稳定蝇及其他蝇样双翅目的实验室饲养

摘要

本文介绍了一种饲养厩蝇（Stomoxys calcitrans）的稳定方法。该方法采用当地易得的材料作为饲料成分、设备和耗材。

摘要

厩蝇（Stomoxys calcitrans）是全球范围内对家畜、人类、伴侣动物和野生动物造成严重危害的害虫。在过去20多年中，由于农艺实践的改变，多个国家出现了厩蝇的大规模暴发。这些暴发事件严重影响了畜牧业生产和人类户外活动，导致公众要求加强对该害虫的研究和防控力度。本文介绍了一种简单且低成本的厩蝇实验室饲养方法。该方法使用本地易得的饲料成分、设备和耗材，也可根据需要调整用于饲养其他蝇科昆虫，包括眼蝇（Musca autumnalis）、角蝇（Haematobia irritans）和家蝇（Musca domestica）。采用该方法饲养的厩蝇蛹平均重量为12.5 mg，卵至成虫的存活率约为35%。每个饲养盘可获得约3000只成虫。

引言

厩蝇（Stomoxys calcitrans (L.)）是一类吸血性蝇类，其叮咬具有疼痛感，会干扰家畜的放牧行为，导致伴侣动物疼痛与痛苦，并在全球范围内影响人类的户外休闲活动。厩蝇幼虫在发酵的植物性物质中发育，这些基质常被动物排泄物污染。农业耕作方式和作物种类的变化，已导致在澳大利亚的农作物残余物和蔬菜¹、巴西的甘蔗²以及哥斯达黎加的菠萝种植区³中暴发严重的厩蝇疫情。尽管每只动物身上仅14只厩蝇即被视为造成经济损失的阈值⁴，但在近期暴发中，已观测到每只动物身上超过2000只蝇类的极端情况⁵。如此高水平的侵染可使宿主生产力降至接近零，并可能导致死亡⁶。由于与农业活动相关的暴发日益频繁，厩蝇正重新受到关注，对实验室种群的需求也急剧增加。

与其他完全变态昆虫一样，厩蝇在幼体或幼虫阶段获取生长所需的全部营养。因此，饲养系统的一个重要组成部分是幼虫的食物或基质。在野外已观察到厩蝇幼虫可在多种基质中发育⁷，且其发育依赖于基质中的微生物群落^8,9。天然幼虫基质主要由正在分解或发酵的植物性材料组成，通常还含有氮素废物污染物。

在实验室饲养条件下，厩蝇幼虫的培养基通常由植物性材料和添加的氮源组成。已有多种材料被用于配制厩蝇幼虫饲料。早期的幼虫饲料模拟自然基质，包括发酵的燕麦秸秆以及马粪或牛粪^10,11。碳水化合物来源包括麦麸^12,13,14、苜蓿粉^12,13,14，以及由化学品专业制造商协会（CSMA）开发的一种商业配方（33%麦麸、27%苜蓿粉、40%啤酒酵母颗粒）^13,14,15,16。氮源包括酵母悬液¹²、鱼粉和碳酸氢铵¹⁷。饲料中常加入惰性填充材料，如燕麦壳¹²、甘蔗渣¹³、蛭石¹⁶、木屑^13,18和颗粒化花生壳¹⁴。

实验室饲养的一个主要目标是尽可能生产出生理特征与"野生型"相似的个体，以便实验室实验的结果能够反映野外种群的真实情况。为此，必须尽量减少近亲繁殖和人工选择，以维持遗传多样性，并确保营养资源与野外条件相近。次要目标是尽量减少人力和成本支出。降低开支的一个重要方面是利用本地可获取的饲料成分。本文介绍的厩蝇饲养系统即为实现上述目标而设计。

方案

1. 卵的收集（图1）

1. 准备产卵杯，将一块布的一端放入盛有约500 mL温水（约40 °C）的烧杯中。将布的边缘重叠覆盖在杯口，并用橡皮筋固定。将布的松散端折回并覆盖在杯口上方。
2. 将产卵杯放入装有8–10日龄成虫的笼中约2小时。饱卵的雌性厩蝇会在布上产卵。
3. 从笼中取出产卵杯，用挤压洗瓶将卵从产卵布上冲洗至小盘中。

2. 准备幼虫饲养盘

1. 准备培养基（每培养皿用量）
   1. 将麦麸（500 g）、木屑（200 g）和鱼粉（115 g）加入10 L塑料培养皿中，充分混合。
   2. 将碳酸氢铵（50 g）加入水（约25 °C，1600 mL）中，搅拌至完全溶解。
   3. 将水溶液倒入干性成分中，充分混合以确保无干结颗粒。将培养基在培养皿中铺平，但不要压实。
2. 接种厩螫蝇卵
   1. 在培养基表面沿培养皿长度方向挖一条浅沟。
   2. 用卵转移移液管将1 mL厩螫蝇卵（约8,000枚卵）接种至沟中（图2）。
      注：卵转移移液管由塑料刻度移液管在所需位置截断后，插入100目筛网并用胶水重新粘合而成。
   3. 用一层薄薄的培养基覆盖虫卵，以防干燥。
   4. 用枕套覆盖培养皿，橡皮筋扎紧并贴上标签。将培养皿置于幼虫培养室（23 ± 2 °C，30–50% 相对湿度，12:12 [光:暗] h 光照周期）。
      注：从产卵开始，幼虫发育需10–14天。

3. 蛹的处理：产卵后7–9天，幼虫移至培养基边缘，并在第13或14天化蛹

1. 将主要位于培养皿边缘、培养基表面形成的结皮下方的蛹壳舀出，并置于干净的培养皿中。
2. 用蛹体填满托盘 ½ 至 ¾ 充满水。打散蛹壳和培养基的结块。培养基中的小麦麸皮和蛋白质组分下沉，而蛹壳 >1日龄浮游幼虫¹⁹.
3. 用漏勺去除漂浮物、蛹壳及部分培养基成分，再通过一系列筛子（#5、#7、#12、#20）冲洗，以清除残留的培养基。其中，#12 筛子用于收集蛹壳，#20 筛子可防止固体废物进入下水道。使用水槽喷头在筛子之间冲洗蛹壳。
4. 将蛹壳用12号筛子冲洗至干净的托盘中。向托盘中加水至充满 ½ 充满水。将漂浮的蛹壳倒入滤网中，沥去多余的水分。
5. 将滤干的蛹壳转移至带风扇的干燥筛上，直至干燥（图3).

4. 蛹架法，一种使用蛹架收集蛹壳的替代方法¹⁸

注意：支架由一个10升洗盘末端切下的塑料片制成（高10.2厘米 × 宽10.2厘米 × 长31.9厘米）。

1. 按 2.1 中所述制备培养基。将培养皿中的培养基一端由约 2.5 cm 深度逐渐倾斜至另一端约 7.5 cm 深度。
2. 在饲养盘的浅端将架子放置于培养基上，并用胶带固定，以防止幼虫沿架子边缘爬行（图 4）。
   1. 将海绵（约 14.5 × 9.0 × 4.5 cm³，再生纤维素）浸透水，用湿润的棉布（30.5 × 42 cm²）包裹，并置于架子上，距培养基约半英寸处。
3. 按 2.2 中所述加入卵，并按前述步骤继续操作。
   1. 每天检查饲养盘，确保海绵保持湿润。
4. 在产卵后第 14 天，将架子、海绵和棉布上的蛹壳冲洗至干净的盆中，然后倒入滤筛内。

5. 质量控制

1. 称量每个培养皿中产生的所有蛹壳（总重量）。
2. 随机选取100个蛹壳，称重后放入一个9 cm的培养皿中。
3. 约5–8天后统计成虫数量并鉴定性别，以确定羽化率和性别比例。如需延迟计数，可将已羽化成虫的培养皿存于冰箱中。通过复眼形状、额眶板宽度²⁰，或在低倍镜下观察外生殖器来鉴定蝇类性别。
4. 记录蛹壳总重量、100个蛹壳的重量，以及羽化出的雄性和雌性成虫数量。

6. 血液的制备

1. 从当地屠宰场采集新鲜牛血，放入盛有 500 mL 水和 70 g 柠檬酸钠三水合物的 19 L 塑料桶中。剧烈搅拌血液 5–10 分钟，然后运回实验室。
2. 将血液通过滤网过滤以去除凝块，并分装至 2 L 容器中，标注采集日期后置于 -20 °C 冰箱中冷冻保存。
3. 使用前 2 天，将容器从冷冻室取出并放入冷藏室解冻。解冻后的血液可在冷藏条件下使用约 2 周；冷冻保存可维持长达 1 年。

7. 成虫维持

1. 准备笼子，并用牛皮纸铺垫笼底，以便清洁。
2. 每个笼子中放入 50 g 干燥的厩蝇蛹（约 3,500 头）。成虫在蛹处理后数小时至数天内羽化。
3. 在每个笼子顶部放置一片浸有新鲜血液的卫生巾用于喂饲。在成虫羽化后 24 小时内开始喂饲，并每日更换，直至产卵前一日（羽化后 9–10 天）。
4. 产卵后（第 1 节），将笼子放入冰箱冷冻 4–8 小时，然后移除垫纸，用热水冲洗笼壁和底部的虫粪，再用洗衣粉和含氯漂白剂刷洗所有表面，最后用热水冲洗干净并晾干。

结果

幼虫在产卵后10–14天化蛹，成虫在产卵后14–16天羽化。世代周期（卵至卵）约为24天。2013年5月至2017年1月期间，使用三种不同填充材料及两个果蝇群体的饲养数据见图5。以杨木屑作为填充材料时产量最高，获得蛹的数量为3867 ±1442（ ± 标准差），蛹重12.5 ±1.6 mg，羽化率为74 ±19%，每个培养皿可获得2872 ±1294只成虫（来自已建立的实验室群体）。性别比例略偏向雌性，为0.97:1（雄:雌，共记录1,184个培养皿中的77,141只果蝇性别）。卵至成虫的存活率约为36%。遗憾的是，杨木屑近年来越来越难以获取，迫使我们频繁使用松木屑。尽管使用松木屑时产量较低，每皿约1,700只成虫，但个体体型略大，达13 ...

讨论

稳定蝇在自然界中可在多种基质中发育，并可在实验室中用多种培养基进行饲养。我们曾使用木屑和蛭石作为填充剂。蛭石效果良好，但使蛹壳与培养基的分离变得困难，且成本较高（约0.60美元/盘）。可能由于从培养基中分离蛹壳的操作更为繁琐，使用蛭石时的羽化率也较低，为57%，而木屑为75%。棉白杨木屑的效果与蛭石相近，但有时难以获取。最重要的组分似乎是可发酵并维持环境的植物性或纤维素类物质 "开放" 或通气良好的培养基和氨态氮^21,22厩蝇幼虫不会在纯粪便中被发现，而是偏好与植物残渣混合的老化粪便。考虑到这一点，此处所述的饲养方法可根据当地可获取的材料进行调整，以建立经济有效的厩蝇饲养流程。

采用这些方法饲养的家蝇在体型上与野外采集的家蝇相当。翅长与家蝇体重具有相关性²³。由于野生家蝇的翅缘常有磨损，我们采用中室（discal-medial cell）的长度作为翅长的指标。采用本方法饲养的249只家蝇中，中室平均长度...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Diamalt	Premier Malt Products, Inc.，新泽西州萨德尔布鲁克	2540
CSMA 果蝇培养基	普瑞纳动物营养，明尼苏达州阿登山	5S6Z
薄型超长卫生巾	美国俄亥俄州克利夫兰市，Tranzonic 公司	5001M
Calf Manna	MannaPro，美国密苏里州切斯特菲尔德	Manna Pro
碳酸氢铵	Spectrum Chemical Manufacturing Corp，加利福尼亚州加登纳	A1125
小麦麸，粗粒	Siemer Milling Company，伊利诺伊州特乌托波利斯
木屑	Tractor Supply Company，布伦特伍德，田纳西州	502770699
鱼粉	Consumer Supply Distributing，南达科他州北苏城	F1550
成虫饲养笼	林肯铝窗公司，内布拉斯加州	自定义	45 × 45 × 45 厘米，18 × 16 目铝筛，针织套管开口
9 × 28 cm 黑色棉布	Robert Kaufman Fabrics，洛杉矶，加利福尼亚州	K040-114	蛋布
10 L 塑料托盘	Rubbermaid，纽约州萨拉托加斯普林斯	FG2951ARWHT	幼虫培养皿
棉质纱布，12 英寸 × 25 码卷装	Tex-Care 医疗公司，北卡罗来纳州伯灵顿	91311-225