骨骼肌神经血管耦合、氧化能力及微血管功能的“一站式”近红外光谱检测

摘要

本文介绍了一种简单、无创的方法，通过近红外光谱技术，在一次临床或实验室就诊过程中评估反应性充血、神经血管耦合以及骨骼肌氧化能力。

摘要

运动是一种主要的血流动力学应激，需要高度协调的神经血管反应，以使氧气输送与代谢需求相匹配。反应性充血（对短暂组织缺血的响应）是心血管事件的独立预测因子，可为血管健康和血管舒张能力提供重要信息。骨骼肌氧化能力在健康与疾病中同样重要，因为它决定了肌细胞过程的能量供应。本文介绍了一种简单、无创的方法，利用近红外光谱技术，在一次门诊或实验室就诊期间同时评估上述三个主要临床终点指标（反应性充血、神经血管耦合和肌肉氧化能力）。与多普勒超声、磁共振成像/波谱分析、有创导管血流测量或肌肉活检不同，我们的方法对操作者依赖性更低、成本低廉且完全无创。我们实验室的代表性数据结合既往发表文献的汇总数据，共同展示了这些终点指标的应用价值。一旦掌握该技术，将其应用于临床人群将有助于深入理解运动不耐受和心血管功能障碍的机制。

引言

短暂组织缺血后的充血反应已成为评估（微）血管功能的关键无创性指标。在主干动脉闭塞期间，下游小动脉会扩张，以试图抵消缺血带来的损伤。当解除闭塞后，由于血管阻力降低，从而引发充血反应，其程度取决于个体扩张下游微血管的能力。尽管反应性充血是心血管事件的一个强有力的独立预测因子^1,2 ，因而具有重要的临床意义，但其对运动耐量和生活质量的功能意义尚不明确。

事实上，动态运动是一种主要的心血管应激，需要高度协调的神经血管反应，以使氧气输送与代谢需求相匹配。例如，在孤立的肌肉收缩期间，骨骼肌血流量可增加近100倍³，如果将这种血流动力学反应外推至全身运动，则会超出心脏的泵血能力。因此，为了避免严重低血压，交感神经（即缩血管）活动增强，以将心输出量从非活动组织和内脏组织重新分配至活动的骨骼肌⁴。交感神经输出也作用于正在运动的骨骼肌⁵；然而，局部代谢信号会减弱缩血管反应，以确保组织获得充足的氧气供应^{6,7,8,9,10,11}。这一整体过程被称为功能性交感神经抑制¹²，对运动期间骨骼肌血流的正常调节至关重要。由于骨骼肌血流是决定有氧能力的关键因素——而有氧能力是生活质量以及心血管疾病发病率和死亡率的独立预测指标¹³——理解运动期间骨骼肌血流和组织氧气输送的调控机制具有重要的临床意义。

然而，氧气输送仅占Fick方程的一半，另一半则由氧气利用来满足。在影响氧气利用的主要因素中，线粒体氧化磷酸化在静息和运动状态下为细胞过程提供充足能量方面发挥着至关重要的作用。事实上，肌肉氧化能力的受损可能会限制身体功能能力和生活质量^14,15,16。目前常采用多种方法来评估肌肉氧化能力，包括有创性肌肉活检以及昂贵且耗时的磁共振波谱（MRS）技术。

本文提出了一种新颖的无创方法，利用近红外光谱技术（NIRS），可在一次门诊或实验室就诊中同时评估上述三个主要临床终点指标（反应性充血、交感神经抑制和肌肉氧化能力）。该方法具有三大优势：首先，该技术便于携带、成本相对较低且操作简便。目前用于测量反应性充血的多普勒超声方法高度依赖操作者，需要丰富的技能和培训，同时还需要复杂且昂贵的数据采集硬件及后期处理软件。此外，该技术有望被引入临床环境和/或大规模临床试验中，用于床旁监测或评估治疗效果。其次，由于其方法学特性，该技术专门针对骨骼肌微血管系统，从而提高了整体特异性。而采用多普勒超声的替代方法则完全聚焦于上游的传导血管，并间接推断下游变化，这可能会削弱信号强度。第三，该技术完全无创。传统的骨骼肌氧化能力评估依赖于侵入性且疼痛的肌肉活检，而功能性交感神经抑制通常需通过动脉内注射拟交感药或交感神经阻滞剂来评估。本方法完全避免了这些侵入性操作。

方案

本方案遵循德克萨斯大学阿灵顿分校机构审查委员会的指南，并符合《赫尔辛基宣言》最新版本所规定的要求。因此，在开始研究程序之前，必须已（并应继续）获得书面知情同意书。

1. 仪器设备

注意：以下仪器描述基于本实验室所使用的近红外（NIR）光谱仪及数据采集系统（参见材料表）。因此，说明中包含确保这些设备最佳运行所必需的操作步骤，包括使用配套软件和校准模型对NIR探头进行校准，以及使用遮光布排除环境光干扰。若使用不同的数据采集硬件和/或软件，研究人员应参考各自设备的用户手册，进行相应的校准和环境光控制。图1展示了下文所述的实验装置和仪器配置。

1. 指导受试者仰卧，双腿置于下体负压舱（LBNP 舱）内（图 1A），使其腰带线大致与 LBNP 舱开口齐平。有关 LBNP 舱的构建方法，请参见 参考文献¹⁷。
2. 在受试者身上放置三个心电图电极：两个置于下部锁骨中线位置，另一个置于受试者左侧髂嵴内侧。由于对下肢接触受限、上肢需安装仪器以及手握力运动期间手臂活动等因素，该配置可提供最佳结果。
3. 在受试者优势手腕处安装无创血压监测模块。将手指血压袖带分别置于每个手指上，并连接至该模块（图 1B）。确保手指血压袖带根据设备附带的用户手册进行正确校准。
4. 指导受试者用非优势手臂握住握力计（HGD），手臂呈轻度外展位。手臂应舒适地放置在床旁桌面上。应调整握力计的距离和角度，以便在手臂活动最小的情况下实现最佳握力强度（图 1C）。
5. 将握力计固定在床旁桌面上。
6. 测量受试者的最大自主收缩力（MVC）。告知受试者，当提示时，必须尽可能用力挤压握力计，仅使用手部和前臂肌肉。指导受试者在进行最大握力测试时，不得动员上臂、胸部、肩部或腹部肌肉。
7. 重复步骤 1.6 三次，每次间隔至少 60 秒。记录达到的最大力量（三次中的最佳值）。该最大力量将用于计算骨骼肌氧化能力和神经血管耦合的运动强度（见下文）。
8. 在运动手的上臂处放置一个快速充气袖带。将快速充气控制器的气管连接至袖带。
9. 确定指深屈肌的位置。使用皮肤标记笔标出可触及肌肉的边界。
10. 根据设备附带的用户手册，确保近红外光谱仪已正确校准。使用酒精棉片清洁近红外探头将要放置区域的皮肤。
11. 将近红外探头置于肌肉腹侧中心位置（指深屈肌），并牢固固定于前臂。
12. 用深色布料包裹探头和前臂，以最大限度减少环境光干扰（图 1C，图 1D）。
13. 当准备进行功能性交感神经抑制部分实验时，将受试者密封于 LBNP 舱内。

2. 骨骼肌氧化能力

注：图2展示了测量骨骼肌氧化能力实验步骤的代表性数据轨迹。该实验方法此前已通过活体磷磁共振波谱（in vivo phosphorus MRS）¹⁸ 和原位肌肉呼吸测定法（in situ muscle respirometry）¹⁹ 进行过验证，并正获得广泛认可²⁰。

1. 按照上述说明对受试者进行仪器连接（仪器设备).
2. 指导受试者静卧 2 分钟，同时监测脱氧血红蛋白（HHb）和氧合血红蛋白（HbO₂）₂）通过近红外探针。
   注意：此休息期可使受试者从仪器安装过程中可能产生的运动伪影中恢复，并确保获得稳定的基线测量值。若2分钟后未出现显著波动，则可认为受试者已达到稳态，即静息基线。
3. 在袖带阻断前，告知受试者将要充气袖带。将上臂袖带充气至至少高于收缩压 30 mmHg，并维持 5 分钟（即， 高于收缩压）。指导受试者在袖带充气期间及放气后，尽量保持手臂静止和放松。
   注意：该5 min肱动脉袖带阻断方案 closely 反映了目前公认的血管阻断试验临床标准^{21,22,23,24,25}.
4. 记录初始/基线值（袖带阻塞前）以及组织饱和度（StO₂）的最低值₂在袖带阻塞期间测定这两个值，并确定它们的中点。
   
5. 让受试者从袖带阻塞中恢复，并回到静息基线值。当受试者维持静息基线至少1分钟以上时，继续下一步操作。
6. 指导受试者以相当于其最大自主收缩力（MVC）50%的强度握紧并维持等长手部握力。鼓励受试者持续保持等长收缩，直至组织脱氧达到50%。达到该数值后，告知受试者放松手部，并告知其无需再进行任何运动或动作。
7. 运动停止后3至5秒内，按照先前建立的方法进行以下快速袖带阻断系列操作（一个系列＝一次充气＋一次放气）¹⁸:
   系列 #1 - 6：开启 5 秒/关闭 5 秒
   系列 #7 - 10：开启 7 秒/关闭 10 秒
   系列 #11 - 14：开启 10 秒/关闭 15 秒
   第15-18组：开启10秒/关闭20秒
8. 完成18后^th 充气/放气循环后，指导受试者休息，使组织饱和度恢复至初始基线水平。待该值稳定至少2分钟后，重复步骤2.4和2.5。
9. 计算骨骼肌氧化能力
   1. 计算 StO₂ 变化的斜率₂对于每次单独的18次袖带阻断，形成如图所示的单指数恢复点 图 2C.
   2. 将2.7中计算得到的数据拟合到以下单指数曲线^18,19,26
      y = 终点 - Δx e^-kt
      注意：“y”是相对肌肉耗氧速率（mV̇O₂）₂) 在袖带充气期间，“End”代表 mV̇O₂ 运动停止后立即；delta（“Δ”）表示 mV̇O 的变化量₂ 从静息状态到运动结束；k“k”是拟合速率常数；“t”是时间。Tau 的计算公式为 1/k。

3. 反应性充血

注：图中显示了用于测量反应性充血的实验流程的代表性数据轨迹 图3.

1. 受试者仰卧位，按上述方法连接仪器（仪器设备），指导受试者尽可能保持静止平躺。
2. 当受试者达到稳定的静息状态后，继续记录至少1分钟的基础数据，然后迅速将上臂血压袖带充气至高于收缩压30 mmHg的超收缩压水平。
3. 在5分钟时间点，快速放空袖带，同时记录充血反应。
4. 继续记录至少3分钟，以捕捉受试者的恢复过程。
5. 计算反应性充血
   注意：计算得到的近红外光谱（NIRS）参数如图3所示。
   1. 计算基线 StO₂ 作为平均 StO₂ 在动脉袖带阻断开始前超过1整分钟。
   2. 测定静息骨骼肌代谢率为脱氧速率（即， 平均斜率）在袖带阻塞期间（定义为斜率1）^27,28.
   3. 按如下方法计算反应性充血：
      a) 袖带释放后平均上升支即， 再灌注速率（定义为斜率2），从袖带释放时刻开始，通过反弹曲线的线性上升阶段计算得出；
      b) 最高的 StO₂ 袖带释放后达到的数值（记为 StO_2最大);
      c) 反应性充血曲线下面积（AUC）；根据袖带释放后至袖带阻塞后1分钟、2分钟和3分钟的时间段计算（分别为AUC 1分钟、AUC 2分钟和AUC 3分钟）；以及
      d) 充血储备，计算为 StO₂ 高于基线水平，并以百分比（%）变化表示。该值的计算方法为：缺血后充血期间达到的最高饱和度减去步骤 3.5.1 中计算的平均饱和度（见上文）。
      注意：基线数据的显著差异将极大影响充血储备的解读。

4. 功能性交感神经抑制

注：图中所示为测量功能性交感神经抑制的实验流程的代表性数据轨迹 图4.

1. 按照上述说明（仪器连接）对受试者进行仪器连接。
2. 确保下体负压舱（LBNP）密封严密，无漏气。
3. 受试者平卧静息状态下，采集3分钟基线数据。
4. 在第3分钟时，启动真空泵。调节真空度，使LBNP舱内压力维持在-20至-30 mmHg之间。持续运行真空泵2分钟，同时监测受试者的反应。
5. 在第5分钟时，关闭真空泵，让受试者继续静息3分钟。
6. 在第8分钟时，启动语音提示，指导受试者进行节律性握力练习（20%最大自主收缩力，MVC）。
7. 确认受试者在每次握力阶段全程保持挤压动作，并在每次重复之间完全放松。监测其力量输出，确保每次握力均达到20% MVC。持续进行练习至第11分钟。
8. 在第11分钟时，重新启动真空泵，同时鼓励受试者继续进行节律性握力练习。使真空泵持续运行至第13分钟，随后关闭。
9. 让受试者以20% MVC继续进行节律性握力练习2分钟。运动结束后，让受试者安静休息并保持静卧。
10. 功能性交感抑制的计算
    1. 将LBNP期间氧合血红蛋白的变化值相对于总可变信号（TLS）进行归一化处理，TLS由5分钟袖带阻塞期间测定：
       
       
    2. 将每个事件的数值计算为该事件最后20分钟的平均值。
    3. 计算运动引起的氧合血红蛋白减少的抑制程度：
       

结果

骨骼肌氧化能力

图2展示了基于近红外光谱（NIRS）评估骨骼肌氧化能力时典型受试者的反应。图A显示了在5分钟动脉袖带阻塞、手握力运动以及运动恢复期间进行间歇性动脉阻塞时的组织饱和度变化曲线。图B展示了恢复期间间歇性动脉阻塞时预期的组织去饱和/再饱和曲线。去饱和速率与肌肉耗氧速率成正比，并在图C中绘制了每次间歇性袖带阻塞期间的去饱和速率。计算得到的肌肉耗氧恢复数据随后拟合为单指数曲线，并由此得出恢复时间常数。采用相同方法，越来越多的研究已对健康与疾病状态下多种肌群的骨骼肌氧化能力进行了评估（表 1）。

反应性充血

讨论

本文所述方法可在一次临床或实验室就诊过程中，实现对反应性充血、神经血管耦合以及骨骼肌氧化能力的无创临床评估。

关键注意事项

尽管近红外光谱技术（NIRS）相对稳健且易于使用，但数据采集需要将光学探头精确放置在肌肉腹侧，并牢固固定以避免运动伪影，同时在光线较暗的环境中用黑色乙烯基布覆盖，以防止外界光线中的近红外成分造成干扰。此外，获取高质量数据在很大程度上依赖于测试者、受试者以及测试团队之间的清晰沟通。我们及其他研究者发现，若操作过程中给予适当的关注与谨慎，NIRS在单次研究访视内以及多次访视之间均具有高度可重复性。^10,11,24,29此外，本文报告的生理学结果变量（即， 骨骼肌氧化能力、反应性充血及神经...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双通道 OxiplexTS 近红外光谱仪	Iss Medical	101
NIRS 肌肉传感器	Iss Medical	201.2
E20 快速充气袖带系统	Hokanson	E20
AG101 气源装置	Hokanson	AG101
Smedley 手握式测力计（记录型）	Stolting	56380
Powerlab 16/35，16 通道记录仪	ADInstruments	PL3516
人体无创血压测量套件	ADInstruments	ML282-SM
Bio Amp 生物信号放大器	ADInstruments	FE132
Quad Bridge Amp 四通道桥式放大器	ADInstruments	FE224
Connex Spot 监护仪	Welch Allyn	71WX-B
Origin(Pro) 绘图软件	OrignPro	Pro
下半身负压舱	Physiology Research Instruments	standard unit