本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶在细胞凋亡和先天免疫中发挥关键作用。其中，被称为起始型半胱天冬酶（initiator caspases）的一个亚类是在这些信号通路中首先被激活的酶类。该亚类包括caspase-2、-8和-9，以及炎症性半胱天冬酶caspase-1、-4和-5。起始型半胱天冬酶均通过二聚化而被激活，该过程发生于被招募至特定多蛋白复合物（称为激活平台）之后。半胱天冬酶双分子荧光互补（Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）是一种基于成像的技术，该技术将分裂的荧光蛋白与起始型半胱天冬酶融合，用于可视化起始型半胱天冬酶向其激活平台的招募过程以及由此产生的诱导性邻近效应。这种荧光信号可反映起始型半胱天冬酶激活所需最早期步骤之一。结合多种不同的显微镜技术，该方法可在群体水平上定量分析半胱天冬酶激活的效率，同时可在单细胞水平上检测半胱天冬酶激活的动力学特征以及半胱天冬酶激活复合物的大小和数量。
引言
半胱天冬酶（caspase）蛋白酶家族以其在细胞凋亡和先天免疫中的关键作用而著称1。由于其重要性，确定特定caspase在何时、何处以及以多高的效率被激活，可为caspase激活通路的机制提供至关重要的见解。本文所述的基于成像的实验方案能够可视化caspase激活级联反应的最初步骤。该技术利用了驱动caspase激活的动态蛋白质-蛋白质相互作用。
半胱天冬酶（caspases）可分为两类：起始型半胱天冬酶（initiator caspases，包括caspase-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10和-12）和效应型半胱天冬酶（executioner caspases，包括caspase-3、-6和-7）。效应型半胱天冬酶在细胞中以预先形成的二聚体形式存在，并通过大亚基与小亚基之间的切割而被激活2。激活后，它们可切割多种结构蛋白和调控蛋白，从而导致细胞凋亡3。起始型半胱天冬酶是在信号通路中最早被激活的半胱天冬酶，通常可触发效应型半胱天冬酶的激活。与效应型半胱天冬酶不同，起始型半胱天冬酶通过二聚化实现激活4,5。这种二聚化过程依赖于将无活性的单体招募至特定的高分子量复合物，这些复合物被称为激活平台。激活平台的组装由一....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 细胞和培养皿的准备
注意：步骤 1-3 需在组织培养用层流罩内进行。佩戴手套。
- 若使用玻璃底培养皿，请用纤维连接蛋白包被玻璃表面。若使用塑料培养皿，则跳至步骤 1.2。
- 配制 0.1 mg/mL 的纤维连接蛋白溶液：将 1 mL 浓度为 1 mg/mL 的纤维连接蛋白溶液加入 9 mL 的 1 × PBS 中稀释。
- 每孔加入 0.5–1 mL 纤维连接蛋白溶液，覆盖玻璃底部，室温孵育 1–5 分钟。
- 使用移液器回收纤维连接蛋白溶液，并于 4 °C 保存。
注意：纤维连接蛋白溶液可多次重复使用。 - 用 1–2 mL 的 1 × PBS 洗涤玻璃表面一次，随后吸除 PBS。
- 在 6 孔板中每孔接种 1 × 105 个细胞，加入 2 mL 相应的细胞培养基（不同规格孔板的细胞接种数量参见 表 1）。若使用稳定表达半胱天冬酶 BiFC 组分的细胞系（见讨论部分），则每孔接种 2 × 105 个细胞，并直接进入处理步骤（步骤 3）。
- 将细胞置于 37 °C 细胞培养箱中孵育过夜，使其贴壁。
2. 转染细胞以导入半胱天冬酶BiFC组分
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
DNA损伤诱导的caspase-2 BiFC示例见图3。使用拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（camptothecin）诱导DNA损伤和caspase-2活化。红色荧光蛋白mCherry作为报告分子，用于显示细胞表达了BiFC探针，并有助于观察细胞总数。Venus荧光以绿色显示，较大的点状结构代表caspase-2诱导的接近信号。可通过计数这些细胞来确定Venus阳性细胞的百分比。也可从此类图像中得出有关亚细胞定位的结论。在所示示例中，caspase-2诱导的接近信号在核仁和细胞质中均被检测到17。为了高分辨率地可视化caspase活化复合物的亚细胞定位，可对单个细胞进行三维成像。图4展示了两种表示此类三维图像的方式。第一种是生成细胞的三维重建图像。该示例显示喜树碱诱导的caspase-2 BiFC信号为绿色，细胞核为红色。三维重建图像展示了两种荧光信号在整个细胞内的相对定位。当以电影形式呈现、围绕单一轴旋转细胞时.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案讨论了利用分裂荧光蛋白检测半胱天冬酶（caspase）诱导的分子接近性。本技术选用分裂型Venus荧光蛋白，因其亮度高、光稳定性强，且复性速度快13。因此，通过分析Venus在caspase诱导接近条件下的复性过程，可近乎实时地评估caspase蛋白相互作用的动力学特征。Venus被分割为两个略微重叠的片段：N端片段（Venus-N或VN），包含第1-173位氨基酸；C端片段（Venus-C或VC），包含第155-239位氨基酸残基。其他类型的分裂荧光蛋白也存在，但某些蛋白（如分裂型mCherry）需要在4 °C孵育长达2小时才能完成复性21。此外，包括分裂型Cerulean（一种青色荧光蛋白变体）和远红光分裂型mLumin在内的其他分裂荧光蛋白，在此应用背景下尚未经过测试13,22。最终，若这些荧光蛋白被证实适用于检测caspase诱导的分子接近性，则有望实现对多种caspase的同步评估。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们谨向Bouchier-Hayes实验室所有曾为本技术的开发做出贡献的前成员致以诚挚感谢。本工作部分由德克萨斯儿童医院儿科研究启动基金资助（资助对象：LBH）。我们感谢德克萨斯州休斯顿市MD安德森癌症中心的Joya Chandra允许我们纳入与其团队合作发表的数据。文中所述试剂的开发得到了贝勒医学院细胞计数与细胞分选核心设施的支持，该设施获得美国国立卫生研究院（NIH）资助（NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 和 NCRR S10RR024574），并承蒙Joel M. Sederstrom的协助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔未包被1.5号20 mm玻璃底培养皿 | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| 人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白 | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 试剂 | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC 质粒 | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN 质粒 | Addgene | 49262 | |
| 炎症性caspase BiFC 质粒 | 可向LBH申请获取 | ||
| 稳定表达C2-Pro BiFC组分的HeLa细胞 | 可向LBH申请获取 | ||
| DsRed mito 质粒 | Clontech | 632421 | 可在Addgene上找到可用作荧光报告基因的类似质粒 |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2-巯基乙醇 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
参考文献
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
