本文描述了一种进行滴定ELISA的详细实验方案。此外，还提出了一种新颖的算法，用于评估滴定ELISA结果，并获得可溶性配体与微孔板固定化受体结合的解离常数。
方法文章
利用滴定ELISA法测定受体-配体相互作用解离常数的方法 关键词：ELISA，滴定，解离常数，受体-配体结合，结合亲和力
本文内容
摘要
摘要
解离常数描述了结合平衡中两个结合伙伴之间的相互作用，是衡量它们亲和力的指标。它是比较不同配体的关键参数， 例如，竞争性抑制剂、蛋白质亚型及突变体与其结合伴侣的结合强度。通过绘制结合浓度曲线来确定解离常数 与 游离配体的结合曲线。相比之下，滴定曲线更容易记录，该曲线以与结合配体浓度成正比的信号对所加入配体的总浓度作图。该信号可通过光谱学方法和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行检测。本文以一项滴定ELISA方案为例，用于检测蛇毒来源的rhodocetin与其固定化的α2β1整合素靶结构域之间的结合。滴定ELISA具有高度通用性且被广泛应用。只要两种相互作用的蛋白质均为纯品且浓度已知，即可将其分别作为固定化受体和可溶性配体使用。迄今为止的难点在于如何从滴定曲线中确定解离常数。本研究引入了描述滴定曲线的数学函数，该算法无需依赖易产生误差的饱和信号图解估算，可直接通过非线性回归对原始数据（在不同配体浓度下的信号强度）进行数学分析。因此，可同时记录多条滴定曲线，并将其转化为一组特征参数，包括解离常数和具有结合活性的受体浓度，并可进行统计学评估。结合该算法后，滴定ELISA具备了直接提供解离常数的优势，未来可更高效地被应用。
引言
解离常数 K 是描述受体（R）与其配体（L）之间亲和力的关键参数。根据质量作用定律，K 定义为受体-配体复合物 RL 解离为受体 R 和配体 L 的平衡状态：
公式 1
其中下标 f 表示受体和配体的游离/未结合状态。受体-配体复合物 RL 的浓度与受体结合的配体浓度 Lb 相同。由于受体的总浓度 Rt 等于游离受体 Rf 与配体结合受体 Rb = Lb 之和，解离常数也可表示为：
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方案
1. 储备溶液
- 配制 100 mL 10x TBS pH 7.4 溶液：将 6.06 g TRIS 和 8.77 g NaCl 溶解于 90 mL 去离子水中，用 37% HCl 溶液调节 pH 至 7.4，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。
- 配制 100 mL 1 M HEPES/NaOH pH 7.4 溶液：将 23.83 g HEPES 溶解于 90 mL 去离子水中，用 1.5 M NaOH 调节 pH 至 7.4，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。
- 配制 100 mL 5 M NaCl 溶液：将 29.2 g NaCl 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。
- 配制 100 mL 1 M MgCl2 溶液：将 20.33 g MgCl2 · 6H2O 溶解于 90 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 100 mL，过滤溶液。
- 配制 5% 热灭活 BSA 水溶液：在 50 mL 离心管中称取 2.5 g BSA（V 级，pH 7.0），溶于 45 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 50 mL，在 68 °C 水浴中加热 45 分钟，然后在冰浴中冷却，于 -20 °C 保存。
- 配制 25% 戊二醛水溶液。
注意：戊二醛吞食有害，吸入有毒，可引起灼伤。操作....
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结果
ELISA 反应完成后，碱性磷酸酶底物转化为黄色的对硝基酚盐（para-nitrophenolate），其颜色深浅表明：随着第 1 至第 11 列中加入的 rhodocetin 浓度降低，结合的 rhodocetin 配体量也随之减少（图 1）。第 12 列未添加 rhodocetin 的孔中溶液无色，显示背景信号较低。
在 405 nm 处进行光度定量可获得数据，这些数据可直接输入分析软件，通过非线性回归和公式 9对每条滴定曲线的原始数据进行拟合，并计算信号 S（即 OD405nm）作为加入的 rhodocetin 配体总浓度 Lt 的函数（图 2）。每种受体形式（野生型和突变型）的四条滴定曲线高度可重复，几乎完全重叠。与组内变异较小形成对比.......
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讨论
滴定ELISA是一种多功能的检测系统，用于测定受体-配体相互作用的解离情况。由于滴定ELISA无需有效分离游离与结合的配体，也无需对其浓度进行定量分析，因此相比绘制结合曲线的方法，已有大量研究和文献采用了滴定ELISA。此外，滴定ELISA操作简便，且对受体和配体的用量要求相对较低。为了准确分析解离常数，必须使用高纯度的受体和配体样品。受体样品中若存在污染蛋白，会与受体竞争微孔板塑料表面的吸附位点。这些杂质虽不结合配体，但会减少可结合配体的受体数量，从而降低滴定ELISA的信号强度。如果受体样品的纯度无法进一步提高，可将针对该受体的抗体固定在微孔板上，通过封闭孔板后，从含有杂质的样品中捕获受体。然而，必须注意避免捕获抗体因抗体间的种属交叉反应而干扰后续使用一抗和二抗对结合配体的检测，或阻碍配体与受体的结合。
为了获得全面的数据集，建议以相互对应的方式进行滴定 ELISA 实验，即在一个实验中用作可溶性配体的分子，在另一个实验中作为受体固定在微孔板上，并用前一个实验中的受体（此时作为可溶性配体）进行滴定。这种方法通常效果良好，除非固定过程使其中一方的结合活性失活，或缺乏可用的检测工具.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本方案和算法是在德国研究基金会（DFG 资助项目 SFB1009 A09 和 EB177/13-1）资助的项目中开发的。作者感谢 Barbara Schedding 和 Felix Schmalbein 提供的技术支持，以及 Niland 博士对稿件的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| TRIS | neoFrox | 1125KG001 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| NaCl | Applichem | 1,316,591,214 | |
| MgCl2 | Merck | 172571 | |
| 整合素 a2A，野生型与突变型，重组蛋白 | 由作者实验室分离 | ||
| NiNTA superflow 柱 | Qiagen，德国 | 30821 | |
| 考马斯亮蓝 R250 | Serva | 35050 | |
| 双辛可宁酸法（BCA）蛋白浓度测定试剂盒 | Fisher Scientific | 23225 | |
| 牛血清白蛋白（BSA），第 V 组分 | Applichem | A1391 | |
| 25% 戊二醛溶液 | Merck | 354400 | |
| 山羊抗兔免疫球蛋白抗体，碱性磷酸酶标记 | Sigma-Aldrich | A9919 | |
| 甘氨酸 | Applichem | A1377 | |
| 乙酸锌（Zn(II)） | Applichem | A4324 | |
| NaOH | Applichem | A1551 | |
| 碱性磷酸酶底物片剂（5 mg） | Sigma-Aldrich | S0942 | |
| Costar 半面积微孔板 | Thermo Scientific | Corning 3690 | |
| 微量反应管 | Eppendorf | 30120086 | |
| 酶标仪（微孔板 ELISA 读板仪） | BioTek | Synergy HT |
参考文献
- Klotz, I. M. The application of the law of mass action to binding by proteins; interactions with calcium. Arch Biochem. 9, 109-117 (1946).
- Klotz, I. M. Ligand-receptor complexes: origin and development of the concept. J Biol Chem. 279
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