青鳉鱼 Nothobranchius furzeri 急性与慢性生态毒性测试方案

摘要

本研究中，我们描述了一种用于研究单一及复合应激因素对 turquoise killifish Nothobranchius furzeri 影响的急性、慢性及多代生物测定方法。该方案旨在研究其生活史特征（死亡率、生长、繁殖力、体重）以及临界热最大值。

摘要

鳉鱼Nothobranchius furzeri是生态毒理学领域中一种新兴的模式生物，其在急性和慢性生态毒性测试中的适用性已得到证实。总体而言，该物种对有毒化合物的敏感性处于与其他模式物种相当或更高的水平。

本研究描述了对N. furzeri进行单一及复合胁迫因子的急性、慢性和多世代生物测定的实验方案。由于该脊椎动物模型具有较短的成熟时间和生命周期，可在四个月内完成对成熟时间、繁殖力等终点指标的研究。跨世代的全生命周期暴露试验最短仅需8个月即可完成。该物种所产卵具有耐干旱特性，且可在数年内保持活力，因此无需现场持续培养，可根据需要随时获取个体。本实验方案旨在测定其生活史特征（包括死亡率、生长、繁殖力、体重）以及临界热最大值。

引言

已针对欧洲REACH法规（化学品注册、评估、授权和限制）描述了多种物种对战略性选择的有毒物质的敏感性特征¹。出于此目的，主要采用急性或短期毒性试验，因为这些试验能够快速反映物种的敏感性。然而，在自然环境中，生物体的暴露时间要长得多，整个生命周期甚至多个世代都可能受到影响²。此外，污染环境中的生物通常同时暴露于多种胁迫因子，这些因子之间可能相互作用，导致协同效应³。因此，基于急性、单一胁迫因子毒性试验计算出的安全浓度可能低估了有毒物质在自然环境中的实际风险。因此，正如欧洲委员会^4,5和美国环境保护署（USEPA，United States Environmental Protection Agency）^6,7所倡导的，应在环境相关的情境下研究亚致死浓度有毒物质的慢性及多代效应。特别是在脊椎动物研究中，由于脊椎动物的寿命相对较长，与无脊椎动物模型生物相比，开展慢性及多代暴露研究在人力、资金和时间方面的成本较高。因此，应根据具体的研究问题选择最合适的鱼类模型生物。此外，为了验证不同物种间反应的普遍性，并基于最敏感物种调整相关法规，有必要提供多种脊椎动物物种供测试。目前，亟需开发以生命周期较短的脊椎动物模型物种为基础的新颖且高效的实验方案，以降低在脊椎动物上进行慢性和多代暴露研究的成本^7,8。

turquoise killifish Nothobranchius furzeri 由于其较短的成熟时间和生命周期（世代时间少于4周⁹），是进行此类长期暴露实验的理想鱼类模型。这意味着与其它鱼类模型相比，可以在较短时间内研究生态学上相关的重要终点指标，如成熟时间和繁殖力⁷。此外，这些鱼类可产下抗旱的休眠卵，在标准条件下储存可保持数年活力，因此无需持续维持种群培养⁹。在生态毒理学研究中，这也意味着所有实验个体均可在同一时间点孵化，从而实现所有动物在时间上的同步性，即使这些卵来自不同批次、在不同时间产生。我们建议使用实验室GRZ品系进行暴露实验。该品系在实验室条件下表现良好，除性染色体外为纯合背景，且其基因组已得到充分表征^10,11。

在生态毒理学研究中，选择适当的测试浓度范围至关重要。为此，可采用多种互补的方法。名义浓度范围可基于相关物种的敏感性，例如 诺氏鳉¹². 或者，该范围也可基于标准鱼类模型的敏感性，例如斑马鱼（Danio rerio)² 对大多数毒物具有相似敏感性的 等 （正在审稿中）。结合这两种选择，应开展浓度范围预实验以确定名义浓度范围。对于急性毒性测试，研究人员应设定暴露24小时后导致100%死亡率、中等死亡率和0%死亡率的浓度处理组。对于慢性毒性测试，建议将预实验持续两周，以确认在最高测试浓度条件下，幼虫死亡率在该参考期间内不超过10%。

该方案可作为对N. furzeri进行水生污染物急性和慢性暴露研究的基础，用于考察应激源在个体水平和细胞水平上的潜在影响。此外，该方案也可用于开展多应激源研究，以提高生态相关性，例如混合不同有毒化合物，或研究污染与其他自然应激源（如捕食）及人为应激源（如气候变化导致的升温）之间的交互作用。

方案

本文所述所有方法均已获得鲁汶大学（KULeuven）伦理委员会的批准。

1. N. furzeri 的孵化与常规饲养

1. 准备鱼用培养基（pH 7），温度为 14 °C，加入添加了标准化盐的纯化 II 型水，调节电导率为 600 µS/cm（24 °C）。
2. 从在标准化条件下保存的GRZ（Gona-Rhe-Zhou）实验室品系中选取卵子¹³选择处于 DIII 阶段的卵子（即 即将孵化（可通过金色的眼睛识别）⁹ 用一对柔软的镊子轻轻将它们转移至一个2 L的塑料缸中（每缸不超过约30枚卵）。
   注意：为了获得足够数量的健康测试生物，孵化的卵数应为所需鱼苗数量的两倍。
3. 加入1 cm深的鱼类培养液（12 °C），使水温逐渐升至室温（24 °C）⁹鱼将在最初的12小时内孵化。
4. 24小时后，给孵化的幼体喂食新鲜孵化的浓缩饵料 Artemianauplii （有关食物频率和数量的更多细节，请参见Polačik的繁殖方案） 等 2016⁹）并通过添加鱼培养液将水深增加至5 cm。
5. 36小时后，给孵化出的幼体喂食另一剂新孵化的浓缩食物 卤虫无节幼体 并加入鱼培养基，使水深增加至10 cm。
6. 在恒定温度条件下孵育鱼类容器（例如 在培养箱、气候室或恒温水浴中，按照14小时光照:10小时黑暗的光暗周期进行培养。
7. 实验开始前，将复杂的鱼类容器（不含鱼类）用最高浓度的暴露液填充，并过夜放置，以减少实际实验过程中毒物向容器的转移。
8. 孵化后48小时，挑选健康的上浮幼鱼以开始暴露实验。丢弃无法充气鳔、浮力受损（持续沉底）的所谓“腹滑幼鱼”。

2. 短期暴露方案

注意：每个处理组应至少包含20个重复（20条鱼分别置于独立的容器中）。除了完整的对照处理外，如果化合物的储备液使用了溶剂配制，则应设置溶剂对照组。溶剂对照组中所含溶剂的量应等于最高暴露浓度组中的溶剂浓度。

1. 通过标记实验容器（0.5 L 玻璃瓶）并加入相应的暴露介质（不同毒物浓度），准备实验容器。添加化合物以获得正确的浓度。
2. 将仔鱼（孵化后 48 小时）单独转移至容器中（每个容器 1 条鱼，用于个体监测）。
   注意：将鱼类单独暴露，以尽量减少社会互动可能带来的混杂效应，例如食物竞争和攻击行为。然而，根据实验室动物使用的伦理标准，允许鱼类进行视觉上的互动。
3. 持续进行该急性暴露实验，最长持续 2 周。在此期间，每天喂食两次丰年虾（Artemia）无节幼体，每周 7 天，自由摄食（ad libitum）。
4. 每隔一天更换一次暴露介质，以维持水质，并尽量减少化合物降解可能带来的影响。监测关键水质参数（溶解氧水平应超过 80%，电导率应在 600 至 700 µS/cm 之间，pH 值在 7.8 至 8.2 之间，硬度（以 CaCO₃ 计）在 350 至 450 mg/L 之间，这些均处于 N. furzeri 最佳培育条件范围内⁹）。在更换介质前后采集水样，以确定化合物的实际浓度。
5. 检测终点
   1. 每天（上午、傍晚）检查鱼类的死亡率、应激（例如 异常行为：倒立游泳）或疾病情况。有关死亡率、应激或疾病的观察细节，请参考 Shedd et al.（1999）¹² 的出版物。
   2. 基于不同时间点的死亡率，使用剂量-反应曲线（Ritz 和 Streibig，2005）计算 LC₅₀ 值。可使用 R v3.2.3 版本（R Development Core Team，2016）中 drc 软件包的 drm 函数，或类似的统计方法。

3. 慢性暴露方案

注意：实验开始时每组至少应包含25条鱼，以尽量降低性别比例偏倚的风险，并为因自然原因（即与年龄相关的死亡）导致的潜在背景死亡留出余量。

1. 孵化（见第1节）
2. I期（孵化后2天至孵化后16天）
   1. 按照 2.1 - 2.4 中所述方案进行操作
   2. 与实验第二阶段相同，培养基将在一周内逐渐降解（不进行更换，见下文）。将一周所需量的培养基储存于大型惰性容器中，以确保化合物发生相似程度的降解。
3. 第二阶段（孵化后16天至结束）
   1. 用化合物处理2 L的实验玻璃罐，随后向罐中加入适量的暴露培养基，并接入通气管以对罐内进行曝气。实验剩余时间内，将鱼类单独饲养于这些玻璃罐中。允许鱼类进行视觉接触，以符合伦理标准。
   2. 每周更换一次培养液。用网将鱼转移到含有相同暴露培养液的新容器中。在一周内每天采集水样，以监测每种浓度处理下化合物的降解情况。若测试了多种应激因子，需为每种处理计算降解曲线。例如 在不同温度条件下测定化合物的毒性。每周三次测量非生物参数（pH、温度、溶解氧百分比、电导率）。
   3. 从孵化后第2天（dph）至第23天（dph），每天喂食鱼类两次，每周7天 随意投喂卤虫 无节幼体。从24日龄至37日龄，补充 随意喂食丰年虾 切碎的饮食 摇蚊属 幼鱼。从38日龄开始，每周7天，每天喂食两次 随意摄取 冷冻的 摇蚊属 幼虫
4. 终点指标
   1. 每日检查鱼类的死亡、应激或疾病情况¹².
   2. 为确定生长情况，需在每周固定时间点（9 日龄 - 16 日龄 - 21 日龄 - …）测量鱼体体长。操作时，将鱼转移至盛有其培养液的培养皿中，从正上方（固定高度）拍摄 4 - 5 张带有尺寸标尺的图像，并使用空间测量软件对图像进行数字化分析。例如 ImageJ
      注意：对于成年鱼，应使用较高的培养皿，以在测量过程中保持所有鱼体完全浸没，从而尽量减少操作带来的应激。
   3. 从15日龄开始，每天目视检查鱼类体色变化以评估雄性成熟情况。观察鱼鳍是否出现婚色（第二性征）的最初迹象。将首次观察到婚色的日期作为雄性成熟时间的替代指标。
   4. 从30日龄开始，每周三次将未分选性别的鱼与同处理组的雄鱼或非实验用雄鱼配对，以确定雌鱼的性成熟时间（即首次产卵的日期）。具体操作请参照3.4.5节所述的产卵实验方案。
   5. 关于繁殖力，从30日龄开始，在各自处理组内按照交配方案，每周将性成熟的雌性个体与性成熟的雄性个体配对3次。
      1. 为每对亲鱼准备一个产卵缸（1 L），使用来自雄鱼养殖 aquarium 的暴露培养基，并添加产卵基质（细沙） <500 µm
      2. 将雄鱼和雌鱼一同转移至产卵缸中，让它们产卵两小时。在此期间，尽量减少产卵容器周围的人为活动或干扰。
      3. 随后，小心地将鱼转移回其原始饲养容器中，避免不必要的水体混合，以免搅动产卵基质中的卵。
      4. 将产卵基质倒在500 µm筛网上，滤出卵粒。计数后，用软镊子将卵转移至培养皿中湿润的泥炭藓中。^9,14.
      5. 每天清除死卵。一周后，用封口膜密封培养皿，并置于28 °C、14:10 h光:暗循环的控温培养箱中，以促进胚胎立即发育至DIII期。即 约三周后即可孵化）。如需长期保存，应将卵置于17 °C的持续黑暗环境中，使其进入休眠状态，可在多年内保持活力。实验时如需使用这些休眠卵，可将休眠卵转移至28 °C、14小时光照:10小时黑暗的条件下，持续约三周，以使其发育至DIII阶段。
   6. 测量临界热最大值（CTmax）（一种性能指标）¹⁵成年鱼的）
      1. 使用以0.33 °C/min恒定速率加热并持续循环水的水浴。为每条鱼分别添加若干个1 L的水族箱。
         注意：由于水浴空间有限，需分多个批次进行实验。在进行统计分析时，应将“批次”作为随机因素纳入分析，以考虑不同批次间可能存在的条件差异。
      2. 将鱼放入水族箱中以开始实验，此时水族箱中的水温应已达到该鱼类的实验培养温度（通常为 28 °C）。使用数字温度计（精度 0.1 °C）每 5 分钟监测一次 CTmax 浴中 1 L 水族箱的水温。
      3. 当鱼类无法维持背腹直立姿势或开始剧烈抽搐时，终止实验^16,17测量1 L水族箱中的温度，即临界最高温度。将鱼放回实验饲养环境中恢复。
   7. 在实验的最后一天，将鱼轻轻擦干后转移至称量舟中，称量其体重（精确至0.1 mg）。注意：所有鱼均应在最后一次喂食后四小时进行测量，以标准化肠道内的食物重量。
   8. 使用0.1%三卡因处死鱼类。

4. 跨代暴露方案

注意：为测量污染物对 N. furzeri 的跨代效应，需对第一代遵循上述慢性暴露方案。

1. 每周两次，在28 °C、14:10小时光暗循环条件下检查所储存的卵（即第二代）的发育情况，通过观察培养皿中胚胎是否处于DIII期来判断（参见Polačik et al. 2016⁹）。当每种亲代处理组均有超过50个重复个体完全发育时，按照1.1节中的方案进行孵化。
2. 将健康且具有浮力的鱼类暴露于与亲代鱼类完全相同的实验设置和处理条件下。

结果

N. furzeri 在不同浓度铜胁迫下的急性暴露实验结果（按2.5.2节方法计算）呈现出明显的剂量-效应关系（图1）。随着毒物浓度的升高，死亡率上升。LC₅₀值随时间下降，表明在较低浓度下，需要更长时间才能导致50%的重复样本死亡。关于N. furzeri对铜的急性和慢性暴露的详细结果，以及该物种与其他物种敏感性的比较，请参见Philippe et al. 2017⁷。

在慢性暴露试验中，体型大小和繁殖力是敏感的检测指标。鱼类的生长情况可能因温度不同而存在较大差异¹⁸。在此实验条件下，成年鱼体长在30至50 mm之间被视为正常。该实验设计能够检测出不同处理组之间的差异（图2A

讨论

本研究介绍了一种利用新兴模式生物Nothobranchius furzeri的新生物测定方法，用于评估有毒物质及其他应激因子对个体及跨代的长期影响。所展示的实验方案已成功应用于测定该物种对多种有毒物质（铜、镉、3,4-二氯苯胺和毒死蜱）的敏感性。由于其生命周期短，这一脊椎动物模型可在四个月内完成亚致死效应和跨代效应的评估。使用该鱼类作为毒性筛选模型的另一大优势在于其可产生抗旱性卵。这使得研究人员能够储存卵或从供应商处获取，无需建立成本高昂且耗时的现场养殖系统。此外，胚胎可在孵化前储存数年¹²。

在研究了N. furzeri对多种标准毒物的敏感性后，可以得出，该物种的敏感性在不同测试化合物下，与其它模式物种相当或更高。特别是测量繁殖力的影响，可提高所研究物种与其他模式物种之间敏感性结果的可比性，因为繁殖力是其他模式物种中常规检测的终点指标。最后，多种胁迫因子在单独或联合施加时产生不利影响的程度，取决于所评估的终点指标和暴露浓度。

N. f...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1型纯化水（milli Q）	Millipore
海盐	Instant Ocean
2L 塑料水箱	SAVIC		始终将对照组和毒性处理组的材料分开
1L 塑料水箱（用于产卵）	Avamoplast		始终将对照组和毒性处理组的材料分开
网具	Aqua bilzen		始终将对照组和毒性处理组的材料分开
2L 玻璃罐	Sepac-Flacover		始终将对照组和毒性处理组的材料分开
0.5L 玻璃罐	Sepac-Flacover		始终将对照组和毒性处理组的材料分开
卤虫卵（Artemia eggs）	Ocean Nutrition
摇蚊幼虫（chironomus）	Ocean Nutrition		冷冻状态
三卡因（tricaine）	Sigma aldrich
培养皿（petri dishes）	VWR
封口膜（Parafilm）	VWR
移液器（pipettes）	MLS
镊子（tweezers）	FST
500 µm 网筛	/		自制
微量离心管（2ml）	BRAND		用于在冷冻保存鱼类
玻璃小瓶	Sigma aldrich		用于水质分析
称量舟	MLS
Jiffy 7c 颗粒	Jiffy
水浴锅	Gilac		用于 Ctmax 测定
液氮	Air liquide
数字温度计	Testo AG	testo 926
HETO 恒温加热器	Anker Schmitt
校准天平	Mettler-Toledo AG
相机	/
相机支架	/		自制
多参数检测仪	HACH
超低温冰箱（-80°C）	Panasonic 超低温冰箱
名称	公司	货号	备注
Fysio
匀浆缓冲液	VWR		0.1 M TRIS–HCl, pH 8.5, 15 % 聚乙烯吡咯烷酮, 153 µM MgSO4 和 0.2 % Triton X-100
氯仿:甲醇	Sigma Aldrich
三棕榈酸甘油酯	Sigma Aldrich
淀粉葡萄糖苷酶	Sigma Aldrich	A7420
葡萄糖检测试剂	Sigma Aldrich	G3293
Biorad 蛋白染料	VWR
96孔微孔板	Greiner Bio-one
384孔微孔板	Greiner Bio-one
2 ml 玻璃管	Fiers		用于脂肪分析
2.5 ml 离心管	VWR
匀浆器	Ultra-turrax TP 18/10
分光光度计	Infinite M200 TECAN
玻璃管加热器	Hach COD REACTOR
离心机	Eppendorf Centrifuge 5415 R
培养箱	Bumako