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方法文章

利用3'端cDNA快速扩增技术绘制癌症中的转录本图谱

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DOI：

10.3791/57318

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2018年3月28日

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy and Health Sciences, Butler University

本文内容

摘要

本文所述的两种不同的3'端cDNA快速扩增（3' RACE）方案利用两种不同的DNA聚合酶，通过从不同癌细胞系提取的RNA来定位包含开放阅读框（ORF）片段、终止密码子以及转录本完整3'非翻译区（3' UTR）的序列。

摘要

真核生物mRNA的成熟过程涉及3'端的形成，其中包括添加多聚腺苷酸尾（poly(A)尾）。为了定位基因的3'端，传统上常用的方法是3'端cDNA末端快速扩增技术（3' RACE）。3' RACE的实验方案需要在目标基因的3'非翻译区（3' UTR）内精心设计并选择嵌套引物。然而，通过少量修改，该方案可进一步覆盖整个3' UTR以及开放阅读框（ORF）内的序列，从而更全面地揭示ORF与3' UTR之间的关系。此外，该方法还能鉴定传统的3' RACE所能提供的多聚腺苷酸化信号（PAS）、切割位点及多聚腺苷酸化位点。扩展后的3' RACE能够检测异常的3' UTR结构，包括3' UTR内的基因融合事件，所获得的序列信息还可用于预测潜在的miRNA结合位点以及可能影响转录本稳定性的富含AU的不稳定元件。

引言

mRNA成熟过程中，3'端的形成是一个关键步骤，包括在多聚腺苷酸化信号序列（PAS）下游对前体mRNA进行切割，随后添加约250个非模板指导的腺嘌呤，形成多聚腺苷酸尾（poly(A)尾）1,2。多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）可结合到poly(A)尾上，保护mRNA转录本免遭降解，并促进翻译过程1。

目前估计，70%的人类基因具有多个多聚腺苷酸化位点（PAS），因此会发生可变多聚腺苷酸化，从而产生多个3'端3。因此，确定多聚(A)尾连接到3'非翻译区（UTR）的具体位置，以及识别任何特定转录本所使用的PAS，具有重要意义。下一代测序技术的出现，使得数千个基因的3' UTR及其PAS能够被同时鉴定。测序能力的提升也促使了生物信息学算法的发展，以分析涉及3'端可变多聚腺苷酸化的数据。对于从大规模测序数据中从头检测或验证PAS，进而绘制单个基因3'端图谱，3' RACE仍是首选方法4,5。3' RACE所获得的cDNA产物通常仅包含3' UTR的一部分，其中包括多聚(A)尾、切割位点、PAS以及PAS上游的序列。与需要设计并使用基因特异性正向和反向引物的PCR不同，3' RACE仅需要两个基因特异性的巢式正向引物。因此，PCR要求对被扩增基因的较大区域的核苷酸序列有更详细的了解4,6。由于3' RACE对所有多聚腺苷酸化的RNA转录本均使用相同的针对多聚(A)尾的反向引物，因此只需正向引物具备基因特异性，从而仅需了解mRNA中相对较小的区域即可。这使得序列尚未完全表征的区域也能被扩增4,7。这一优势使3' RACE不仅可用于确定基因的3'端，还可用于确定和表征构成3' UTR重要部分的PAS上游较大区域。通过将5' RACE与改良的3' RACE（包含更大比例的3' UTR及侧翼区域）相结合，可以实现从5'端到3'端对整个mRNA转录本进行完整测序或克隆8。

修改后的3' RACE技术应用实例是近期一种新型的鉴定 CCND1-MRCK 套细胞淋巴瘤细胞系及癌症患者中的融合基因转录本。3'非翻译区包含来自两者的序列 CCND1 和 MRCK 基因且对miRNA调控具有抗性9两个嵌套的 CCND1 特异性上游引物与紧邻其下游区域互补 CCND1 终止密码子。尽管全转录组测序结合特定的生物信息学工具可用于检测位于3'非翻译区（3' UTR）内的基因融合事件10许多实验室可能缺乏足够的资金资源或生物信息学专业知识来应用这一技术。因此，3' RACE 是一种替代方案 从头合成 涉及3'非翻译区的新型融合基因的鉴定与验证。鉴于已报道的融合基因数量及通读转录本数量急剧增加，3' RACE已成为表征基因序列的有力工具11,12此外，近期研究表明，3'非翻译区（3' UTR）内的不同序列以及3' UTR的长度均可影响mRNA转录本的稳定性、定位、可翻译性及功能13由于人们对转录组测序的兴趣日益增加，实验室中开发和使用的不同DNA聚合酶种类也随之增多。因此，有必要明确在3' RACE实验流程中可进行哪些类型的修改，以充分利用现有各种DNA聚合酶。

本研究报道了采用转录本ANKHD1内部的巢式引物以及 两种不同的DNA聚合酶，对ANKHD1转录本的整个3'非翻译区（3' UTR）、多聚腺苷酸化位点（PAS）及3'端切割位点进行定位的3' RACE技术改良方法。

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方案

在整个实验方案操作过程中，必须始终穿戴实验服、手套和护目镜。含有苯酚和异硫氰酸胍试剂的容器/管子只能在经过认证的通风橱内打开，并将苯酚废弃物丢弃至指定容器中。使用无DNA酶/RNA酶的无菌管、枪头和试剂。

1. 细胞培养

  1. 在含10%胎牛血清（FBS）和100 U/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养HeLa细胞系以及两种悬浮培养的套细胞淋巴瘤细胞系Granta-519和Jeko-1。按1:10比例传代，并使用颗粒计数器进行细胞计数14。
  2. 进行RNA提取时，将500,000个细胞接种至6孔板的每孔中（每孔2 mL培养基）。37 °C孵育24小时后，收集细胞中的RNA。

2. RNA 提取

  1. 收集细胞
    注意：除离心步骤外，所有操作均应在组织培养罩内进行，以保持无菌状态。
    1. 对于悬浮细胞（Jeko-1 和 Granta-519）：
      1. 将细胞（连同 2 mL 培养基）转移至 15 mL 离心管中，在 1,725 × g 条件下离心 5 分钟。吸除上清培养基，保留管底的细胞沉淀。
      2. 用 50 µL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）重悬细胞沉淀。向每份样品的 1.5 mL 微量离心管中加入 500 µL 单相酚和异硫氰酸胍试剂。充分混匀后室温（RT）静置 5 分钟，每隔 1 分钟颠倒混匀一次微量离心管。
    2. 对于贴壁细胞（HeLa）：
      1. 吸除每个孔中的细胞培养基。向每个孔中加入 1 mL PBS 洗去碎片。
      2. 去除 PBS，向每个孔中加入 500 µL 单相酚和异硫氰酸胍试剂。
      3. 室温下轻轻摇动孵育 5 分钟。转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  2. 细胞裂解
    1. 将酚和异硫氰酸胍细胞混合物在 -20 °C 冷冻 1 小时。
      注意：混合物可在 -20 °C 保存过夜或直至使用。
    2. 在冰上解冻酚和异硫氰酸胍细胞混合物。在 PCR 罩内向微量离心管中加入 100 µL 氯仿。涡旋振荡样品 10–15 秒，直至混合物呈粉红色且不透明。将样品在冰上（4 °C）孵育 15 分钟。
    3. 在 20,800 × g 和 4 °C 条件下离心 15 分钟。小心吸取上层无色水相（约 200 µL），转移至新的 1.5 mL 微量离心管中。
  3. RNA 沉淀
    1. 向每份样品中加入等体积的异丙醇。向每份样品中加入 1 µL 共沉淀剂（见材料表），作为 RNA 的载体并有助于在后续步骤中观察 RNA。在 -80 °C 孵育至少 4 小时。为获得最佳效果，建议在 -80 °C 过夜孵育。
    2. 将样品转移至预冷的离心机中，在 20,800 × g / 4 °C 条件下离心 35 分钟；RNA 将以管底的蓝色小点形式出现。小心吸除异丙醇。加入 500 µL 80% 乙醇，短暂涡旋 3 秒以重悬沉淀。
    3. 在 20,800 × g 条件下室温离心 5 分钟。彻底去除样品中的乙醇。让样品在空气中干燥约 10 分钟。用 35 µL 无 RNase 水重悬样品。置于 65 °C 金属浴中加热 5 分钟，确保 RNA 完全溶解，随后立即将离心管置于冰上。
    4. 使用分光光度计测定总 RNA 浓度，方法如前所述，但使用 1.5 µL RNA 样品代替 1 µL15。可选：取 1 µg 总 RNA 在 1% 琼脂糖凝胶上电泳，以评估 RNA 完整性。

3. DNase 处理

  1. RNA定量后，对总RNA进行DNA酶处理，以降解可能存在的基因组DNA。每个样品中，从无RNA酶的DNA酶试剂盒中加入以下试剂，在单独的微量离心管中配制成总体积为20 µL的反应体系：
    1. 将2 µL DNase 10X反应缓冲液与4.4 µg总RNA混合，加水至总体积14 µL。
    2. 加入2 µL无RNA酶的DNAse，在37 °C孵育30分钟，同时加入2 µL逆转录试剂盒中的RNase抑制剂。
    3. 加入2 µL终止液，并在70 °C加热块中加热10分钟，以灭活DNAse酶。
      注意：DNA酶处理为可选步骤。

4. cDNA 合成

最终反应体系体积为 50 µL 时：

  1. 最终反应体积为 50 µL 时：将 22 µL 经 DNase 处理的 RNA 转移至新离心管中，或向新离心管中加入 4 µg 总 RNA 并加水至总体积为 22 µL。加入 2 µL 来自 10 µM 引物溶液的 T7 寡核苷酸 dT25 引物。T7 寡核苷酸 dT25 引物的序列为 5'-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3'。
  2. 从反转录试剂盒中加入 2 µL RNase 抑制剂（20 U/µL）、8 µL 5x 反应缓冲液、4 µL 10 mM dNTPs 以及 2 µL 反转录酶（200 U/µL）。
    注意：设置一个不加反转录酶的反应作为阴性对照。
  3. 在 42 °C 下孵育 1 小时。直接转移至冰上。将离心管在 75 °C 下加热 5 分钟，然后放回冰上。

5. 融合基因转录本的引物搜索

  1. 引物设计
    1. 从 Ensemble 基因组浏览器下载 cDNA 序列（ENST00000360839.6/NM_017747），并在目标转录本（ANKHD1）的终止密码子上游的开放阅读框（ORF）内确定一个区域。将包含终止密码子上游序列的完整区域（最多 700 个核苷酸）复制并粘贴到引物设计软件的序列输入区域（<https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index>）。
    2. 选择“显示自定义设计”选项，并设置系统生成引物的数量为 10 条（返回结果数），其余参数均保持默认设置。
    3. 选择五条正向引物和两条不重叠的反向引物。订购引物后，用无 RNase/DNase 的水重悬，配制成终浓度为 10 µM 的溶液。有关 PCR 引物设计的一般原则详见其他文献16。
  2. 通过 PCR 筛选适用于后续 3' RACE 的潜在引物
    注意：为确定反应中最终使用的正向引物，需在 PCR 操作台中设置不同的正向与反向引物组合进行常规 PCR，以测试所设计的引物。
    1. 将 cDNA（2 µL）转移至新的 0.5 mL PCR 管中。加入 1 µL 正向引物和 1 µL 反向引物（来自 10 µM 引物溶液）。加入 8.5 µL 无核酸酶水，使总体积达到 12.5 µL。再加入 12.5 µL 的 2x PCR-to-Gel Master Mix。
    2. 采用以下 PCR 热循环条件：95 °C 预变性 2 min，随后进行 29 个循环（95 °C 变性 30 s，60 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 1 min），最后在 68 °C 延伸 7 min。
    3. PCR 结束后，将产物在含溴化乙锭的 1% 琼脂糖凝胶上电泳。电泳操作细节如前所述，略有修改17。
      1. 在 250 mL 锥形瓶中，将 1 g 琼脂糖溶于 100 mL Tris-乙酸（TAE）缓冲液中，微波炉加热至完全溶解。
      2. 冷却约 1 min 后，在通风橱中加入 7.5 µL 溴化乙锭溶液（10 mg/mL 储存液），轻轻旋转混匀，倒入水平凝胶装置中。在通风橱中室温静置至少 30 min，使凝胶充分凝固。
      3. 用 1x TAE 缓冲液覆盖凝胶，取 10 µL PCR 产物与 3–5 µL DNA 分子量标记物一同上样。在 175 V 条件下电泳 10 min，使用凝胶成像系统观察结果；若需进一步分离条带，可继续电泳 5–10 min。
  3. 3' RACE 嵌套引物的选择
    1. 分析 PCR 琼脂糖凝胶结果，选择产生清晰、强且单一扩增条带的引物组合。在第一轮 PCR 中使用最靠近 5' 端的引物（ANKHD15'-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3'）与 T7 寡聚 dT25 引物。
    2. 选择位于第一轮引物下游的嵌套引物（ANKHD1 5'-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3'），在第二轮 PCR 中与 T7 引物（5'-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3'）配对使用。

6. 使用两种不同酶优化3' RACE以绘制3'非翻译区

注意：用于 PCR 的 DNA 聚合酶种类日益增多；因此，我们希望确定一套标准条件，即使在使用不同酶进行 3' RACE PCR 反应时也可通用。任何转录本的反向引物保持不变；唯一的变化在于针对目标转录本的嵌套正向引物。

  1. 方案1：使用来自Pyrococcus furiosus (Pfu)的改良DNA聚合酶进行3' RACE
    1. 第一轮PCR
      1. 将1 µL cDNA转移至PCR管中，加入5 µL 10x Pfu反应缓冲液。加入1 µL第一轮嵌套正向引物、1 µL T7 oligodT25引物和1 µL dNTPs（来自10 mM溶液）。
      2. 加入40 µL水，使总体积达到49 µL。加入1 µL Pfu DNA聚合酶，充分混匀。按照表1中的PCR程序运行PCR反应。
    2. 第二轮PCR
      1. 将第一轮PCR产物2 µL转移至新的PCR管中，加入5 µL 10x PfuUltra II反应缓冲液。加入1 µL第二轮嵌套PCR引物、1 µL T7引物和1 µL dNTPs（10 mM溶液）。
      2. 加入39 µL水，使总体积达到49 µL。加入1 µL Pfu DNA聚合酶。使用与第一轮PCR相同的PCR程序（表1）进行PCR反应。
  2. 方案2：使用包含DNA结合结构域与类似Pyrococcus的校对型DNA聚合酶融合而成的嵌合DNA聚合酶PCR预混液进行3' RACE
    1. 第一轮PCR
      1. 将1 µL cDNA转移至PCR管中。加入1 µL第一轮嵌套正向引物和1 µL T7 oligodT25引物。加入22 µL水，使总体积达到25 µL。
      2. 加入25 µL 2x PCR预混液，充分混匀。采用表2中描述的PCR扩增条件进行反应。
    2. 第二轮PCR
      1. 将第一轮PCR产物2 µL转移至新的PCR管中。加入1 µL第二轮嵌套PCR引物和1 µL T7反向引物。
      2. 加入22 µL水，使总体积达到25 µL。加入25 µL 2X PCR预混液。使用与第一轮PCR相同的PCR程序（表2）进行PCR反应。

7. 验证3' RACE的第二次PCR产物。

  1. 取5 - 10 µL第二次PCR产物（若转录本表达量较高，也可同时取第一次PCR的产物），进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶的制备及电泳操作步骤同前文所述（步骤5.2.3.1至5.2.3.3）。使用成像仪观察结果。

8. 产物纯化与测序

  1. 根据制造商的说明书，使用凝胶和PCR片段DNA纯化系统对第二次PCR的凝胶PCR产物进行纯化。
  2. 进行Sanger测序（或者，将经凝胶纯化的PCR产物样品及相应的测序引物送至测序实验室）。Sanger测序完成后分析测序数据。
  3. 下载序列分析软件（参见材料表），并将测序迹文件导入该软件。利用单个PURE Base QVs（质量值）获取碱基判读信息18。下载高质量迹线的色谱图以供查看。
    可选步骤：可使用合适的克隆试剂盒对凝胶纯化的产物进行克隆，并将获得的克隆送交Sanger测序。

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结果

嵌套正向引物搜索：

琼脂糖凝胶来自 图1 显示两条不同的PCR凝胶条带（泳道1和2），它们使用相同的正向引物但不同的反向引物。泳道3具有一条独特的PCR产物，其正向和反向引物均不同。用于基于PCR反应的理想引物应是能够产生单一明确PCR产物的引物（泳道3）。泳道1和2中使用的正向引物产生的条带最强，并得到最大的PCR产物（预期结果），因此被选为第一轮正向引物。在3' RACE的第二轮PCR反应中，第二轮巢式引物即为泳道3中的正向引物。

3' RACE 中使用的不同 DNA 聚合酶产生相似的结果：

两种不同的DNA聚合酶在3' RAC...

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讨论

尽管高通量并行测序技术已经出现，但在单基因水平上，3' RACE 仍然是鉴定多聚腺苷酸尾（poly(A) tail）附近多聚腺苷酸化位点（PAS）及其相邻核苷酸序列最简便且最经济的方法。本文所述的改进方法拓展了 3' RACE 的应用，使其能够扩增并定位包含 ANKHD1 mRNA 转录本部分开放阅读框（ORF）、终止密码子以及完整 3' 非翻译区（3' UTR）的序列。3' RACE 的一个主要优势在于，只需进行少量简单优化，即可将 3' RACE 产物克隆至其他载体中，从而便于后续对 3' UTR 功能进行深入研究，包括 miRNA 靶向分析、稳定性检测以及其他机制性功能实验。通过在巢式引物序列中引入限制性内切酶位点，即可实现这一目的9,10。此外，也可对实验设计进行调整，使克隆产物仅包含 3' UTR 序列而不含任何 ORF 区域，以专门用于 3' UTR 功能分析5。

3' RACE 成功的关...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Bettine Gibbs提供的技术帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HeLa 细胞ATCCCCL-2宫颈癌细胞系。
Jeko-1 细胞ATCCCRL-3006套细胞淋巴瘤细胞系。
Granta-519 细胞DSMZACC-342套细胞淋巴瘤细胞系。
胎牛血清Sigma AldrichF6178用于细胞培养的胎牛血清。
青霉素/链霉素ThermoFisherScientific15140122抗生素和抗真菌剂。
GlycoBlueAmbionAM9545共沉淀剂。
DMEMThermoFisherScientific10569044含 GlutaMAX 的 Gibco 品牌细胞培养基。
无核酸酶水ThermoFisherScientificAM9938Ambion 品牌无 DNase 和 RNase 水（非 DEPC 处理）。
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液Corning21-0301X PBS。
氯仿Sigma  AldrichC7559-5VL
2-丙醇Sigma AldrichI9516
试剂级乙醇Sigma Aldrich793175乙醇
溴化乙锭溶液Sigma AldrichE1510
TRIzol 试剂ThermoFisherScientific15596026单相酚和异硫氰酸胍试剂。
2X Extender PCR-to-Gel 预混液AmrescoN867含有上样染料的 2X PCR-to-Gel 预混液 ，用于常规快速 PCR 检测和引物筛选。
10 mM dNTPAmrescoN557
RQ1 无 RNase DNasePromegaM6101DNase 处理试剂盒。
凝胶上样染料橙色（6X）New England BioLabsB7022S
含 HF 缓冲液的 2X Phusion 高保真 PCR 预混液ThermoFisherScientificF531S含有嵌合 DNA 聚合酶的 2X PCR 预混液，该聚合酶由一个 DNA 结合结构域与类似 Pyrococcus 的校对聚合酶融合而成，并包含其他试剂。
PfuUltra II Fusion HS DNA 聚合酶Agilent Technologies600670来自激烈火球菌（Pyrococcus furiosus, Pfu）的修饰型 DNA 聚合酶。
RevertAid RT 反转录试剂盒Thermo FischerK1691用于  将 mRNA 反转录为  cDNA 合成。试剂盒包含  Ribolock RNase 抑制剂、RevertAid M-MuLV 反转录酶以及文中列出的其他试剂。
Pefect 1Kb DNA 标准分子量标记5 Prime2500360DNA 分子量标准。
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage IIIAlpha Innotech用于观察溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。
低分子量 DNA 标准New England BioLabsN3233LDNA 分子量标准。
涡旋混合器MidSciVM-3200
小型离心机MidSciC1008-R
干浴器MidSciDB-D1
NanoDrop 2000CThermoFisherScientificND-2000C分光光度计。
Wide Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统BioRad1704469电泳设备——用于制备凝胶的装置
PowerPac Basic 电源BioRad1645050凝胶电泳用电源。
琼脂糖Dot ScientificAGLE-500
Mastercycler GradientEppendorf950000015PCR 扩增仪。
离心机Eppendorf5810 R
离心机Eppendorf5430R
Wizard SV 凝胶和 PCR 片段 DNA 纯化系统PromegaA9281
Zero Blunt TOPO PCR 克隆试剂盒，含 One Shot  TOP10 化学感受态 E. coli 细胞ThermoFisherScientificK280020
MyPCR 样品制备站 MystaireMidSciMY-PCR24专用于 PCR 实验的生物安全柜。
Hamilton SafeAire II 通风橱ThermoFisherScientific通风橱。
Beckman Coulter Z1 颗粒 计数器Beckman Coulter6605698颗粒计数器。用于 RNA 提取前的细胞计数 。
Applied Biosystems Sequence Scanner 软件 v2.0Applied Biosystems (通过 ThermoFisherScientific)用于分析 Sanger 测序数据的软件。

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