方法文章

利用双分子荧光互补技术揭示半胱天冬酶激活通路

DOI：

10.3791/57316

⸱

2018年3月5日

 , 
1Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology, Baylor College of Medicine, 2Department of Pediatrics, Division of Hematology-Oncology and Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了半胱天冬酶双分子荧光互补（BiFC）技术；这是一种基于成像的方法，可用于可视化诱导起始半胱天冬酶的邻近效应，这是其激活的第一步。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶在细胞凋亡和先天免疫中发挥关键作用。其中，被称为起始型半胱天冬酶（initiator caspases）的一个亚类是在这些信号通路中首先被激活的酶类。该亚类包括caspase-2、-8和-9，以及炎症性半胱天冬酶caspase-1、-4和-5。起始型半胱天冬酶均通过二聚化而被激活，该过程发生于被招募至特定多蛋白复合物（称为激活平台）之后。半胱天冬酶双分子荧光互补（Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）是一种基于成像的技术，该技术将分裂的荧光蛋白与起始型半胱天冬酶融合，用于可视化起始型半胱天冬酶向其激活平台的招募过程以及由此产生的诱导性邻近效应。这种荧光信号可反映起始型半胱天冬酶激活所需最早期步骤之一。结合多种不同的显微镜技术，该方法可在群体水平上定量分析半胱天冬酶激活的效率，同时可在单细胞水平上检测半胱天冬酶激活的动力学特征以及半胱天冬酶激活复合物的大小和数量。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

半胱天冬酶（caspase）蛋白酶家族以其在细胞凋亡和先天免疫中的关键作用而著称1。由于其重要性，确定特定caspase在何时、何处以及以多高的效率被激活，可为caspase激活通路的机制提供至关重要的见解。本文所述的基于成像的实验方案能够可视化caspase激活级联反应的最初步骤。该技术利用了驱动caspase激活的动态蛋白质-蛋白质相互作用。

半胱天冬酶（caspases）可分为两类：起始型半胱天冬酶（initiator caspases，包括caspase-1、-2、-4、-5、-8、-9、-10和-12）和效应型半胱天冬酶（executioner caspases，包括caspase-3、-6和-7）。效应型半胱天冬酶在细胞中以预先形成的二聚体形式存在，并通过大亚基与小亚基之间的切割而被激活2。激活后，它们可切割多种结构蛋白和调控蛋白，从而导致细胞凋亡3。起始型半胱天冬酶是在信号通路中最早被激活的半胱天冬酶，通常可触发效应型半胱天冬酶的激活。与效应型半胱天冬酶不同，起始型半胱天冬酶通过二聚化实现激活4,5。这种二聚化过程依赖于将无活性的单体招募至特定的高分子量复合物，这些复合物被称为激活平台。激活平台的组装由一系列特异性的蛋白质-蛋白质相互作用所调控。这些相互作用由起始型半胱天冬酶前体中保守的蛋白质相互作用基序介导，包括死亡结构域（death domain, DD）、死亡效应结构域（death effector domain, DED）和半胱天冬酶招募结构域（caspase recruitment domain, CARD）6（图1A）。激活平台通常包含一种受体蛋白和一种衔接蛋白。受体通常在配体结合后被激活，引发构象变化，从而促使多个分子发生寡聚化。随后，受体可直接招募半胱天冬酶，或先招募衔接分子，再将半胱天冬酶带入复合物中。因此，大量半胱天冬酶分子得以在空间上紧密接近，从而允许发生二聚化。这一机制被称为“诱导邻近模型”（induced proximity model）7。一旦形成二聚体，半胱天冬酶会进行自剪切加工，以稳定其活性酶形式4,8。例如，Apaf1凋亡体的组装由细胞色素c（cytochrome c）触发，后者在称为线粒体外膜通透化（mitochondrial outer membrane permeabilization, MOMP）的过程中从线粒体释放出来。随后，Apaf1通过其与caspase-9共有的CARD结构域介导的相互作用招募caspase-99。类似的蛋白质相互作用还导致CD95死亡诱导信号复合物（death inducing signaling complex, DISC）的形成，从而激活caspase-8；PIDD体（PIDDosome）的组装可激活caspase-2；以及多种炎性小体复合物的形成，启动caspase-1的激活10,11,12。因此，起始型半胱天冬酶通过一种共同机制被招募至特定的激活平台，实现诱导邻近和二聚化，若无此过程，则无法被激活。

半胱天冬酶双分子荧光互补（Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC）是一种基于成像的检测方法，用于测量起始型半胱天冬酶激活过程中的第一步，从而直接可视化激活平台组装后所引发的半胱天冬酶分子间的接近。该方法利用了分裂型荧光蛋白Venus的特性。Venus是黄色荧光蛋白（YFP）的一种更亮且光稳定性更强的变体，可被分割为两个无荧光、略微重叠的片段：Venus的N端（Venus N或VN）和C端（Venus C或VC）。当这两个片段彼此靠近时，仍能重新折叠并恢复荧光13。每个Venus片段与半胱天冬酶的前结构域（prodomain）融合，该结构域是半胱天冬酶中能够结合激活平台的最小区域。这种设计确保半胱天冬酶不保留酶活性，因此可同时分析与内源性事件相关的下游过程。当半胱天冬酶的前结构域被招募至激活平台并发生诱导性接近时，Venus片段即重新折叠并产生荧光（图1B）。由此产生的Venus荧光可用于在单细胞水平上准确且特异地监测起始型半胱天冬酶激活平台的亚细胞定位、组装动力学及组装效率。成像数据可通过共聚焦显微镜或标准荧光显微镜获取，并可适配多种不同的显微技术，包括：实时延时成像以追踪半胱天冬酶的激活过程；高分辨率成像以精确定位亚细胞分布；以及终点法定量分析激活效率。

该技术最初是为了研究caspase-2的激活而开发的14尽管caspase-2的激活平台被认为是PIDDosome复合物，该复合物由受体PIDD（p53诱导的含死亡结构域蛋白）和接头蛋白RAIDD（含死亡结构域的RIP相关ICH-1/CAD-3同源蛋白）组成，但已有研究报道存在不依赖PIDDosome的caspase-2激活机制。这表明caspase-2可能存在其他激活平台。 15,16尽管尚不清楚caspase-2激活平台的全部组分，但caspase BiFC技术已成功实现了在分子水平上对caspase-2信号通路的深入研究。 14,17我们还成功地将该方案应用于炎症性胱天蛋白酶（caspase-1、-4、-5 和 -12）。 18 原则上，相同的方法也足以用于类似地分析其余的起始型caspase。该方案也可相应地调整用于研究其他以二聚化为主要激活信号的通路。例如，STAT蛋白在被Janus激酶（JAK）磷酸化后通过二聚化而被激活。 19因此，BiFC系统可用于可视化STAT激活以及由动态蛋白质相互作用调控的许多其他信号通路。以下实验方案提供了将报告系统导入细胞、图像采集及分析的逐步操作指南。

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方案

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1. 细胞和培养皿的准备

注意：步骤 1-3 需在组织培养用层流罩内进行。佩戴手套。

  1. 若使用玻璃底培养皿，请用纤维连接蛋白包被玻璃表面。若使用塑料培养皿，则跳至步骤 1.2。
    1. 配制 0.1 mg/mL 的纤维连接蛋白溶液：将 1 mL 浓度为 1 mg/mL 的纤维连接蛋白溶液加入 9 mL 的 1 × PBS 中稀释。
    2. 每孔加入 0.5–1 mL 纤维连接蛋白溶液，覆盖玻璃底部，室温孵育 1–5 分钟。
    3. 使用移液器回收纤维连接蛋白溶液，并于 4 °C 保存。
      注意：纤维连接蛋白溶液可多次重复使用。
    4. 用 1–2 mL 的 1 × PBS 洗涤玻璃表面一次，随后吸除 PBS。
  2. 在 6 孔板中每孔接种 1 × 105 个细胞，加入 2 mL 相应的细胞培养基（不同规格孔板的细胞接种数量参见 表 1）。若使用稳定表达半胱天冬酶 BiFC 组分的细胞系（见讨论部分），则每孔接种 2 × 105 个细胞，并直接进入处理步骤（步骤 3）。
  3. 将细胞置于 37 °C 细胞培养箱中孵育过夜，使其贴壁。

2. 转染细胞以导入半胱天冬酶BiFC组分

  1. 使用适当的转染试剂对细胞进行转染。
    注意：本方案概述了 Lipofectamine 2000 的操作步骤，该试剂已优化以实现最小毒性。本方案已在 HeLa 细胞、MCF7 细胞和 LN18 细胞中成功应用。若使用其他转染试剂，请遵循制造商的说明并根据需要进行优化。
    1. 在无菌离心管中，将 12 µL 转染试剂加入 750 µL 低血清培养基中。
    2. 室温孵育 5 分钟。
    3. 为每个待转染孔，在无菌的 1.5 mL 离心管中加入 10 ng 报告基因质粒（编码荧光蛋白的质粒，例如 红色荧光蛋白 [RFP]，用于标记转染的细胞）。
    4. 向每个离心管中加入 20 ng 的每种半胱天冬酶 BiFC 质粒（例如，20 ng caspase-2 前结构域 [C2 Pro]-VC 和 20 ng C2 Pro-VN）（表 2）。
    5. 加入低血清培养基，将每个离心管的总体积补至 100 µL。
    6. 使用 p200 移液器，将 2.1.2 步骤中的 100 µL 转染试剂溶液逐滴加入质粒混合物中。
    7. 将质粒-转染试剂混合物在室温下孵育 20 分钟。
    8. 用移液器或抽吸装置吸除细胞中的培养基，然后使用 p1000 移液器，沿孔壁轻轻加入 800 µL 无血清培养基。
    9. 使用 p200 移液器，将 200 µL DNA-脂质复合物逐滴加入每个孔中。
    10. 将细胞置于 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 3 小时。
    11. 小心操作，避免破坏单层细胞，通过抽吸或移液器吸除含有 DNA-脂质复合物的无血清培养基。
    12. 沿每个孔壁轻轻加入 2 mL 预热（37 °C）的完全生长培养基。
  2. 将细胞置于 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 24–48 小时，以获得最佳蛋白表达。

3. 诱导caspase活化

  1. 转染后约24小时，使用可诱导caspase活化的药物或刺激物进行处理。
    1. 将所需浓度的药物加入预热（37 °C）的成像培养基中（完全生长培养基补充 Hepes [20 mM, pH 7.2–7.5] 和 2-巯基乙醇 [55 µM]），轻轻混匀（表3）。
    2. 使用移液器或抽吸装置吸除细胞中的培养基，然后用移液器将3.1.1步骤中的溶液2 mL轻轻沿孔壁加入。
    3. 向一个孔中加入不含药物的成像培养基，作为未处理对照。
  2. 将细胞置于37 °C组织培养孵育箱中孵育，或直接进入步骤4.3进行延时成像实验。

4. Caspase BiFC 数据采集

  1. 用于单时间点检测的Caspase BiFC
    1. 按照制造商的说明打开显微镜和荧光光源。
    2. 在RFP滤光镜下找到细胞，并聚焦于报告基因的荧光。
    3. 使用手动计数器，统计视野中所有RFP阳性细胞的数量，并记录该数值。
    4. 在保持相同视野的情况下，切换至GFP滤光片（如有YFP滤光片也可使用），并使用手动计数器统计同时呈绿色的红色细胞（Venus阳性细胞）数量。在两种滤光片之间反复切换，以确保仅对红色细胞评估其Venus阳性状态。记录该数值图3).
    5. 从培养板的三个独立区域中，分别计数至少100个RFP阳性细胞。
    6. 在每个区域，计算 Venus 阳性转染细胞的百分比（即 红细胞同时也是绿色的）。对所得百分比取平均值以计算标准差。
  2. caspase BiFC 的三维成像
    1. 按照制造商的说明打开显微镜，并启动采集软件。
    2. 选择60倍或63倍油镜物镜，并在物镜上滴加一滴镜油
    3. 将培养皿使用正确的培养皿架放置在显微镜载物台上。
    4. 使用落射荧光光源和显微镜目镜，或共聚焦激光和计算机屏幕，定位至目标视野。
    5. 使用RFP激光或滤光片聚焦于报告荧光。
    6. 如果此前使用的是落射荧光照明，此时应切换光源至共聚焦激光器，并通过相机采集、在计算机屏幕上由采集软件显示的实时图像观察活细胞。
    7. 使用操纵杆控制和调焦旋钮，微调细胞的焦距和位置，使细胞位于视野中心。选择彼此分离且不重叠的细胞。
    8. 将Venus和RFP的激光功率设为50%，曝光时间设为100 ms，作为确定实验最佳设置的初始参数。
    9. 打开实时采集，检查两个通道的成像结果及其对应的直方图显示。
    10. 如果信号较弱且图像难以辨认，可逐步增加激光功率百分比和/或曝光时间，直至图像中的信号清晰可见。
    11. 确保信号未达到饱和。检查显示的直方图，确认每种荧光染料均可见明显的峰。如果峰形占据整个直方图显示范围，则应调低激光功率和曝光设置。图2).
    12. 在相同条件下观察对照（未处理或未转染）细胞，以确保信号的特异性。
      注意：单色转染细胞也可用于对照交叉信号，但如果信号在空间上彼此分离（例如 线粒体与细胞质）的情况下，这并非必要。
    13. 在显微镜软件中选择或打开Z轴层析模块。
    14. 使用调焦旋钮，大致调整至细胞中心对应的焦平面位置。
    15. 将焦点沿一个方向调节，直至细胞不可见，将此位置设为顶部位置。
    16. 将焦距向相反方向调节，直至细胞再次不可见，并将此位置设为底部位置。
    17. 选择最佳步长（通常约为 20 µm），然后开始采集，以指示相机在顶部与底部位置之间的每个 20 µm 步长处自动获取各通道的单幅图像。
    18. 使用3D渲染软件重建3D图像（图4，视频 1).
  3. 半胱天冬酶BiFC的延时成像
    1. 实验开始前至少1小时，打开显微镜并将温度设置为37 °C。
    2. 选择40倍、60倍或63倍油镜物镜，并在物镜上滴加一滴镜油。
    3. 将培养皿使用正确的培养皿架放置在显微镜载物台上。
    4. 如果一氧化碳2 来源可用时，将 CO2 递送装置（通常为连接至输送 CO 的管路的丙烯酸玻璃盖）2）置于板架上方。设置 CO2 将水平调至5%并开启CO2 控制器从软件内部。如果 CO2 若无其他来源，需添加 20 mM Hepes 以缓冲培养基。
    5. 使用RFP激光，通过相机获取并经由计算机屏幕上的采集软件显示，观察转染细胞区域的活细胞图像。
    6. 按照步骤 4.2.8-4.2.12，输入 RFP 激光的激光功率百分比和曝光时间参数。在仍能检测到荧光信号的前提下，尽量将这些数值保持在最低水平。
    7. 使用阳性对照样本（参见 表3 例如，按照步骤 4.2.8-4.2.12 输入 YFP 激光的激光功率百分比和曝光时间设置。在仍能检测到 Venus 信号的前提下，应尽可能保持这些数值最低。
    8. 为每孔选择多个不同位置，每个位置包含一个或多个表达报告基因的细胞。
    9. 输入延时摄影中每帧之间的时间间隔以及要拍摄的总帧数。确保在拍摄下一帧之前有足够时间完成所有选定位置的图像采集。
    10. 重新访问每个位置，并根据需要校正和更新焦距。
    11. 为校正因温度变化或外部振动引起的焦平面漂移，开启焦点漂移校正系统（如配备）。
    12. 开始延时拍摄并保存数据。
    13. 使用现有的成像软件分析数据（图5，视频 2).

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结果

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DNA损伤诱导的caspase-2双分子荧光互补（BiFC）示例见图3。使用拓扑异构酶I抑制剂喜树碱（camptothecin）诱导DNA损伤及caspase-2活化。红色荧光蛋白mCherry作为报告分子，用于显示细胞表达了BiFC探针，并有助于观察细胞总数。Venus荧光以绿色显示，较大的点状信号代表caspase-2诱导的邻近相互作用。可通过计数这些细胞以确定Venus阳性细胞的百分比。也可从此类图像中得出有关亚细胞定位的结论。在所示示例中，caspase-2诱导的邻近信号不仅在核仁中被检测到，也在细胞质中被观察到17。为了高分辨率地可视化caspase活化复合物的亚细胞定位，可对单个细胞进行三维成像。图4展示了两种表示此类三维图像的方式。第一种是生成细胞的三维重建图像。该示例显示喜树碱诱导的caspase-2 BiFC信号为绿色，细胞核为红色。三维重建图像展示了两种荧光信号在整个细胞中的相对定位。此...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案讨论了利用分裂荧光蛋白检测半胱天冬酶（caspase）诱导的分子接近性。本技术选用分裂型Venus荧光蛋白，因其亮度高、光稳定性强，且复性速度快13。因此，通过分析Venus在caspase诱导接近条件下的复性过程，可近乎实时地评估caspase蛋白相互作用的动力学特征。Venus被分割为两个略微重叠的片段：N端片段（Venus-N或VN），包含第1-173位氨基酸；C端片段（Venus-C或VC），包含第155-239位氨基酸残基。其他类型的分裂荧光蛋白也存在，但某些蛋白（如分裂型mCherry）需要在4 °C孵育长达2小时才能完成复性21。此外，包括分裂型Cerulean（一种青色荧光蛋白变体）和远红光分裂型mLumin在内的其他分裂荧光蛋白，在此应用背景下尚未经过测试13,22。最终，若这些荧光蛋白被证实适用于检测caspase诱导的分子接近性，则有望实现对多种caspase的同步评估。

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们谨向Bouchier-Hayes实验室所有曾为本技术的开发做出贡献的前成员致以诚挚感谢。本工作部分由德克萨斯儿童医院儿科研究启动基金资助（资助对象：LBH）。我们感谢德克萨斯州休斯顿市MD安德森癌症中心的Joya Chandra允许我们纳入与其团队合作发表的数据。文中所述试剂的开发得到了贝勒医学院细胞计数与细胞分选核心设施的支持，该设施获得美国国立卫生研究院（NIH）资助（NIAID P30AI036211、NCI P30CA125123 和 NCRR S10RR024574），并承蒙Joel M. Sederstrom的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6孔未包被1.5号20 mm玻璃底培养皿MattekP06G-1.5-20-F
人血浆纤维连接蛋白纯化蛋白MilliporeFC010-10MG
DPBSSigmaD8537-6x500ML
Lipofectamine 2000 试剂Invitrogen11668019
OPTI MEM IInvitrogen31985088
C2-Pro VC 质粒Addgene49261
C2-Pro VN 质粒Addgene49262
炎症性caspase BiFC 质粒可向LBH申请获取
稳定表达C2-Pro BiFC组分的HeLa细胞可向LBH申请获取
DsRed mito 质粒Clontech632421可在Addgene上找到可用作荧光报告基因的类似质粒
HEPESInvitrogen15630106
2-巯基乙醇 1000XInvitrogen21985023
q-VD-OPHApex BioA1901

参考文献

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Venus

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