在大鼠模型中植入具有优化结构的静电纺丝血管移植物

摘要

在此，我们介绍一种改良的静电纺丝方法，用于制备具有粗纤维和大孔结构的PCL血管移植物，并描述一种评估其性能的实验方案 体内 在腹主动脉置换大鼠模型中的性能表现。

摘要

本文介绍了一种制备大孔结构PCL血管移植物的方案，并描述了利用大鼠腹主动脉置换模型进行评估的实验方法。电纺血管移植物通常孔径较小，限制了细胞向移植物内部的迁移，阻碍了新生动脉的再生与重塑。本研究采用改进的加工技术，制备出纤维较粗（5 - 6 µm）且孔径较大（约30 µm）的PCL血管移植物。通过在大鼠腹主动脉模型中植入移植物，评估其长期性能。超声分析显示，即使在植入12个月后，移植物仍保持通畅，未出现动脉瘤或狭窄。大孔结构促进了细胞长入，从而在3个月时即观察到组织再生。更重要的是，在植入12个月后，移植物管壁内未见钙化等不良重塑迹象。因此，经改进的大孔结构电纺PCL血管移植物具有作为长期植入动脉替代物的潜力。

引言

由合成聚合物制成的血管移植物在临床上被广泛用于治疗心血管疾病（CVDs）。然而，对于小直径血管移植物（D <6 mm）而言，由于血流速度降低导致通畅率较低，常引发血栓形成、内膜增生及其他并发症，目前尚无成功的产品可用¹。

组织工程提供了一种基于支架引导的血管再生与重建来实现长期通畅性和稳态的替代策略。具体而言，作为三维模板的血管移植物可在血管组织再生过程中提供机械支撑和结构引导，并影响细胞功能，包括细胞黏附、迁移、增殖以及细胞外基质的分泌²。迄今为止，已有多种合成聚合物被评估用于血管组织工程。在这些聚合物中，聚(ε-己内酯)（PCL）因具有良好的细胞相容性以及从数月到两年不等的缓慢降解特性而被广泛研究³。在大鼠主动脉模型中^4,5,6，通过静电纺丝制备的PCL血管移植物表现出优异的结构完整性和通畅性，并在植入后6个月内持续观察到移植物管壁中细胞浸润和新生血管的增加。然而，在更长时间点（长达18个月）也观察到了不良的组织重塑现象，包括细胞和毛细血管的退化以及钙化。

血管移植物的细胞化是决定组织再生与重塑的关键因素⁷静电纺丝作为一种多功能技术，已被广泛用于制备具有纳米纤维结构的血管移植物⁸然而，静电纺丝血管移植物通常具有相对较小的孔隙结构，导致细胞浸润不足，从而限制了后续的组织再生。为解决这一问题，已尝试多种技术以增大孔径和整体孔隙率，包括盐/聚合物沥滤法^9,10，收集装置的改造，激光辐射的后续处理¹¹, 等等事实上，电纺支架的结构（包括纤维直径、孔径和孔隙率）与加工条件密切相关。^12,13在静电纺丝过程中，可通过改变聚合物溶液浓度、流速、电压等参数便捷地调控纤维直径。 等等.^14,15因此，孔径和孔隙率已相应提高。

我们近期报道了一种具有大孔结构的改良型PCL静电纺丝移植物（纤维直径为5 - 7 µm，孔径为30 - 40 µm）。体内实验通过替换大鼠腹主动脉进行植入，术后3个月显示移植物通畅率高，并具有良好的内皮化和平滑肌再生。更重要的是，即使在植入一年后，也未观察到包括钙化和细胞退化在内的任何不良组织重塑现象¹⁶。

方案

实验动物的使用已获得南开大学动物实验伦理委员会的批准，并按照《实验动物护理和使用指南》的规定进行。

1. 静电纺丝PCL移植物的制备

注意：本研究采用静电纺丝技术制备血管移植物。

1. 分别将PCL溶于甲醇与氯仿的混合溶剂（体积比1:5）中，配制25 wt%和10 wt%的PCL溶液，在室温下搅拌12小时。
2. 将PCL溶液装入10 mL玻璃注射器中。
3. 在注射器上安装21号针头。
4. 将不锈钢芯轴（直径2 mm，长度25 cm）固定在收集装置上。
5. 制备粗纤维移植物时，采用25 wt%的PCL溶液，针尖至收集器的工作距离为17 cm，流速为8 mL/h，电压为11 kV；制备细纤维移植物时，采用10 wt%的PCL溶液，针尖至收集器的工作距离为20 cm，流速为2 mL/h，电压为18 kV。
6. 将制得的移植物置于真空环境中过夜，以去除残留溶剂。 操作前对所有器械进行灭菌，并在整个过程中保持无菌操作技术。
7. 植入前，将移植物浸入10 mL 75%乙醇中消毒30分钟，随后置于紫外光下照射过夜。
8. 纤维与孔径尺寸测量：利用ImageJ软件，基于扫描电子显微镜（SEM）图像计算平均纤维直径。
9. 支架的力学性能测试：
   1. 使用剃刀将管状支架切割成3 mm长的片段，并用千分尺测量支架厚度。
   2. 将管状支架固定于载荷能力为100 N的拉伸试验机上。
   3. 以夹具间距1 mm，以10 mm/min的速率沿纵向进行拉伸，直至断裂；记录断裂时的抗拉强度和最大断裂伸长率；根据应力-应变曲线初始线性区域（应变不超过5%）计算杨氏模量。

2. 大鼠腹主动脉移植模型

注意：手术中使用的所有材料和器械均为无菌。手术过程中，操作者须佩戴纱布口罩和无菌手套，以避免感染。确保室温维持在 27 - 30 °C，以保持动物体温。有关镇痛处理，请遵循当地 IACUC 指南。 

1. 选用体重为 240 - 270 g 的雄性 Sprague Dawley 大鼠作为血管移植物受体。术前确保大鼠已禁食 24 小时。 禁食 24 小时的目的是充分排空肠道内的粪便，从而扩大术者视野。  
2. 抓住大鼠背部颈部并使其头部朝下，将注射针插入下腹部腹腔内，通过腹腔注射水合氯醛（330 mg/kg）诱导麻醉。
3. 确认大鼠肌肉松弛、呼吸平稳，表明麻醉充分。将大鼠仰卧位置于手术显微镜下。
4. 在眼睛上涂抹凡士林眼用软膏，防止麻醉期间角膜干燥。术前通过尾静脉注射肝素化生理盐水溶液（50 UI/mL）给予抗凝处理（100 UI/kg）。
5. 使用刀片剃除腹前壁的毛发，并用碘溶液和医用酒精溶液清洁皮肤。
6. 使用手术剪沿腹中线行腹壁切口，确保切口长度约为 4 - 5 cm，随后暴露腹腔。
7. 用生理盐水浸湿的纱布牵开并包裹肠道。
8. 仔细解剖腹主动脉。
9. 使用 9-0 单股尼龙缝线结扎所有细小分支。
10. 使用两个血管夹夹闭腹主动脉的一段隔离区域（长度不超过 1 cm）。 主动脉夹闭时间可维持 20-30 分钟。
11. 使用显微剪在两个血管夹之间横断腹主动脉，以形成吻合口。
12. 用肝素化生理盐水溶液（50 UI/mL）冲洗主动脉两端，以清除残留血液。
13. 使用显微剪剥离外膜。
14. 将内径为 2 mm、长度为 1 cm 的移植物，采用 9-0 单股尼龙缝线以“8”字缝合法与大鼠腹主动脉进行端端吻合。
15. 首先在近端吻合口按 9 点、3 点、12 点和 6 点位置顺序完成四个定点缝合，然后在两定点之间以 4 针连续缝合切缘。近端缝合完成后，以相同方法缝合远端。
    注意：每一针均需确保宿主动脉侧壁轻微嵌入移植物内。
16. 先松开远端血管夹，使血液流入移植物，随后松开近端血管夹。
17. 使用无菌棉球或小块纱布按压缝合口末端以止血，持续按压约 3 分钟，直至实现止血。
18. 将肠道复位至腹腔内。
19. 使用含庆大霉素（320 U/mL）的温生理盐水冲洗腹腔。
20. 分别使用 3-0 尼龙缝线缝合肌肉层和皮肤层，关闭腹壁切口。
21. 将大鼠放入清洁干燥的笼子中，并在笼下放置加热垫以维持动物体温；等待大鼠从麻醉中恢复。需持续照看动物，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。
22. 意识恢复后，将大鼠单独饲养于笼中，提供食物和饮水。术后在伤口处涂抹碘液以预防感染 。待其完全恢复后，再将其与其他动物合笼饲养。
23. 根据机构指南，在预定时间点对大鼠实施安乐死。

结果

PCL 移植物在术后 3 个月和 12 个月被取出，并采用标准组织学技术进行苏木精和伊红（H&E）染色分析&E)、Masson 三色染色、Verhoeff-van Gieson (VVG) 染色、Von Kossa 染色，以及 α-SMA、MYH、vWF 和弹性蛋白的免疫荧光染色。组织学图像采用正置显微镜拍摄，免疫荧光图像采用荧光显微镜拍摄。

所有数据均以均值 ± 标准差表示。采用双尾配对 Student t 检验进行差异比较。当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学意义。

本研究成功制备了结构优化的新型静电纺PCL移植物，即具有更粗纤维和更大孔径的移植物。扫描电镜图像显示，改良型移植物的平均纤维直径几乎是传统移植物的8倍（图1A

讨论

细胞浸润对于血管移植物的再生和重塑至关重要 体内¹⁶细胞浸润有限通常与移植物孔径相对较小有关，这些小孔会阻碍细胞向移植物管壁内迁移。为解决这一难题，我们开发了一种改良方法，用于制备具有大孔结构的静电纺PCL血管移植物。具体而言，纤维厚度可通过工艺参数便捷调控，而孔径大小随纤维厚度增加而增大。结果表明，宿主细胞可轻松浸润进入这种大孔移植物的管壁中 体内 植入后12个月，细胞密度仍保持在较高水平，且无明显细胞退化。

天然动脉主要由三层结构组成，即内皮层、中膜层和外膜层。内皮层作为抗血栓形成的界面，在维持血管长期通畅性方面发挥着至关重要的作用。在本研究中，移植物在植入3个月后观察到完全内皮化。此外，由多层平滑肌细胞构成的中膜层在调节血管功能以及提供动脉适当的机械性能方面具有重要意义。本研究表明，采用粗纤维和大孔结构的静电纺PCL移植物显著促进了功能性中膜层的再生。而且，再生的平滑肌结构与天然中膜层相似。免疫荧光染色显示，多层MYH⁺细胞分布于弹性蛋白网络中，呈现出平滑肌细胞环向排列的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚(ε-己内酯)（PCL）颗粒（Mn=80,000)	Sigma	704067
甲醇	天津化学试剂公司	1060
酒精	天津化学试剂公司	1083
氯仿	天津化学试剂公司	A1007
蔗糖	天津丰川公司	2296
Triton X-100	Alfa Aesar	A16046
Sprague Dawley大鼠	军事医学科学院实验动物中心
生理盐水	河北天成药业公司
水合氯醛	天津瑞金特化学公司	2223
肝素钠注射液	天津生物化学制药公司
硫酸庆大霉素注射液	江苏涟水制药有限公司
小鼠抗-α-肌动蛋白α-平滑肌（α-SMA）一抗	Abcam	ab7817
小鼠抗平滑肌肌球蛋白重链初级抗体	Abcam	ab683
兔多克隆抗大鼠弹性蛋白抗体	Abcam	ab23748
兔抗血管性血友病因子一抗	Abcam	ab6994
山羊抗小鼠 IgG（Alexa Fluor 488）	Invitrogen	ab150117
山羊抗兔IgG（Alexa Fluor 488）	Invitrogen	ab150077
5% 正常山羊血清	中山金桥	ZLI9022
苏木精和伊红（H&E)	北京雷根生物科技	DH0006
马松三色染色	北京雷根生物科技	DC0032
Verhoeff-范吉森（VVG）	北京雷根生物技术有限公司	DC0059
冯科萨染色	北京雷根生物科技	DS0003
带3-0号丝线的外科缝合针	上海金环医疗用品有限公司	G3002b
带线9-0丝线手术缝合针	上海金环医疗用品有限公司	H901