3 ' 快速扩增 CDNA 末端, 以图记录癌症

Summary

在这里描述的两种不同的 3 ' 快速扩增的 cDNA 结束 (3 ' 种族) 协议使用两种不同的 DNA 聚合酶来映射序列, 包括开放阅读框架 (ORF) 的一部分, 停止密码子, 和整个 3 ' UTR 的成绩单使用 RNA从不同的癌细胞系获得的。

Abstract

真核基因的成熟涉及 3 ' 端形成, 这涉及到增加一个聚 (a) 尾。为了图 3 ' 末端的基因, 传统的选择方法是 3 ' 快速扩增的 cDNA 末端 (3 ' 种族)。3 ' 种族协议需要仔细设计和选择嵌套底漆在 3 ' 未翻译的区域 (3 ' UTR) 的目标基因感兴趣。然而, 通过一些修改, 该协议可用于包括整个 3 ' UTR 和序列在开放阅读框架 (ORF), 提供了一个更全面的图片与 3 ' UTR 之间的关系。这是除了识别的 polyadenylation 信号 (PAS), 以及分裂和 polyadenylation 网站提供的常规 3 ' 种族。扩展 3 ' 种族能发现异常的 3 ' UTRs, 包括基因融合在 3 ' UTR 之内, 并且序列信息可以被使用预测潜在的 miRNA 结合的站点和不稳定的元素可能影响成绩单的稳定。

Introduction

3 ' 末端的形成是 mrna 成熟的一个关键步骤, 它包括 PAS 的前 mRNA 下游的分裂, 然后加上 250 untemplated adenines, 组成了聚 (a) 尾^1,2。聚 (a) 结合蛋白 (PABP) 绑定到聚 (a) 尾, 这保护 mRNA 转录不退化, 并促进翻译¹。

目前的估计表明, 70% 的人类基因有多个通过, 从而接受替代的 polyadenylation, 导致 3 ' 末端³。因此, 重要的是要确定多 (A) 尾附加到 3 ' UTR 的其余部分, 并确定任何给定的成绩单使用的考绩制度。下一代测序的出现导致了同时识别 3 ' UTRs 和成千上万基因的通过。这种测序能力的提高需要开发生物信息学算法来分析涉及 3 ' 端的替代 polyadenylation 的数据。对于 "从头" 检测或验证 PAS, 从而从大型序列数据中映射单个基因的 3 "结束", 3 ' 种族仍然是选择^4,5的方法。在 3 ' 种族的 cDNA 产品中包含的序列通常只包括 3 ' UTR 的一部分, 其中包含了聚 (a) 尾、解裂部位、pas 和 pas 上游的序列。不像 PCR, 这需要设计和使用的基因特异正向和反向引物, 3 ' 种族只需要两个基因特定的嵌套前引物。因此, PCR 要求更详细地了解被放大的基因的大区域的核苷酸序列^4,6。由于 3 ' 种族使用相同的反向底漆为所有 polyadenylated RNA 记录的聚 (A) 尾, 只有向前引物需要基因特异性, 因此, 只需要知识的 mRNA 的一个显着较小的区域。这使序列未完全特征化的区域放大^4、7。这使得 3 ' 种族不仅用于确定一个基因的 3 ' 末端, 而且还确定和描述在 PAS 上游的大区域, 形成了 3 ' UTR 的重要部分。通过将 5 ' 种族与修改后的 3 ' 种族相结合, 其中包括 3 ' UTR 和侧翼区域的较大部分, 可以完全序列化或克隆从 5 ' 端到其 3 ' 端⁸的整个 mRNA 记录。

这种应用的修改 3 ' 种族的例子是最近鉴定的新的CCND1-MRCK融合基因转录从地幔细胞淋巴瘤细胞系和癌症患者。3 ' UTR 包括来自CCND1和MRCK基因的序列, 并被顽固地 miRNA 调节⁹。两个嵌套CCND1特定正向引物与CCND1停止密码子的相邻和下游区域互补。虽然整个转录测序连同特定的生物信息学工具可以用于检测 3 ' UTR 10 中的基因融合, 但许多实验室可能缺乏利用这项技术的财力资源或生物信息学专业知识.因此, 3 ' 种族是一个替代的诺新识别和验证的新型融合基因涉及 3 ' UTR。考虑到已报道的融合基因的数量急剧增加, 以及通过成绩单阅读, 3 ' 种族已经成为一个强大的工具, 以表征基因序列^11,12。此外, 最近的研究表明, 在 3 ' UTR 和 3 ' UTR 的长度不同的序列可能影响 mRNA 转录稳定性, 本地化, 可译性和功能¹³。部分原因是对绘制转录的兴趣增加, 在实验室中开发的不同 DNA 聚合酶的数量有所增加。重要的是要确定哪些类型的修改可以对 3 ' 种族协议, 以利用现有的 DNA 聚合酶的曲目。

此工作报告通过使用ANKHD1中ANKHD1部分中的嵌套底漆和两个不同的 DNA 聚合酶, 调整 3 ' 种族, 以映射整个 3 ' UTR、PAS 和 3 ' 末端解切站点成绩单。

Protocol

在执行本协议中的所有步骤时, 始终佩戴实验室大衣、手套和安全眼镜。确保含有苯酚和异硫氰酸胍试剂的容器/管只在经认证的罩盖中打开, 并在指定容器中处理苯酚废料。使用 DNAse/RNAse 无菌管, 提示和试剂。

1. 细胞培养

1. 生长的 HeLa 细胞线和两个悬浮地幔细胞淋巴瘤细胞系, Granta-519 和 Jeko-1, 在 DMEM 含有10% 血清和 100 U/毫升青霉素/链霉素在一个湿润的孵化器与 5% CO₂在37°c。使用粒子计数器¹⁴稀释单元格1:10 并计数。
2. 用于 RNA 提取, 板50万细胞/井在6井板 (每井2毫升介质)。孵化24小时后, 从细胞中收集 RNA。

2. RNA 提取

1. 收获细胞
   注: 除离心步骤外, 在组织培养罩中执行所有列出的步骤以保持不孕。
   1. 对于悬浮细胞 (Jeko-1 和 Granta-519):
      1. 将细胞 (连同2毫升介质) 转移到15毫升管, 离心机在 1725 x g 处进行5分钟的抽吸培养基并将细胞颗粒留在管的底部。
      2. 并用重悬50µL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中的细胞颗粒。在1.5 毫升离心管中添加500µL 单相苯酚和异硫氰酸胍试剂到每个样品中。混合好, 并在室温下 (RT) 离开5分钟, 同时反转离心管每1分钟。
   2. 对于黏附细胞 (HeLa):
      1. 从每个井中吸入细胞培养介质。每井加1毫升的 PBS, 以洗涤残骸。
      2. 去除 PBS, 并在每个井中加入500µL 单相苯酚和异硫氰酸胍试剂。
      3. 在 RT 中孵育5分钟, 轻柔摇摆。转到1.5 毫升离心管。
2. 细胞裂解
   1. 将苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物冷冻-20 摄氏度, 1 小时。
      注: 混合可在一夜之间留在-20 摄氏度或直到需要。
   2. 在冰上解冻苯酚和异硫氰酸胍细胞混合物。在 PCR 罩中添加100µL 氯仿到离心管。涡流样品 10-十五年代, 直到混合物是粉红色和不透明的。在冰上孵化样品 (摄氏4摄氏度), 15 分钟。
   3. 离心样品为15分钟在 20800 x g 和4°c。小心移除上无色的水相 (~ 200 µL) 和转移到一个新的1.5 毫升离心管。
3. RNA 降雨雪
   1. 在每个样品中加入相同数量的异丙醇。添加1µL 的 coprecipitant (参见材料表), 以作为 rna 的载体, 并帮助在后续步骤中可视化 rna。将样品孵育-80 摄氏度, 至少4小时。为了取得最佳效果, 在-80 摄氏度的夜间孵化。
   2. 将样品转移到冷却离心机上。离心机为35分钟, 在 20800 x 克/4 °c;RNA 会出现在管子底部的蓝色斑点上。小心地从样品中取出异丙醇。添加500µL 80% 乙醇和并用重悬颗粒由简要涡流 3 s。
   3. 离心样品在 20800 x g 在 RT 5 分钟. 从样品中取出所有的乙醇。让样品空气干燥约10分钟并用重悬样品在35µL 的 RNAse 无水。放置在热块 (65 °c) 为5分钟, 以确保 RNA 完全在溶液中, 并立即将管放在冰上。
   4. 使用以前描述的分光光度计确定总 RNA 的浓度, 除非使用 RNA 样本的1.5 µL, 而不是1µL¹⁵。可以选择在1% 琼脂糖凝胶上运行1µg 的总 rna, 以确定 rna 的完整性。

3. DNase 治疗

1. 在对 rna 进行量化后, 对总 rna 进行 DNAse 处理, 以降解任何基因组 DNA。对于每个样品, 添加以下试剂从无 RNAse DNAse 试剂盒, 使20µL 总反应混合在一个单独的离心管:
   1. 混合2µL 的 DNase 10X 反应缓冲器与4.4 µg 的总 RNA。带水共14µL。
   2. 添加2µL 的无 RNase DNAse。在2µL RNase 抑制剂 (从反向转录试剂盒) 存在的情况下, 在37摄氏度孵育30分钟。
   3. 添加2µL 的停止溶液和热量在一个热量块10分钟70°c, 以使 DNAse 酶失效。
      注: DNAse 治疗是可选的。

4. cDNA 合成

为最后反应容量50µL:

1. 对于最终的反应体积为50µL: 转移22µL 的 DNase 处理的 rna 到一个新的管, 或转移4µg 的总 RNA 与增加的水到总容量22µL 到一个新的管子。从10µM 底漆溶液中添加2µL T7 寡核苷酸₂₅底漆。T7 寡核苷酸₂₅底漆的序列为 5 '-GCCGGTAATACGACTCACTATAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 '。
2. 从反向转录套件添加2µL 的 RNase 抑制剂 (20 U/µL), 8 µL 的5x 反应缓冲器, 4 µL 10 毫米 dNTPs, 和2µL 的逆转录酶 (200 U/µL)。
   注意: 建立一个没有反向逆转录酶的反应作为一个阴性控制。
3. 孵育在42°c 1 小时直接转移到冰。把管子加热75摄氏度5分钟, 然后将管子放在冰上。

5. 融合基因转录的底漆搜索

1. 底漆设计
   1. 从集成基因组浏览器 (ENST00000360839.6/NM_017747) 下载 cDNA 序列, 并在停止密码器上游的目标记录 (ANKHD1) 的 ORF 中标识一个区域。复制并粘贴整个区域 (最多700核苷酸), 其中包含停止密码子的上游序列进入底漆设计软件 (< https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index >) 的序列输入区域。
   2. 选择 "显示自定义设计" 选项, 然后选择 "10" 以确定系统应生成的引物数 (返回结果), 并将所有其他参数设置为默认值。
   3. 选择五向前底漆和两个不重叠的反向底漆。命令引物和重建与 RNAse/DNAse 水的最终浓度为10µM。有关 PCR 的一般底漆设计的更多详细信息将在其他¹⁶中介绍。
2. PCR 识别潜在引物用于随后的 3 ' 种族
   注: 为了确定在反应中使用的最终正向底漆, 通过在 pcr 罩中设置不同的正向和反向引物组合, 对所设计的底漆进行测试。
   1. 将 cDNA (2 µL) 转移到新鲜的0.5 毫升 PCR 管。添加1µL 的前底漆和1µL 的反向底漆 (从10毫米底漆溶液)。通过添加8.5 µL 的核酸酶水, 使12.5 µL。添加12.5 µL 的 2x PCR 到凝胶主混合。
   2. 使用以下 PCR 热循环条件:95 °c 为2分钟跟随29个周期95°c 为三十年代, 60 °c 三十年代和72°c 为 1 min. 设置最后周期在68°c 为7分钟。
   3. PCR 后, 运行的产品在1% 琼脂糖凝胶染色的溴溴。电泳的详细信息如前所述, 有一些修改¹⁷。
      1. 在250毫升的烧瓶中, 将1克琼脂糖溶于100毫升的三醋酸 (泰) 缓冲器中。用微波炉煮。
      2. 离开冷却1分钟, 并添加7.5 µL 的溴溴化溶液 (10 毫克/毫升股票) 在一个通风罩。将烧瓶旋转, 倒入卧式凝胶装置, 搅拌均匀。在通风罩的 RT 中留出至少30分钟, 使凝胶凝固。
      3. 用1x 泰式缓冲液盖住凝胶, 将 PCR 产物的10µL 加在琼脂糖凝胶上, µL 3-5 的 DNA 分子量阶梯。运行在 175 V 10 分钟. 使用成像仪可视化产品, 如果需要进一步分离产品, 则运行凝胶以增加 5-10 分钟。
3. 3 ' 种族的嵌套引物选择
   1. 分析 pcr 琼脂糖凝胶的结果, 选择具有独特、强、单一 PCR 波段的引物。使用 5 '-最底漆 (ANKHD15 '-CCTTCCCAGCGAGTTTCTAC-3 ') 连同 T7 oligodT₂₅底漆在第一次 PCR 运行。
   2. 选择位于第一个底漆下游的嵌套底漆 (ANKHD1 5 '-CGTTGGACACAGTGGAATCT-3 '), 并在第二套 PCR 反应中使用 T7 底漆 (5 '-GGCCTAATACGACTCACTATAG-3 ')。

6. 利用两种不同的酶优化 3 ' 种族来映射 3 ' UTR

注: 用于 PCR 的 DNA 聚合酶的多样性有所增加;因此, 我们想确定的标准条件, 可以应用, 即使在使用不同的酶 3 ' 种族 PCR 反应。任何成绩单的反向引物保持不变;唯一的更改在嵌套的向前引物中, 特定于目标记录。

1. 协议 1: 3 ' 种族使用改进的脱氧核糖核酸聚合酶从Pyrococcus furiosus (Pfu)
   1. 第一 PCR
      1. 将1µL 的 cDNA 转移到 PCR 管, 并添加5µL 10x Pfu反应缓冲器。添加1µL 的第一个嵌套正向底漆, 1 µL 的 T7 oligodT₂₅底漆, µL 1 dNTPs (从 10 mM 解决方案)。
      2. 增加40µL 的水, 使49µL 总体积。添加1µL 的Pfu DNA 聚合酶并混合良好。在表 1中使用 pcr 配置文件运行 pcr。
   2. 二次 PCR
      1. 将2µL 的产品从第一 pcr 转化为新的 pcr 管, 并与5µL 10x Pfu超 II 反应缓冲器混合使用。添加1µL 的第二套 PCR 底漆, 1 µL 的 T7 底漆, 1 µL dNTPs (10 毫米溶液)。
      2. 增加39µL 的水, 使µL 总反应量达到49。添加1µL 的Pfu DNA 聚合酶。使用与第一个 pcr 设置相同的 pcr 配置文件 (表 1) 运行 pcr。
2. 协议 2: 3 ' 种族使用嵌合体 dna 聚合酶组成的 dna 结合域融合到Pyrococcus类校对聚合酶 PCR 主混合
   1. 第一 PCR
      1. 将1µL 的 cDNA 转移到 PCR 管上。添加1µL 的第一个嵌套正向底漆和1µL 的 T7 oligodT₂₅底漆。增加22µL 的水, 使25µL。
      2. 添加25µL 的 2x PCR 大师混合和混合良好。使用表 2中描述的 PCR 循环条件。
   2. 二次 PCR
      1. 将2µL 的产品从第一 pcr 转到新的 pcr 管。添加1µL 的第二嵌套 PCR 底漆连同1µL 的 T7 反向底漆。
      2. 增加22µL 的水, 使25µL。添加25µL 的 2X PCR 主组合。使用与第一个 pcr 设置相同的 pcr 配置文件 (表 2) 运行 pcr。

7. 验证第二次 PCR 产品的 3 ' 种族。

1. 采取 5-10 µL 的第二个 PCR 产品 (以及产品从第一轮 PCRs, 如果记录是丰富的表达) 和运行在琼脂糖凝胶。设置凝胶并运行以前描述的电泳 (步骤5.2.3.1 到 5.2.3.3)。在成像仪上可视化结果。

8. 产品提纯和测序

1. 根据制造商的协议, 用凝胶和 PCR 片段 DNA 清理系统从二次 pcr 中纯化凝胶 pcr 产物。
2. 执行桑格测序 (或者, 将凝胶纯化的 PCR 产品样品和适当的测序底漆发送到测序实验室)。对测序数据进行分析。
3. 下载序列分析软件 (请参阅材料表) 并将跟踪文件导入软件中。使用单个纯基 QVs (质量值) 获取基本调用信息¹⁸。下载的色谱与高品质的痕迹, 以供观赏。
   可选: 可使用适当的克隆试剂盒克隆纯化的产品, 并为桑格测序发送独立克隆。

Results

嵌套正向底漆搜索:

琼脂糖凝胶来自图 1显示两种不同的 PCR 凝胶产品 (车道1和 2), 使用相同的正向底漆, 但不同的反向底漆。3车道有一个独特的 PCR 产品, 并有一个明显的向前和反向底漆。用于 pcr 反应的理想引物是那些给出一个独特的 pcr 产品 (车道 3)。在1和2车道上使用的正向底漆给出了最强的波段, 并给出了最大的 PCR 产品 (预期), 并被用作第一前沿底漆。第二套 3 ' 种族 PCR 反应的巢式底漆是3车道的正向底漆。

不同的 DNA 聚合酶用于 3 ' 种族产生相似的结果:

两种不同的 DNA 聚合...

Discussion

尽管大规模并行测序技术的出现, 在基因的基础上, 3 ' 种族仍然是最简单和最经济的方法, 以确定的 PAS 和核苷酸相邻的聚 (a) 尾。这里描述的适应扩展使用 3 ' 种族放大和地图序列包括部分的 ORF, 停止密码子, 和整个 3 ' UTR 的ANKHD1 mRNA 转录。3 ' 种族的一个主要优势是, 有几个小的适应, 从 3 ' 种族的产品可以克隆成其他载体, 以促进下游审讯 3 ' UTR 功能, 包括 miRNA 靶点, 稳定性检测以及其他机械化验。这可以通过在嵌套底漆序列中包含限制酶站点^9、10来完成。可以进行调整, 只包括 3 ' UTR 没有任何序列从 ORF 克隆 3 ' UTR 功能化验⁵。

3 ' 赛跑成功的一个主要决定因素是开发嵌套的引物, 目标是感兴趣的基因。推荐 Ensembl 基因组浏览器中的 cDNA 序列, 以最好的识别无多态性的区域, 以发展最佳引物。理想的情...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HeLa 细胞	ATCC	CCL-2	宫颈癌细胞系。
Jeko-1 细胞	ATCC	CRL-3006	套细胞淋巴瘤细胞系。
Granta-519 细胞	DSMZ	ACC-342	套细胞淋巴瘤细胞系。
胎牛血清	Sigma Aldrich	F6178	用于细胞培养的胎牛血清。
青霉素/链霉素	ThermoFisherScientific	15140122	抗生素和抗真菌药。
GlycoBlue	Ambion	AM9545	共沉淀剂。
DMEM	ThermoFisherScientific	10569044	Gibco 品牌细胞培养基与 GlutaMAX。
无核酸酶 - 无	ThermoFisherScientific	AM9938	Ambion DNase 和 RNAse 水（未经 DEPC 处理）。
杜尔贝科s 磷酸盐缓冲溶液	Corning	21-030	1X PBS。
氯仿	Sigma Aldrich	C7559-5VL
2-丙醇	Sigma Aldrich	I9516
试剂 酒精	Sigma Aldrich	793175	乙醇
化乙锭溶液	Sigma Aldrich	E1510
TRIzol 试剂	ThermoFisherScientific	15596026	单相苯酚和异硫氰酸胍试剂。
2X 扩展 PCR 至凝胶预混液	Amresco	N867	2X PCR 至凝胶预混液  含有用于常规快速 PCR 检测和引物搜索的上样染料。
10 mM dNTP	Amresco	N557
RQ1 无 RNase DNase	Promega	M6101	Dnase 处理试剂盒。
凝胶上样染料 橙色 （6X）	New England BioLabs	B7022S
2X Phusion 高保真 PCR 预混液，含 HF 缓冲液	ThermoFisherScientific	F531S	2X PCR 预混液，含有嵌合 DNA 聚合酶，该聚合酶由融合至类热球菌校正聚合酶和其他试剂的 DNA 结合结构域组成。
PfuUltra II 融合 HS DNA 聚合酶	Agilent Technologies	600670	来自呋嗡热球菌 （Pfu） 的修饰 DNA 聚合酶。
RevertAid RT逆转录试剂盒	Thermo Fischer	K1691	用于将mRNA逆转录成cDNA合成。套件包括 核糖核酸酶抑制剂、RevertAid M-MuLV 逆转录酶和手稿中列出的其他试剂。
完美大小 1Kb 分子量标准	5 Prime	2500360	分子量 DNA 分子量标准。
Alpha Innotech FluorChem Q MultiImage III	Alpha Innotech		用于可视化溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶。
低分子量分子量标准	New England BioLabs	N3233L	分子量 DNA 分子量标准品。
涡旋混合器	MidSci	VM-3200
迷你离心机	MidSci	C1008-R
干浴	MidSci	DB-D1
NanoDrop 2000C	ThermoFisherScientific	ND-2000C	分光光度计。
宽 Mini-Sub Cell GT 水平电泳系统	BioRad	1704469	电泳设备-设置凝胶
PowerPac 基本电源	BioRad	1645050	用于凝胶电泳的电源。
琼脂糖	Dot Scientific	AGLE-500
Mastercycler 梯度	Eppendorf	950000015	PCR 热循环仪。
Centrifuge	Eppendorf	5810 R
离心	Eppendorf	5430R
Wizard SV 凝胶和 PCR 片段 DNA 纯化系统	Promega	A9281
零平末端 TOPO PCR 克隆试剂盒，一次性使用 TOP10 化学感受态大肠杆菌细胞	ThermoFisherScientific	K280020
MyPCR 制备站 Mystaire	MidSci	MY-PCR24	罩，专用于 PCR 工作。
Hamilton SafeAire II 通风柜	ThermoFisherScientific		通风柜。
贝克曼库尔特 Z1 颗粒物 计数器	Beckman Coulter	6605698	粒子计数器。用于电镀前细胞计数 用于 RNA 提取。
Applied Biosystems 序列扫描仪软件 v2.0	Applied Biosystems（通过 ThermoFisherScientific）		软件，用于分析 Sanger 测序数据。