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方法文章

无饲养层条件下于不同硬度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶上培养人多能干细胞

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DOI：

10.3791/57314

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2018年2月3日

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1Department of Chemical and Materials Engineering, National Central University, 2Department of Botany and Microbiology, King Saud University, 3Cathay Medical Research Institute, Cathay General Hospital, 4Graduate Institute of Systems Biology and Bioinformatics, National Central University, 5Department of Medical Microbiology and Parasitology, Universiti Putra Malaysia, 6Department of Internal Medicine, Taiwan Landseed Hospital, 7Department of Zoology, Bharathiar University, 8Thiruvalluvar University

通讯作者： Akon Higuchi <higuchi@ncu.edu.tw>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案介绍了一种制备具有不同刚度的聚乙烯醇-共-衣康酸水凝胶的方法，该水凝胶可选择性地接枝或不接枝寡肽，用于研究生物材料刚度对干细胞分化与增殖的影响。通过调节交联时间来控制水凝胶的刚度。

摘要

物理信号（如生物材料的刚度）对干细胞增殖和分化的影响已受到多位研究者的关注。然而，这些研究者大多在其研究中使用聚丙烯酰胺水凝胶进行干细胞培养。因此，其研究结果存在争议，因为这些结果可能源于聚丙烯酰胺特有的性质，而非生物材料的物理信号（刚度）本身。本文介绍了一种非基于聚丙烯酰胺的水凝胶制备方案，可用于培养包括人胚胎干细胞（ES细胞）和人诱导多能干细胞（iPS细胞）在内的多种干细胞。该水凝胶由生物惰性聚乙烯醇-共-衣康酸（P-IA）制备而成，通过调节交联时间控制交联程度，从而实现对水凝胶刚度的调控。此外，研究还评估了接枝与未接枝源自细胞外基质寡肽的P-IA水凝胶，作为未来干细胞培养与分化的潜在平台。本文详细描述了羊水干细胞、脂肪来源干细胞、人ES细胞和人iPS细胞的培养与传代方法。实验表明，寡肽修饰的P-IA水凝胶表现出更优的性能，且该性能由其刚度特性所驱动。本方案报告了该生物材料的合成方法、表面修饰技术、刚度特性的调控，以及在无异源成分培养条件下其对干细胞命运的影响。根据近期研究，此类经修饰的基底有望成为支持并引导多种干细胞系向特定方向分化的未来平台，并进一步实现受损器官或组织的功能再生与修复。

引言

已知干细胞向特定细胞谱系分化的命运以及干细胞的长期增殖，特别是人诱导性多能干细胞（iPS细胞）和人胚胎干细胞（ES细胞）的增殖，受到培养基中抑制剂、生长因子和/或小分子生物活性物质的调控。近年来，生物材料的物理信号，尤其是细胞培养用生物材料的刚度，已被认为是引导干细胞增殖与分化命运的重要因素1,2,3,4,5,6。因此，一些研究人员已开始研究在水凝胶上培养的干细胞的分化命运，主要使用具有不同刚度的聚丙烯酰胺水凝胶进行实验。

生物材料的刚度可以调控黏着斑、细胞形态、细胞表型以及干细胞的黏附，尤其是在二维（2-D）培养条件下1,2,3,5。干细胞对生物材料的力学感知通常由整合素受体介导的黏着斑信号通路所调控。在二维细胞培养系统中，非肌球蛋白IIA（NMMIIA）依赖的肌动蛋白细胞骨架收缩性在干细胞的力学感知过程中起着关键作用3,4,5,7,8,9,10,11。

恩格勒及其同事提出了一种有趣的观念：成体干细胞（如骨髓干细胞）在具有与特定组织相似刚度的细胞培养生物材料上培养时，倾向于分化为源自这些特定组织的细胞。5在二维软质聚丙烯酰胺水凝胶（其刚度与脑组织相当）表面包被I型胶原蛋白，并在扩增培养基中培养时，BMS细胞可自发诱导分化为早期神经元谱系；而在刚度分别类似于肌肉或胶原性骨组织的二维聚丙烯酰胺水凝胶上培养的BMS细胞，则分别被诱导分化为早期肌细胞和成骨细胞谱系3,5许多研究人员已研究了在固定化Ⅰ型胶原的聚丙烯酰胺水凝胶上培养的干细胞的分化命运12,13,14,15,16,17,18,19,20,21然而，应该指出的是，存在一些相互矛盾的报道1,18,22,23,24 适用于恩格勒所提出的著名观点 等5 这是因为恩格勒（Engler）的观点5 仅在聚丙烯酰胺水凝胶上开发，其结果源于该生物材料（聚丙烯酰胺）的特定特性，而不仅仅源于生物材料的物理信号（刚度）。因此，有必要开发另一种类型的水凝胶，其刚度可通过水凝胶的交联程度进行调控。为此，开发了具有不同刚度的生物惰性水凝胶，该水凝胶由聚乙烯醇-co-衣康酸（P-IA）制备，通过改变交联时间来调控交联程度，从而控制其刚度25,26,27,28,29,30,31,32干细胞可在未经修饰的P-IA水凝胶以及接枝了细胞外基质（ECMs）和寡肽的P-IA水凝胶上进行培养。在之前的一项研究中25，将来自脐带血的人造血干细胞（hHSCs）培养于不同刚度的P-IA水凝胶上，其储能模量范围为3 kPa至30 kPa，并在P-IA水凝胶上接枝纤连蛋白或源自纤连蛋白的寡肽（CS1，EILDVPST）。高 离体 在接枝了CS1或纤连蛋白的P-IA水凝胶中观察到人造血干细胞（hHSCs）的扩增倍数增加，这些水凝胶表现出介于12 kPa至30 kPa之间的中等刚度25.

人类iPS细胞和ES细胞无法在常规的组织培养聚苯乙烯（TCP）培养皿上进行培养33,34，因为人类ES细胞和iPS细胞在长期培养过程中需要特异性结合细胞外基质（ECM），例如玻璃粘连蛋白（vitronectin）或层粘连蛋白（laminin），以维持其多能性。因此，研究人员设计并制备了多种具有最佳刚度特性的寡肽接枝P-IA水凝胶结构，包括单链结构、带连接片段的单链结构、带连接片段的双链结构以及支链型结构32。所选用的寡肽序列来源于ECM中整合素和糖胺聚糖的结合结构域。接枝了来源于玻璃粘连蛋白的寡肽、且具有约25 kPa储能模量的双链或带连接片段的P-IA水凝胶，可在无异源成分且化学成分明确的条件下，支持人类ES细胞和iPS细胞连续传代培养超过12代32。水凝胶上带有细胞黏附分子的连接片段和双链结构有助于促进人类ES细胞和iPS细胞的增殖及其多能性的维持32。本文描述了一种制备P-IA水凝胶的方案（在空气中湿态条件下测得其储能模量范围为10 kPa至30 kPa），该水凝胶可接枝或不接枝寡肽或ECM成分。同时展示了如何培养和传代多种干细胞（包括羊水干细胞、脂肪来源干细胞、人类ES细胞和人类iPS细胞）。

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方案

本研究中的实验已获得中国台湾林口长庚纪念医院伦理委员会（IRB-13-05）和中央大学的批准。所有实验均严格遵循本研究期间所有相关且适用的政府及机构指南与法规进行。

1. 溶液与培养基的配制

  1. 聚合物纯化
    1. 通过乙醇洗涤法对水解度>96.5% 的含羧酸基团的 P-IA 进行纯化。将 20 g P-IA 加入 500 mL 锥形瓶中的 200 mL 乙醇中，在磁力搅拌器上搅拌 24–30 小时。每 8–10 小时更换一次新鲜乙醇。
    2. 使用布氏漏斗通过抽滤法将 P-IA 从乙醇中分离出来。
    3. 在室温下进行真空干燥 24 小时以干燥 P-IA。
      注意：建议频繁清理真空干燥系统中的捕集阱（以去除乙醇），尤其是在最初的几个小时内，因为在从 P-IA 中去除大量乙醇后，捕集阱容易发生堵塞。
  2. P-IA 溶液的制备
    注意：将聚合物极其缓慢地加入溶剂（水）中。建议至少用 15 分钟时间将 P-IA 加入溶剂中。若将溶剂加入聚合物中，则聚合物无法完全溶解。注意避免 P-IA 溶液发生暴沸。在制备 P-IA 溶液时应佩戴护目镜。加热过程对于溶解结晶态 P-IA 至关重要。如条件允许，建议（并优先）在相对洁净的实验室内制备 P-IA 溶液。
    1. 将 P-IA 溶解于纯水中，配制成用于细胞培养实验的 0.050 质量% 浓度溶液或用于流变仪测量的 0.50 质量% 浓度溶液：例如，将 50 mg P-IA 溶解于 100 mL 纯水中用于细胞培养，或将 500 mg P-IA 溶解于 100 mL 去离子（DI）水中用于流变仪测量。
    2. 将 P-IA 溶液在加热板上搅拌 1 小时。
      注意：为避免暴沸，加热温度不得超过 95 °C。聚合物溶液在高温下暴沸可能导致皮肤烫伤。因此，加热 P-IA 时需格外小心，并在加热过程中持续监测 P-IA 溶液的温度。
    3. 待 P-IA 溶液冷却至室温后，在室温下继续搅拌 48 小时。将热的 P-IA 溶液留在加热板上但停止加热，随后在室温下静置 20–24 小时，以确保 P-IA 溶液中无气泡残留。
  3. 交联溶液的制备
    1. 配制交联溶液，其组成为：1.0 质量% 戊二醛（由 25% 水溶液配制）、20.0 质量% Na2SO4（使用纯度>99% 的试剂）和 1.0 质量% H2SO4。例如，为一个 6 或 12 孔细胞培养板配制时，将 100 µL 戊二醛溶液、2 g 硫酸钠和 100 µL 硫酸加入 10 mL 纯水中。
  4. 人胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基
    注意：使用 DMEM/F12 培养基、Essential 6 培养基和 Essential 8 培养基进行细胞培养。
    1. 将冻存的 50X Essential 8 添加剂在 4 °C 冰箱中缓慢解冻过夜，使其完全恢复为溶液状态。
    2. 将一瓶 50X Essential 8 添加剂加入一瓶 Essential 8 基础培养基中。将混合后的培养基分装为小份（每份 50 mL）至 100 mL 离心管中，然后于 -20 °C 保存。

2. P-IA水凝胶培养皿的制备

  1. P-IA 薄膜制备
    1. 在洁净台中，将1 mL P-IA溶液加入35 mm TCP培养皿，然后在45 °C烘箱中干燥2天，形成P-IA薄膜。
  2. P-IA水凝胶培养皿的交联
    1. 将P-IA薄膜浸入水性交联溶液中，分别处理0.5、1、2、4、6、12、24和48小时。
      注意：“P-IA-X' (例如，P-IA-12 h）指交联时间为12小时的P-IA水凝胶 X h例如，12 小时）。
    2. 交联后，用纯水在室温下冲洗P-IA水凝胶，然后将水凝胶置于纯水中，在室温下保存于洁净台中。
    3. 将P-IA水凝胶浸入75.0体积/体积%的乙醇溶液中消毒1分钟，用纯水冲洗P-IA水凝胶六次，然后将P-IA水凝胶保存在纯水中，直至用于细胞培养。
  3. 寡肽或细胞外基质修饰的P-IA水凝胶培养皿的制备
    1. 通过将P-IA水凝胶浸入含有10 mg/mL的1 mL水溶液中以激活 N-(3-二甲基氨基丙基)-N'盐酸乙基碳二亚胺（EDC）和10 mg/mL N-hydroxysuccinimide (NHS) 中孵育，37 °C 条件下 1 小时，或 4 °C 条件下 4 小时。
    2. 用1 mL磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）清洗P-IA水凝胶3次，然后将P-IA水凝胶浸入含有1 mL寡肽（100–1,500 µg/mL）或细胞外基质（ECM，10–100 µg/mL）的PBS溶液中，于4 °C孵育24 h。
      注意：用于干细胞培养的寡肽序列和细胞外基质（ECMs）总结如下 表1.
    3. 寡肽或细胞外基质接枝后，用纯水洗涤P-IA水凝胶3次。
      注意：接枝了P-IA水凝胶的 Y µg/mL 的寡肽或细胞外基质（ECM）Z）此后称为 P-IA-Xh-Z 或P-IA-Xh-Z-Y，其中 X 指交联时间（h）， Y 表示寡肽或细胞外基质的浓度，以及 Z 表示不同的寡肽或细胞外基质。

3. 人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养

  1. 人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞的传代与未分化状态维持方法
    1. 维持人类胚胎干细胞（ES）例如，WA09 或 H9）细胞或人 iPS（例如在6 cm培养皿中，使用标准的人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养方案，将HS0077细胞接种于Matrigel上，并在Essential 8培养基中培养28,32.
    2. 将接近汇合的人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞在含2.0 mg/mL Dispase II的DMEM/F-12培养基中，于37 °C孵育8–10分钟，随后用DMEM/F12培养基冲洗细胞两次。
    3. 向人胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养皿中加入2 mL DMEM/F-12培养基后，使用细胞刮或移液法分离贴壁较弱的细胞集落。
    4. 将人胚胎干细胞/诱导多能干细胞收集至15 mL离心管中，在37 °C下以160 × g离心5分钟。
    5. 离心后，弃去DMEM/F12培养基，将人胚胎干细胞/诱导多能干细胞重悬于1 mL E8培养基中，然后使用细胞计数仪测定细胞密度。
    6. 在适当调整密度后接种ES/iPS细胞（1-5 × 104 每平方厘米细胞数2 传代时或按指示将细胞接种至新的培养皿中（P-IA水凝胶上接枝有寡肽或细胞外基质）。

4. 人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞的表征

  1. 碱性磷酸酶（AP）活性的评估
    1. 使用标准的碱性磷酸酶活细胞染色法检测人胚胎干细胞/诱导多能干细胞的碱性磷酸酶（AP）活性。
  2. 免疫染色
    1. 对人胚胎干细胞（hES）和人诱导多能干细胞（hiPS）进行 Tra-1-81、SSEA-4、Sox2 和 Oct3/4 的免疫染色，以按照常规方案检测其多能性28,32.
    2. 向培养人ES/iPS细胞的每个24孔板中加入0.5 mL的4%（体积/体积）多聚甲醛，随后在4 °C孵育15分钟以固定细胞。
    3. 吸去每孔中的多聚甲醛溶液。随后每孔加入 1 mL PBS，吸去 PBS 以洗涤细胞。重复洗涤 3 次。
    4. 在室温下加入0.5 mL含0.3%（体积/体积）Triton-X 100的PBS溶液，孵育30分钟，以通透细胞膜。
    5. 吸弃Triton-X 100溶液，每孔加入300 µL含2%（质量/体积）牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液（封闭缓冲液），室温孵育30分钟。
    6. 用移液器吸除封闭缓冲液，随后用移液器加入所需的一抗（Oct3/4（1:200）、Sox2（1:200）、SSEA-4（1:200）和Tra-1-81（1:200）），参见 表2) 加入每个孔中，其中1:200表示抗体用PBS稀释200倍，并在4 °C孵育一天。
    7. 吸弃一抗溶液，用300 µL含0.05% Tween 20的PBS溶液在室温下洗涤细胞3次。
    8. 加入300 µL二抗（1:200，参见 表2），该抗体针对初级IgG亚型，加入到每孔含2%（重量/体积）BSA的溶液中，于室温避光孵育1小时。
    9. 用含0.05% Tween 20的PBS溶液在室温避光条件下洗涤细胞3次，每次300 µL。
    10. 通过荧光显微镜或共聚焦显微镜分析染色后的细胞。
  3. 胚胎样体形成
    1. 通过第10代和第20代人胚胎干细胞/诱导多能干细胞的拟胚体（EB）形成能力检测其多能性。
      注意：6孔板中细胞融合度接近80%时，足以用于拟胚体形成的准备。
    2. 用 2 mL DMEM/F-12 培养基洗涤人胚胎干细胞或诱导多能干细胞两次，然后将细胞浸入 1.5 mL Essential 6 培养基中。
    3. 将接近80%融合度的人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞用200 µL枪头切割成约32块。随后使用细胞刮棒将细胞从培养皿上刮下。
    4. 收集人胚胎干细胞/诱导多能干细胞，并转移至6孔超低吸附培养皿中。
    5. 每2天用移液器吸出旧的Essential 6培养基，并加入新鲜培养基。
      注意：将细胞在 37 °C、5% CO₂ 条件下悬浮培养 2 周2.
    6. 将EBs均匀悬浮于Essential 6培养基后，转移至经0.1 wt%明胶包被的24孔TCP培养板中，在Essential 6培养基中继续培养一周。
    7. 使用针对源自三个胚胎胚层细胞标志物的抗体 [AFP（内胚层）、GFA（外胚层）、β III-微管蛋白（外胚层）和 SMA（中胚层）] 对细胞进行染色，并采用上述免疫染色方法对细胞进行评估。
  4. 畸胎瘤形成
    1. 通过第10代和第20代的人类胚胎干细胞/诱导多能干细胞畸胎瘤形成实验研究其多能性。
      注意：6孔板中约80%融合度的5个培养皿足以用于畸胎瘤形成（至少3 x 10⁶个细胞）。6 细胞是畸胎瘤形成实验所必需的。
    2. 用 2 mL DMEM/F-12 培养基将细胞冲洗两次，然后向细胞培养皿中加入 1.5 mL DMEM/F-12 培养基。
    3. 将接近80%融合度的人类胚胎干细胞或诱导多能干细胞用200 µL枪头切割成约32块。随后，使用细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。
    4. 将人胚胎干细胞/诱导多能干细胞收集至15 mL离心管中，在37 °C下以160 × g离心5分钟。
    5. 离心后，将细胞沉淀重悬于100 µL DMEM/F12培养基中，再与100 µL Matrigel混合（体积比1:1）。
    6. 将细胞悬液转移至预冷至 -20 °C 的注射器中。总共注射至少 3 × 106 将细胞皮下接种至雄性NOD-SCID（NOD.CB17-Prkdascid/JNarl) 小鼠（5-8 周龄）。
    7. 5至8周后，解剖畸胎瘤，用4.0%（质量/体积）多聚甲醛溶液固定，随后于4 °C保存。
    8. 将畸胎瘤用石蜡固定，对石蜡包埋的畸胎瘤进行切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色&E) 使用标准方案28,32.
      注意：研究人员可将固定的畸胎瘤组织送至公司，由其进行石蜡包埋、切片，并对样本进行苏木精-伊红染色&E，通常在医院病理科中使用。
  5. 人脂肪源性干细胞（ADS）培养
    1. 将培养基（含1%抗真菌抗生素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM）、0.25%胰蛋白酶-EDTA以及PBS在使用前于水浴中预热至37 °C。
    2. 用移液管将10 mL PBS加入培养细胞的每块6 cm培养皿中，洗涤人ADS细胞。
    3. 向6 cm培养皿中加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5 min。
    4. 在显微镜下观察6 cm培养皿中的细胞，以确认细胞已脱落。
    5. 将细胞收集至15 mL离心管中，加入等体积的培养基（含1%抗真菌抗生素和10%胎牛血清的DMEM），以中和胰蛋白酶-EDTA。
    6. 在37 °C下以250 × g离心5分钟。
    7. 离心后，用移液器小心弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
    8. 用培养基重悬细胞，然后以适当密度（5-10 × 103 每平方厘米细胞数2 用于传代或按指示操作）至新的培养皿中（P-IA水凝胶，分别接枝寡肽与细胞外基质或不接枝）。
  6. 人类羊水干细胞（AFS）细胞培养
    1. 将培养基（DMEM/MCDB 201 (2:3)，含20%胎牛血清（FBS）、5 ng/mL bFGF 和1%抗真菌抗生素）、0.25%胰蛋白酶-EDTA 及 PBS 在使用前于水浴中预热至 37 °C。
    2. 用移液管将10 mL PBS加入培养细胞的每个6 cm培养皿中，洗涤人羊水干细胞（AFS细胞）。
    3. 向6 cm培养皿中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，于37 °C孵育5 min。
    4. 在显微镜下观察6 cm培养皿中的细胞，以确认细胞已脱落。
    5. 将细胞收集至15 mL离心管中，加入等体积的培养基（DMEM/MCDB 201（2:3），含20%胎牛血清（FBS）、5 ng/mL bFGF和1%抗真菌抗生素）以中和胰蛋白酶-EDTA。
    6. 在37 °C条件下，以250 × g离心5分钟。
    7. 离心后，用移液器小心弃去上清液，避免扰动细胞沉淀。
    8. 用培养基重悬细胞，然后以适当的密度（5-10×10⁶ 细胞/mL）接种细胞3 每平方厘米细胞数2 传代时或按指示将细胞接种至新的培养皿中（P-IA水凝胶，分为接枝寡肽与细胞外基质和未接枝寡肽与细胞外基质两组）。

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结果

根据图1A所示的反应方案，使用不同类型的寡肽ECM（oligoECM）（图1B），制备了接枝有ECM来源寡肽（oligoECM）或具有不同弹性的ECM的P-IA水凝胶。通过调节交联强度（时间）来控制水凝胶的弹性（图1C）。接枝有纤连蛋白来源寡肽、储能模量为25.3 kPa（交联时间为24小时）的P-IA水凝胶，可支持人源iPS和ES细胞长期培养超过10-20代。特别是，使用相对较低浓度的oligoECM（200–500 μg/mL）制备的接枝有关节片段（P-IA-24h-VN1G）或双链结构（P-IA-24h-VN2G）的P-IA水凝胶，能够维持人源iPS和ES细胞的多能性；而P-IA-VN1水凝胶则需要使用较高浓度的oligoECM（>1000 μg/mL）才能维持人源iPS和ES细胞的多能性28,

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讨论

开发了具有不同刚度的P-IA-oligoECM和P-IA-ECM水凝胶，用于在无异源成分条件下长期扩增人胚胎干细胞（ES细胞）和诱导多能干细胞（iPS细胞），并维持其多能性超过十代，同时也适用于人羊水干细胞（AFS细胞）、脂肪来源干细胞（ADS细胞）及造血干细胞的培养25,28,32。将寡肽细胞外基质（oligoECM）固定化的P-IA水凝胶是细胞培养材料的优良候选者，可用于研究细胞培养材料对多种干细胞、原代细胞及癌细胞分化与增殖命运的影响。

当将P-IA溶液涂布于培养皿上时，溶液应呈透明状态。P-IA水凝胶的交联时间决定了其交联强度。P-IA水凝胶交联24小时可获得适用于人胚胎干细胞/诱导多能干细胞（ES/iPS）培养的最佳水凝胶。根据本实验方案，任何含有游离氨基的寡肽和细胞外基质（ECM）均可被接枝到P-IA水凝胶上25,<...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了中国台湾科技部资助，项目编号为 106-2119-M-008 -003、105-2119-M-008-006 和 104-2221-E-008-107-MY3。本研究还得到了中国台湾林口长庚医院项目（NCU-LSH-105-A-001）的支持。同时感谢日本文部科学省科学研究费补助金（编号 15K06591）的支持。A. Higuchi 还感谢沙特阿拉伯利雅得国王大学研究生院与科研副校长办公室国际科研合作项目（ISPP-0062）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
GTPGPQGIAGQRGVVPH Japan无规格：寡肽
缩写：环状 RGD，cRGD
GACRGDCLGAPH Japan无规格：寡肽
缩写：FN1
KGGAVTGRGDSPASSPH 日本无规格：寡肽
缩写：CS1
EILDVPSTPH Japan无规格：寡肽
缩写：VN1
KGGPQVTRGDVFTMPPH 日本无规格：寡肽
缩写：HBP1
GKKQRFRHRNRKGPH Japan无规格：寡肽
缩写：HBP2C
CGGGKKQRFRHRNRKGPH Japan无规格：寡肽
缩写：VN1G
GGGGKGGPQVTRGDVFTMPPH Japan无规格：寡肽
缩写：VN2C
GCGGKGGPQVTRGDVFTMPPH 日本无细胞外基质
缩写：rVN
玻连蛋白Thermo Fisher ScientificA14700细胞外基质
缩写：FN
纤连蛋白Sigma-AldrichF2006规格：市售涂层材料
缩写：Synthemax II
Synthemax II康宁3535规格：聚合物
聚乙烯醇-co-衣康酸日本 VAM &和PovalAF-17规格：化学
戊二醛Sigma-AldrichG5882规格：化学类
Na2SO4Sigma-Aldrich239313规格：化学
H2SO4Sigma-Aldrich339741规格：化学
缩写：EDC
N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐Sigma-AldrichE7750规格：化学
缩写：NHS
N-羟基琥珀酰亚胺Sigma-Aldrich56480规格：化学
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148规格：化学
Triton-X100Sigma-AldrichT8787规格：细胞培养耗材
细胞刮刀康宁3008规格：细胞培养耗材
Dispase IISigma-AldrichSI-D4693规格：细胞培养基
Essential 6Thermo Fisher ScientificA1516401规格：细胞培养基
Essential 8Thermo Fisher ScientificA1517001规格：细胞培养基
DMEM/F12赛默飞世尔科技11330-032规格：细胞培养基
DMEM赛默飞世尔科技12800-017规格：细胞培养基
MCDB 201Sigma-AldrichM6770规格：ES 细胞
人类胚胎干细胞WiCell 研究所股份有限公司WA09规格：iPS 细胞
人诱导多能干细胞理研细胞库HS0077规格：35 毫米
缩写：TCP
TCP 培养皿康宁353001规格：60 mm
缩写：TCP
TCP培养皿康宁353002规格：24孔板
24孔板康宁353047规格：封闭剂
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA8806规格：检测试剂
碱性磷酸酶活细胞染色Thermo Fisher ScientificA14353规格：检测试剂
苏木精 &&伊红Sigma-Aldrich1.05175规格：拟胚体形成培养皿
6孔超低吸附培养皿康宁3471规格：包被材料
明胶Sigma-AldrichG9391规格：包被材料
Matrigel康宁354230小鼠
NOD-SCID 小鼠国家应用研究实验室无规格：血清
胎牛血清生物工业公司04-001-1A规格：抗生素
抗真菌抗生素赛默飞世尔科技15240-062规格：抗体
Nanog 抗体InvitrogenMA1-017规格：抗体
SSEA4 抗体Abcamab16287规格：抗体
OCT3/4 抗体InvitrogenPA5-27438规格：抗体
Sox2 抗体Invitrogen48-1400规格：抗体
平滑肌肌动蛋白抗体InvitrogenPA5-19465规格：抗体
甲胎蛋白（AFP）抗体InvitrogenPA5-21004规格：抗体
抗体 GFAPInvitrogenMA5-15086规格：抗体
Alexa Fluor 555 – 偶联的山羊抗小鼠抗体InvitrogenA-21422规格：抗体
Alexa Fluor 488 – 偶联的山羊抗兔抗体InvitrogenA-11008规格：抗体

参考文献

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