant Library.xls文件确定目标突变株的位置。记录每种特定突变株筛选所需的抗生素（庆大霉素或卡那霉素）。
    2. 制备LB琼脂培养基，在高压灭菌器中灭菌20-25分钟，然后在水浴中冷却至55 °C。对于含有MAR2xT7转座子插入的突变株，加入15 µg/mL庆大霉素；对于含有TnphoA转座子插入的突变株，加入200 µg/mL卡那霉素。将LB琼脂培养基倒入培养皿中（圆形或矩形培养皿均可）。在无菌操作台中干燥培养皿约30分钟至1小时后使用。
    3. 使用前对所有塑料器皿和非无菌物品进行高压灭菌。
    4. 操作PA14NR文库时佩戴手套、实验服和口罩。操作前清理实验台，并用70%乙醇擦拭台面。
    5. 使用本生灯创建无菌区域。
    6. 从-80 °C冰箱中取出含有目标突变株的PA14NR文库96孔板，置于干冰上，将干冰容器移至实验台，短暂将96孔板放在台面上使其轻微解冻（约1-2分钟）。
      注意：应记录所有用于划线单个突变株的PA14NR文库96孔板的取用情况，因为频繁取用文库板会增加孔间污染的风险。
    7. 用手预热铝封膜后再将其剥离，注意避免封膜重新接触板面。使用镊子去除铝封膜的残留部分。
    8. 在96孔板上定位目标突变株。使用无菌木签或无菌移液器吸头，从含有目标突变株的单个孔中挑取少量冷冻菌液。
    9. 在琼脂平板上划线以获得单菌落，操作如下：用无菌木签或移液器吸头轻轻在平板的一个区域涂布细菌，形成第一道划线（划线1）；换用新的无菌木签或吸头，从第一道划线处拖过并在平板的第二个区域涂布细菌，形成第二道划线（划线2）；再换用第三根无菌木签或吸头，从第二道划线处拖过并在平板最后一个区域涂布细菌，形成第三道划线（划线3）。
    10. 用新的无菌铝封膜密封原始96孔板。切勿触碰铝封膜的粘性面以避免污染。使用封板器确保每个孔及板边缘完全密封。将96孔板放回干冰，随后存入-80 °C冰箱。
    11. 将琼脂平板置于37 °C培养箱中过夜培养。
    12. 操作文库后，用70%乙醇彻底擦拭所有工作台面。
  2. 第2天：在LB液体培养基中培养目标突变株
    1. 根据转座子插入类型，制备含有15 µg/mL庆大霉素或200 µg/mL卡那霉素的液体LB培养基。
    2. 操作P. aeruginosa时佩戴手套、实验服和口罩。
    3. 清理实验台，并用70%乙醇擦拭台面。使用本生灯创建无菌区域。
    4. 将3 - 5 mL含相应抗生素的LB培养基转移至带盖的无菌培养管中。
    5. 使用无菌接种棒或无菌移液器吸头，挑取单个突变株菌落，接种至LB培养基中。
    6. 将LB液体培养物置于37 °C摇床中，以225 - 250 rpm振荡培养过夜。
    7. 操作P. aeruginosa后，用70%乙醇擦拭所有工作台面。
  3. 第3天：将目标突变株保存于-80 °C冰箱
    1. 在冻存管上标记突变株名称、LB培养基中添加的抗生素及保存日期。
    2. 制备500 mL 50%甘油溶液（v/v），并进行高压灭菌。
    3. 操作P. aeruginosa时佩戴手套、实验服和口罩。
    4. 清理实验台或超净工作台，并用70%乙醇擦拭台面。
    5. 从摇床中取出含有突变株培养物的培养管。
    6. 准备一个装有干冰的小容器。
    7. 在超净工作台中操作，或在用乙醇擦拭过的实验台上使用本生灯创建无菌区域。
    8. 在无菌条件下，将等体积的细菌培养物与50%甘油加入已标记的冻存管中，用移液器轻轻混匀（最终体积为1 - 2 mL/管，取决于所用冻存管的规格）。将冻存管置于干冰上快速冷冻。
    9. 将冻存管放入已标记的盒子中，置于-80 °C冰箱保存。
    10. 操作P. aeruginosa后，用70%乙醇擦拭所有工作台面。

3. 方案III：PA14NR文库的质量控制

  1. 从新复制的平板中随机选择一组突变株，以检测可能的孔间污染（建议检测30-40个突变株）。
    注意：在需要确认用于特定基因表征的突变株身份的情况下，建议使用针对已知转座子插入基因序列设计的基因特异性引物进行PCR扩增。尽管更具挑战性，但在从转座子突变株中扩增DNA片段时，使用任意PCR引物而非基因特异性引物的优点包括便于大规模突变株验证以及能够检测潜在污染物的存在。出于质量控制目的，只要筛选足够数量的随机选择突变株以评估错误率，无需对所有突变株获得高质量的PCR测序数据。
  2. 按照“方案II”对突变菌株进行划线培养。
  3. 使用前对所有塑料器皿和非无菌耗材进行高压灭菌。
  4. 采用偏好的方法提取基因组DNA。本研究中所描述的分析使用了基因组DNA提取试剂盒，并遵循制造商提供的操作说明。可同时分析多个突变菌株。
  5. 使用微量分光光度计测定基因组DNA浓度。将基因组DNA浓度调整至约100 ng/µL。
  6. 以基因组DNA为模板，按照表3第1步所述运行“PCR1反应”，生成Arb1 PCR片段（图3）。该步骤所用引物列于表4中。
  7. 向5 µL PCR1反应产物中加入0.5 µL 10x上样缓冲液，上样至1.5-2%琼脂糖凝胶，并在80-150 V电压下电泳。
    注意：不预期出现特定片段长度或特定片段范围，由于任意引物可能结合多个位点，可能出现多条条带。
  8. 以PCR1反应产物中的DNA为模板，按照表3第2步所述运行“PCR2反应”，生成Arb2 PCR片段（图3）。该步骤所用引物列于表4中。
  9. 向5 µL PCR2反应产物中加入0.5 µL 10x上样缓冲液，上样至1.5-2%琼脂糖凝胶，并在80-150 V电压下电泳。
    注意：不预期出现特定片段长度或特定片段范围，由于任意引物可能结合多个位点，可能出现多条条带。
  10. 将PCR2反应产物与相应的转座子特异性引物一同送测序。
  11. 通过PA14NR文库网站提供的BLAST链接（http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/blast.cgi）将测序结果与完整的PA14基因组进行比对，或直接与目标突变株的特定基因序列进行BLAST比对。
    注意：可通过访问PA14NR集合网站（搜索 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/search.cgi?searchType=SEARCH_PLATE_POSITIONS）或从链接 http://pa14.mgh.harvard.edu/cgi-bin/pa14/downloads.cgi 下载Nonredundant Library.xls文件，查询所选突变株的相关信息。

转座子插入、引物、DNA序列及扩增步骤的PCR过程示意图。
图3：转座子插入突变体的PCR扩增与测序。 用于验证突变体身份的PCR扩增和测序步骤的示意图。请点击此处查看该图的放大版本。

PCR 反应体系配制
步骤 1步骤 2
PCR1 反应：PCR2 反应：
23.25 µL 水（分子生物学级）19.15 µL 水（分子生物学级）
3 µL 10x Taq 聚合酶缓冲液5 µL 10x Taq 聚合酶缓冲液
0.5 µL Taq 聚合酶0.6 µL Taq 聚合酶
0.625 µL 20 µM 引物 Arb1D（表 4）0.625 µL 20 µM 引物 Arb2A（表 4）
0.625 µL 20 µM 转座子特异性引物（PMFLGM.GB 3a 或 Tn5Ext）（表 4）0.625 mL 20 µM 转座子特异性引物（PMFLGM.GB 2a 或 Tn5Int2）（表 4）
1 µL 10 mM dNTPs1 µL 10 mM dNTPs
1 µL 基因组 DNA（100 ng）5 µL PCR1 反应产物
终体积 30 µL终体积 30 µL
PCR 反应程序设置
PCR1 PCR 仪循环条件：PCR2 PCR 仪循环条件：
95 °C – 2 分钟95 °C – 2 分钟
重复 5 个循环：重复 30 个循环：
95 °C – 30 秒95 °C – 30 秒
30 °C – 1 分钟54 °C – 30 秒
72 °C – 1 分钟72 °C – 1.5 分钟
重复 30 个循环：72 °C – 10 分钟
95 °C – 30 秒4 °C – 保存
45 °C – 30 秒
72 °C – 1 分钟
72 °C – 10 分钟
4 °C – 保存

表3：任意PCR的反应体系设置及PCR仪反应条件。任意PCR反应按顺序依次进行，PCR1反应中产生的片段作为PCR2反应的模板。每组反应使用特定的PCR仪程序设置。

引物名称引物序列
MAR2xT7 转座子特异性引物
PMFLGM.GB-3aTACAGTTTACGAACCGAACAGGC
PMFLGM.GB-2aTGTCAACTGGGTTCGTGCCTTCATCCG
MAR2xT7 转座子测序引物
PMFLGM.GB-4aGACCGAGATAGGGTTGAGTG
TnphoA 转座子特异性引物
Tn5ExtGAACGTTACCATGTTAGGAGGTC
Tn5Int2GGAGGTCACATGGAAGTCAGATCCTGG
TnphoA 转座子测序引物
Tn5IntCGGGAAAGGTTCCGTTCAGGACGC
任意引物
ARB1DGGCCAGGCCTGCAGATGATGNNNNNNNNNNGTAT
ARB2AGGCCAGGCCTGCAGATGATG

表4：质量控制实验中使用的引物列表。 用于PCR扩增和转座子插入突变体测序的引物，以确认突变体身份。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用方案 I 复制了 12 份新的 PA14NR 集合，然后使用方案 III 对生成的新副本进行质量控制评估。

按照方案I中所述方法，对PA14NR突变体平板和对照平板进行复制，其中对照平板包含按预设模式交替排列的野生型PA14接种孔和未接种孔（图4A）。在PA14NR平板集中加入对照平板，用于评估平板复制过程中可能发生的孔间污染。此外，对照平板也可用于在接触含有转座子插入突变体的平板前，练习复制技术。在LB琼脂平板上完成复制并过夜培养后，通过肉眼观察对照平板的生长情况，以确认是否出现预期的生长模式（图4B）。通过分光光度计测定Control Plate 1接种的深孔板在过夜培养后的OD600值，评估细菌生长情况。结果显示，接种野生型PA14的孔中出现显著生长，而未接种的孔中完全无生长（

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

P. aeruginosa PA14NR 文库是科学界一项宝贵的资源。根据科睿唯安（Clarivate Analytics）基本科学指标数据库2017年3月的数据，Liberati et al.（2006）37（描述了PA14NR文库的构建）位列微生物学领域发表论文中被引频次最高的前1%。截至2017年8月，Google Scholar 显示Liberati et al.（2006）的原始论文已被引用超过600次。该文库在阐明P. aeruginosa致病机制方面发挥了重要作用。尤为重要的是，PA14NR文库采用96孔板格式，便于开展高通量遗传筛选，以研究多种P. aeruginosa突变体表型44,45,46。由于PA14NR文库可供分发使用，必须采取特殊预防措施以确保该资源的完...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无经济利益冲突。Eliana Drenkard 和 Frederick Ausubel 参与了 PA14 非冗余转座子突变体文库的构建。Bryan Hurley 和 Lael Yonker 目前作为麻省总医院儿科系的一部分，负责该突变体文库的保藏与分发。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢麻省总医院特雷德韦尔虚拟图书馆的 Lisa Philpotts 在数据库检索方面的指导。本研究由囊性纤维化基金会（YONKER16G0 和 HURLEY16G0）以及美国国立卫生研究院过敏与传染病研究所（BPH 和 ADE：R01 A1095338）提供资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
文库扩增所需材料
无菌96孔组织培养板，每箱50块康宁生命科学353072通过 Fisher Scientific
无菌 96 孔平底透明板 2000μL型深孔板，每箱25个康宁生命科学3960通过 Fisher Scientific
Nunc OmniTray（矩形板），每箱60块赛默飞世尔科技 罗切斯特242811通过 Fisher Scientific
矩形冰盒，中号（4L）康宁生命科学432104通过 Fisher Scientific
Secure-Gard 锥形面罩，每箱 300 个Cardinal HealthAT7509通过 Fisher Scientific
AluminaSeal，100个装Diversified BiotechALUM-100通过 Fisher Scientific
Breathe-Easy 膜，每包100片Diversified BiotechBEM-1通过 Sigma-Aldrich
无菌、独立包装、50 mL 溶液槽/试剂储液槽，每箱100个SorensonS50100通过 Westnet Incorporated
平板滚轴器VWR60941-118通过 VWR
Cryo 激光标签 - CRYOLAZRTAG 2.64" x 0.277"，16 张装GA国际RCL-11T1-WH通过 Labtag.com（打印模板也可从 Labtag.com 获取）
96孔复制器V & P Scientific, Inc.定制 407C，3.18 mm 针径，57 mm 长通过 V & P Scientific, Inc.
Multitron Pro，3 mm 摇床培养箱Infors HTl10003Pvia Infors HT
Picus 12 通道 50-1200μ电子移液器赛多利斯735491PR通过 Sartorius
过滤技巧 50-1200μL，960 个装Biohit14-559-512通过 Fisher Scientific 购买；使用适用于电子多通道移液器的吸头
干冰用户特定供应商
个体突变体保存材料
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-130通过 Fisher Scientific
移液器（P1000、P200、P20、P2）GilsonF167370via Gilson
质量控制 PCR 所需材料
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-130通过 Fisher Scientific
NanoDrop赛默飞世尔科技ND-2000通过 ThermoFisher
PCR扩增仪
Omnistrips PCR管（带圆顶盖）赛默飞世尔科技AB0404通过 Fisher Scientific
ART Barrier 低吸附移液器吸头（10 μL，100 μL，1000 μL）Molecular BioProducts, Inc.Z676543（10 μL）、Z676713（100 μL）、Z676802（1000 μL）通过 Sigma-Aldrich
移液器（P1000，P200，P20，P2）GilsonF167370通过 Gilson
Fisherbrand 优质微量离心管：1.5 mLFisher Scientific05-408-130通过 Fisher Scientific
MasterPure DNA 纯化试剂盒EpicentreMCD85201via Epicentre Technologies Corp
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder，即用型赛默飞世尔科技SM1333通过 ThermoFisher
RediLoad 上样缓冲液Invitrogen750026通过 ThermoFisher
<强>化学品
用于文库及单个突变体保存的化学品
甘油 MB 级，1LSigma AldrichG5516通过 Sigma-Aldrich
LB肉汤每升去离子水2O：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母提取物，5 g NaCl，1 ml 1 N NaOH（《分子生物学实验指南》）。  Wiley，1994。
胰蛋白胨Sigma AldrichT7293通过 Sigma-Aldrich
酵母提取物Sigma AldrichY1625通过 Sigma-Aldrich
氯化钠Sigma AldrichS7653通过 Sigma-Aldrich
氢氧化钠Sigma AldrichS8045通过 Sigma-Aldrich
LB  琼脂参见上述制备步骤，加入15 g Bacto Agar
Bacto 琼脂Sigma AldrichA5306通过 Sigma-Aldrich
硫酸庆大霉素，10 g生物试剂1405-41-0通过 Sigma-Aldrich
硫酸卡那霉素Gibco11815024通过 ThermoFisher
乙醇，190 proof去污04-355-221通过 Fisher Scientific
质量控制 PCR 用化学品
引物用户首选供应商参见表3中列出的引物
康宁 Cellgro 分子生物学级水康宁46000CV通过 Fisher Scientific
Taq 聚合酶缓冲液Invitrogen10342020通过 ThermoFisher
Taq DNA聚合酶，重组Invitrogen10342020通过 ThermoFisher
dNTPsInvitrogen10297018通过 ThermoFisher
琼脂糖SigmaA9539通过 Sigma-Aldrich

参考文献

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