用于纵向成像的微流控平台 秀丽隐杆线虫

摘要

本文中，我们利用一种定制的微流控装置，对单个线虫进行活体成像。在该装置中，多条线虫被分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重化、长期监测。

摘要

近十年来，微流控技术已被应用于研究小型动物，包括线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），并被证明是一种便捷的活体成像平台，可在实时条件下精确控制实验环境。本文中，我们利用此前发表的定制微流控装置 WormSpa，对单个线虫进行活体成像。该装置将多条线虫分别限制在独立的腔室中，从而实现对多种生物学过程的多重长期监测。为展示其功能，我们进行了原理验证实验：在装置内使线虫感染致病菌，并持续监测单个个体中免疫应答基因的表达动态及产卵行为。该装置结构简单、操作便捷，适用于此前无微流控实验经验的研究人员。我们建议，该方法将有助于众多希望在明确定义的条件下对生物学过程进行长期观察的研究者。

引言

环境条件的变化可能导致遗传程序的激活，伴随特定基因表达的诱导与抑制^1,2。这些动力学变化在同一动物的不同组织之间以及不同动物之间可能存在差异。因此，对这类遗传程序的研究需要能够对单个动物进行长期成像，并精确动态控制环境条件的方法。

近年来，微加工流体装置已被用于研究多种小型动物的反应和行为，包括线虫、果蝇、水熊等^3,4,5,6,7。其应用包括例如深度表型分析、在化学刺激下对神经元活动进行光遗传学记录，以及对运动行为（如运动和泵动）的追踪^8,9,10,11。

基于微流控的方法具有多种特性，可为长期纵向成像研究生物对环境刺激的响应带来优势，包括对局部微环境的精确动态调控、可灵活设计以将个体动物分隔饲养的结构，以及有利于成像的优良特性。然而，长期将动物维持在微流控腔室内且对其健康造成最小不利影响仍是一项挑战，这需要在微流控装置的设计以及实验操作过程中给予特别关注。

本文展示了 WormSpa 的使用方法，这是一种用于对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）进行长期成像的微流控装置。⁵ 单个线虫被限制在腔室中，持续的低流速液体和细菌悬浮液可确保线虫获得充足营养并保持足够的活动性，从而维持良好的健康状态并减轻应激反应；同时，腔室结构允许线虫产卵。WormSpa 设计与操作简便，即使此前无微流控经验的研究人员也能将其整合到自身的研究计划中。

方案

以下方案使用 WormSpa⁵，这是一种先前已描述的用于线虫长期成像的微流控装置。WormSpa 的制备（起始步骤为获取作者提供的 CAD 文件）较为直接，但需要一定的专业知识。在大多数情况下，可由核心设施或提供此类服务的商业公司完成装置的制备。在制备装置时，务必明确要求特征结构的高度为 50 µm。

1. 实验设置

1. 将微流控装置安装在带有电动载物台的倒置荧光显微镜上。
2. 将轨道摇床放置在显微镜附近，但需确保摇床产生的振动不会直接影响显微镜。例如，可将摇床置于固定在墙上的搁板上，使其不与光学实验台接触。
3. 将注射泵放置在轨道摇床上。用胶带将泵固定在摇床上，以防止摇动时发生晃动。

2. 微流控环境的制备

注意：实验过程中，四个注射器通过注射器管路连接至微流控装置，如图1所示。本步骤描述了这些注射器的准备过程。除非另有说明，注射器管路应尽可能短，但不得拉紧。

1. 准备一个出口注射器和一根注射器管。该注射器（图1中的S1）之后将通过注射器管连接至装置的出口，用于临时储存从装置中流出的液体。
   1. 通过移除20 G × 1/2英寸注射器头的塑料部分，仅保留针头（金属部分），制作一个适配针。操作时用镊子夹住塑料和金属部分并将其拉开。针头上残留的塑料可用本生灯烧除。
   2. 用镊子夹住针头两端，根据实验装置的几何结构将针头弯曲。在本文描述的设计中，将针头中部弯曲至约110°角最为方便。
   3. 将适配针插入管中约一半长度。另一半稍后将插入装置中。注射器管应与20 G注射器头兼容且不漏液（例如，内径为0.86 mm、外径为1.32 mm的管）。推荐的管长约为50 cm。
   4. 通过一个20 G × 1/2英寸注射器头，将一个10 mL鲁尔锁式注射器连接到注射器管的另一端（开口端）。
2. 准备缓冲液入口注射器和注射器管。其中一个注射器（图1中的S2）用作进入装置的液体储液器，并用于控制注入流速。另一个注射器（图1中的S3）用于缓冲液更换，具体见步骤3.2。
   1. 将一个10 mL鲁尔锁式注射器（S2）直接连接至三通阀，并通过注射器管将另一个注射器（S3）连接至同一阀门（图1）：通过注射器头将S3连接至管，再通过另一个注射器头将管连接至阀门。
      注：这些材料的连接顺序无关紧要。
   2. 将一根注射器管连接至三通阀的剩余端口。按照步骤2.1.2的方法制备另一个适配针，并将针头的一半插入注射器管的另一端（开口端）。
   3. 调节阀门，使步骤2.2.2中的注射器管与S2连通，同时关闭S3（图1）。
3. 准备蠕虫入口注射器和注射器管。该注射器（图1中的S4）用于将蠕虫加载到装置中。
   1. 将一根长注射器管连接至一个10 mL鲁尔锁式注射器（S4）。根据用于加载的液体体积确定该管的长度；例如，100 cm长的管可容纳超过2 mL液体（另见步骤4.2）。
   2. 按照步骤2.1.2的方法制备另一个适配针，并将针头的一半插入注射器管的另一端（开口端）。
4. 用S-培养基¹²将所有注射器和管路冲洗两次。用S-培养基充满注射器和管路，并注意去除所有气泡。
5. 将出口注射器管连接至装置的出口。
   1. 将注射器管末端的适配针插入出口端口。
   2. 通过出口注入少量S-培养基以充满装置，直至缓冲液入口和蠕虫入口均有少量S-培养基流出。
6. 将缓冲液入口注射器管连接至装置的缓冲液入口端口，同时用一根针（直径为1/32英寸的不锈钢圆柱销）堵住蠕虫入口。
7. 向装置中注入恒定流速的缓冲液。将缓冲液入口注射器S2装载到注射泵¹³上，并设置泵，使S2中的培养基以3 µL/min的流速持续注入装置中。

3. 将细菌载入微流控装置

1. 制备悬浮于S培养基中的Escherichia coli OP50¹²。
   1. 按照标准操作流程，取50 mL LB培养基加入250 mL锥形瓶中，并接种单个菌落，于37 °C过夜培养。
   2. 将过夜培养物在4000 rpm条件下离心10分钟，弃上清，将菌体沉淀重悬于30 mL S培养基中。
   3. 使用5 µm针头滤器过滤该菌液悬浮液。通过测量其在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）来确定细菌浓度，并将浓度调整至OD₆₀₀为3。此高浓度可确保线虫获得充足营养。
2. 用OP50菌液替换装置中的缓冲液。
   1. 准备一支洁净的注射器（S5），装入OP50菌液。将注射器垂直持握，并轻轻敲击数次，使所有气泡聚集至顶部。
   2. 将缓冲液入口注射器上的三通阀转向，关闭其与装置的连接，然后将S2和S3两支注射器连接起来。将S2从注射泵上取下。
   3. 断开S2与三通阀的连接，将S5连接至该阀。通过三通阀将S5顶部聚集的所有空气推入S3中，直至少量OP50缓冲液进入S3。操作过程中需确保S5及三通阀内无残留气泡。
   4. 将三通阀转回原始位置，关闭S3与S5之间的通路，同时使S5与装置连通。将S5安装至注射泵上。开启固定注射泵的轨道摇床，设置摇动速度约为200 rpm。
   5. 设定流速为100 µL/min。新缓冲液到达装置内线虫所需的时间取决于缓冲液入口注射器管路的长度（使用上述管路时约为5分钟）。若需更快完成缓冲液更换，可采用更高的流速。
   6. 当OP50缓冲液已完全充满装置后，将流速调回至3 µL/min。

4. 将线虫载入微流控装置

1. 准备一个小型低吸附微量离心管（650 µL），加入100 µL OP50菌液。使用线虫挑取工具，从NGM（线虫培养基）琼脂平板上逐一挑取约20–30条年龄同步化的年轻成虫（在25 °C条件下L1幼虫期停滞46小时后发育而成）转移至该离心管中。年龄同步化操作可依照标准实验方案进行。¹².
2. 填充蠕虫进样注射器和注射器管（S4） 图1) 与 OP50 悬液混合。将约 500 µL 液体注入含有线虫的微量离心管中。用蠕虫进样注射器管吸取含有线虫的悬液。确保注射器管足够长（>1 米），且吸取的线虫保留在注射器管内，不会完全进入注射器 S4。
3. 将S4连接至蠕虫入口。将蠕虫入口注射器管中的所有蠕虫注入微流控装置。断开S4与注射器管的连接。用插针封闭蠕虫入口。
4. 将缓冲液入口注射器 S2 从机械泵上断开 图1）并手动控制 S1 和 S2，将所有线虫推入不同的通道。按压 S2 可使线虫进入通道，而按压 S1 则使其反向移动。一旦通道被加载，每个通道内的线虫将阻塞其他线虫进入。
5. 让线虫在新环境中适应2 - 3小时。

5. 设置成像方案

1. 找到所有牢固位于装置内的线虫，并在控制显微镜的图像采集软件中为每条线虫设置成像位置。请注意，在某些情况下（例如，需要更高放大倍数或使用CCD传感器较小的相机时），每个通道需要设置多个成像位置。
   注意：虽然此步骤可手动完成，但某些图像采集软件可加载一个文本文件，其中列出应采集图像的位置。由于WormSpa中的这些位置排列规则，用户可编写一个小脚本（例如，使用Python或商业软件）来自动生成此类列表。该脚本的具体格式取决于采集软件所要求的文件格式（参见补充材料1中的示例）。
2. 设置所需的时间序列成像频率。例如，对感染后免疫基因响应的成像通常以每10分钟一帧的频率进行。确保在每个时间点均采集所有必要的通道图像（例如，明场和GFP荧光）。

6. 宿主对假单胞菌感染的反应

注意：此步骤专用于研究宿主-病原体相互作用。或者，也可制备含有其他感兴趣环境信号的缓冲液（生物和非生物胁迫因子、药物、信号分子） 等等。).

1. 制备悬浮于SK培养基中的Pseudomonas aeruginosa PA14¹⁴。
   1. 在250 mL锥形瓶中加入50 mL LB培养基和单个菌落，于37 °C过夜培养。
   2. 另取一个250 mL锥形瓶，加入50 mL LB培养基及适量上述培养物，于37 °C过夜培养。
   3. 将过夜培养物在4000 rpm下离心10分钟，将沉淀重悬于10 mL SK培养基中。测定细菌浓度，并调节至OD₆₀₀ = 4。
   4. 将菌悬液转移至洁净的锥形瓶中，于37 °C振荡培养24小时，再于25 °C继续振荡培养24小时。此步骤模拟标准杀伤实验中的平板培养步骤¹⁴。
   5. 用5 µm针头滤器过滤菌悬液，以防止细菌聚集体堵塞装置。
2. 按照步骤3.2的相同操作，将装置中的OP50菌悬液替换为PA14菌悬液。持续成像10小时。

结果

在25 °C条件下，从L1幼虫滞育期后46小时的年龄同步化年轻成虫线虫¹²被加载至装置中，具体操作如实验方案所述。每条线虫被单独置于独立的通道内，从而实现对个体动物对病原体反应的长期监测。当实验成功时，大多数线虫在整个实验过程中会保留在各自的通道内。在此情况下，只需将对应通道置于成像光路中，即可获取单条线虫的图像，无需主动寻找动物位置。图2A展示了单个代表性线虫在装置中持续10小时的明场图像。尽管线虫被限制在通道内，它们仍可沿通道上下游移动，并能自由转动头部。这一点至关重要，可确保装置本身不会对动物造成应激或伤害。

我们通过监测蠕虫对细菌感染的反应来 P. aeruginosa，一种被研究得最为透彻的细菌病原体之一 秀丽隐杆线虫它也是一种机会性人类病原体，可导致囊性纤维化患者和...

讨论

微流控工具在研究线虫方面具有多种优势。与标准的NGM琼脂平板相比，在PDMS装置中成像可提供更高的成像质量。可对同一条线虫进行多次成像，而传统方法则需将线虫从平板上挑取并置于显微镜载玻片上进行成像。此外，可保持或按需调节线虫所处的微环境，从而精确绘制环境组成与动物反应之间的关系。

本文展示了如何利用定制的微流控装置（WormSpa）对多个个体线虫在机会性病原菌P. aeruginosa PA14感染下的宿主反应进行成像，从而实现宿主对细菌感染反应的纵向测量。在整个实验过程中，无需干扰样本即可在多个时间点获取明场和荧光图像。特别是，每10分钟检测一次产卵动力学和irg-1基因的表达情况，相较于传统方法，时间分辨率显著提高^14,15。

在此装置中，可通过在任意时间点重新访问每条线虫的保存位置，对多条线虫进行纵向测量。这一点在图2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
WormSpa	N/A	N/A	WormSpa 的 CAD 文件可从 Levine 实验室获取。
复式显微镜	Zeiss	AxioObserver Z1	配备电动载物台的倒置荧光显微镜
注射泵	New Era Pump Systems	NE-501
管路	SCI Scientific Commodities Inc.	BB31695-PE/5	内径 0.034” (0.86 mm)，外径 0.052” (1.32 mm)
注射器针头	CMLsupply	901-20-050	20 号 × 1/2” 钝头不锈钢套管
注射器滤器	PALL	4650	Acrodisc 32 mm 注射器滤器，带 5 µm Supor 膜
注射器	Qosina	C3307	10 mL 雄性鲁尔锁式注射器
三通阀	ColeParmer	FF-30600-23	大孔径三通止流阀，雄性锁扣，10 个/包，非无菌
圆柱销	McMaster-Carr	90145A317	18-8 不锈钢圆柱销（直径 1/32" × 长度 1/2"）
低吸附微量离心管	Corning	CL S3206	0.65 mL 低吸附 snap cap 微量离心管