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利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑

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DOI：

10.3791/57350

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2018年5月25日

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1Department of Molecular Cell Biology, University of California, Berkeley, 2Howard Hughes Medical Institute, University of California, Berkeley, 3Innovative Genomics Institute, University of California, Berkeley, 4Biomedical Sciences Graduate Program, University of California, San Francisco, 5Department of Microbiology and Immunology, University of California, San Francisco, 6Diabetes Center, University of California, San Francisco, 7Chan Zuckerberg Biohub, 8Department of Medicine, University of California, San Francisco, 9UCSF Helen Diller Family Comprehensive Cancer Center, University of California, San Francisco, 10Department of Integrative Biology, University of California, Berkeley

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

利用预先组装的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）是一种实现精确、高效基因组编辑的有力方法。本文重点介绍该方法在多种细胞和生物体中的应用，包括原代人源细胞以及经典和新兴的模式生物。

摘要

利用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas（CRISPR相关蛋白）系统对真核生物基因组进行位点特异性编辑，已迅速成为研究各类生物学问题的科研人员普遍采用的技术。用户通常使用来自Streptococcus pyogenes的Cas9蛋白，并将其与一种易于重新编程的向导RNA（gRNA）形成复合物。这些组分被导入细胞后，通过与双链DNA（dsDNA）基因组中互补区域的碱基配对，该酶可在特定位点切割双链，产生双链断裂（DSB）。随后的修复过程将导致随机插入或缺失事件（indels），或在断裂位点整合研究人员提供的外源DNA。

使用纯化的单导向RNA与Cas9蛋白预先组装形成核糖核蛋白复合物（RNP），并将其直接递送至细胞，是实现高效基因编辑的有效方法。RNP编辑尤其能够提高基因插入的效率，而这一结果通常较难实现。与质粒递送相比，Cas9 RNP在细胞内的存留时间较短，因而导致更少的脱靶效应。

尽管CRISPR基因编辑技术具有诸多优势，许多普通用户对该技术仍不够熟悉。为了降低入门门槛，我们详细阐述了在多种情境下实施RNP策略的操作流程，重点介绍了其独特优势和广泛的应用场景。我们涵盖了在两种人类原代细胞——T细胞和造血干细胞/祖细胞（HSPCs）中的基因编辑。此外，我们还展示了Cas9 RNP编辑如何实现对完整生物体的便捷遗传操作，包括经典模式生物线虫Caenorhabditis elegans以及近年来新引入的模式甲壳动物Parhyale hawaiensis。

引言

CRISPR-Cas9 系统使科学家能够对任何基因组的特定区域进行编辑1。这一快速且成本低廉的技术彻底改变了基础研究，并有望对个性化疾病治疗、精准农业等领域的发展产生深远影响2。CRISPR 编辑是一种普及化的工具，在新实验室中应用该系统无需基因组工程方面的特殊专业知识，仅需基本的分子生物学技能即可。如今，研究人员能够利用少数几种替代性的遗传操作手段，研究此前难以处理的生物体3,4。仅在过去五年中，CRISPR 基因组编辑技术已被用于改造超过 200 种不同的脊椎动物、无脊椎动物、植物和微生物物种。

CRISPR 原核生物防御通路被改造后，用于位点特异性基因组编辑的核心元件包括 Cas9 蛋白（通常来源于 S. pyogenes，经过密码子优化并添加了核定位信号 NLS）及其特异性的 RNA 引导序列5,6。尽管本文未予讨论，其他 Cas9 同源蛋白或 CRISPR 核酸酶也可被使用。天然存在的 gRNA 由两个独立转录的组分构成：CRISPR RNA（crRNA）和反式激活 crRNA（tracrRNA）7。这两种 RNA 可融合为一条单一转录本，称为单引导 RNA（sgRNA）8。大多数基因组编辑研究者选择更简化的 sgRNA9，但双引导系统也经常被使用10,11。实验人员选择一段 20 个核苷酸（nt）的基因组 DNA 序列作为靶点，确保其邻近存在一段短的许可序列——即原间隔序列邻近基序（PAM），该序列是 Cas9 识别所必需的，并据此设计包含互补序列的 gRNA12。

进入细胞后，RNP复合物会定位其基因组靶标，gRNA与互补的DNA链进行碱基配对，随后酶切割双链DNA，产生双链断裂2。细胞通过至少两种途径之一修复该双链断裂（DSB）：易错的非同源末端连接（NHEJ）途径或同源定向修复（HDR）途径，后者可无缝整合含有与断裂两侧同源“臂”的DNA序列。前一种修复途径通常导致插入或缺失（indel）的形成，从而引起基因失活；而后者则允许研究人员插入或改变DNA序列1。

编辑效率和准确性取决于Cas9和gRNA进入细胞的方式。这些组分可以核酸形式或预先组装的核糖核蛋白复合物（RNP复合物）形式递送至培养细胞、胚胎或生物体13,14,15。常见的基于核酸的递送方法包括病毒转导、转染或电穿孔递送mRNA或质粒DNA。随后，Cas9蛋白和向导RNA在细胞内生成并结合形成复合物。

直接递送核糖核蛋白（RNP）需要分别纯化Cas9蛋白和向导RNA。该过程可在实验室内自行完成，或从多家商业供应商处购买Cas9蛋白和sgRNA。获得后，将Cas9与gRNA混合形成具有酶活性的RNP复合物，并通过向受精卵/胚胎直接注射、基于脂质的转染16或电穿孔的方式导入细胞。首次关于RNP编辑的报道是将其注射至C. elegans性腺中17。显微注射仍是将RNP导入胚胎和完整生物体的首选方法，尽管在小鼠18,19和大鼠20胚胎中也已成功实现有效的电穿孔。本文描述了将RNP直接注射至C. elegans性腺和P. hawaiensis胚胎中的实验方案，并推荐使用一种特殊的电穿孔技术——核转染，用于在编辑原代人细胞时递送RNP。该方法采用优化的电穿孔程序和细胞类型特异性的溶液，可使RNP同时进入细胞质和细胞核21。

使用RNP进行基因组编辑具有多项显著优势。由于蛋白质和RNA组分已预先组装，且可在递送前确保其质量，因此RNP编辑避免了与核酸递送相关的诸多问题。具体而言，不存在Cas9编码DNA整合到宿主基因组的风险，mRNA不会暴露而被降解，同时规避了与之相关的其他问题。 体内 gRNA 或蛋白质表达、折叠与结合22,23此外，与基于质粒的表达相比，使用RNP可导致更低的毒性以及显著减少的脱靶效应，这是由于RNP在细胞内的半衰期较短所致。24,25,26,27.

最后，RNP编辑在多种人类细胞系、原代细胞（如成纤维细胞）、胚胎干细胞（ESCs）、诱导性多能干细胞（iSPCs）、造血干细胞/祖细胞（HSPCs）和T细胞中均表现出较高的编辑效率。16,24,25,26,27,28,29；在包括无脊椎动物在内的 秀丽隐杆线虫, P. hawaiensis和果蝇3,17,30在斑马鱼、小鼠和大鼠等脊椎动物物种中31,32；包括在植物物种中 拟南芥烟草、生菜、水稻、葡萄、苹果、玉米和小麦33,34,35,36；以及在 衣藻，青霉菌，以及 假丝酵母 物种37,38,39使用核糖核蛋白（RNP）时，插入缺失（indel）形成的频率可能高于质粒递送，且更易于实现HDR介导的DNA插入25,27,29.

本文所述方案采用Cas9核糖核蛋白复合物（RNP），是一种高效且易于调整的技术，可直接应用于多种生物系统40,41，尤其适用于难以操作的细胞以及缺乏成熟精确遗传操作体系的生物体。我们首先介绍如何设计、获取并组装Cas9 RNP，然后阐述其在不同模式细胞类型和生物体中的应用。造血干细胞/祖细胞（HSPCs）和T细胞均采用相同的转染方法——核转染，因此在本方案的第2和第3步中一并描述。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的基因编辑操作在第4和第5步中说明，夏威夷短尾乌贼（P. hawaiensis）的编辑则在第6和第7步中涵盖。最后，由于任何生物体中基因编辑实验的成功与否均可通过基因型测序来评估，因此第8步概述了针对本方案中所有细胞和生物体可能采用的分析方法的子步骤。

方案

1. RNP 复合物组装

  1. 提前精心设计实验，预先获取所有RNA、DNA和蛋白质组分。初次尝试时，可选用表1中列出的任一阳性对照，并使用材料表中所述的商业试剂，以确保实验设计的可靠性及试剂的完整性。有关规划新基因组编辑实验的更多建议，请参阅相关主题的研究论文。12,42,43.
    ​注意：按照后续步骤组装完成后，预先制备的核糖核蛋白复合物（RNP）可保存于 -80 °C。
    1. 在选定目标基因后，使用一种免费的在线工具设计最优的gRNA44,45,46,47,48务必选择外显子作为靶点，以期产生基因敲除。
      注意：这些工具将有助于识别具有相邻序列的靶位点 S. pyogenes PAM序列、高质量分数和低脱靶分数
    2. 纯化 S. pyogenes Cas9蛋白通过已发表的方法8，或从商业供应商处购买。
    3. 配制用于RNA稀释、RNP复合物制备及蛋白保存的典型Cas9缓冲液，其中包含20 mM HEPES（pH 7.5）、150 mM KCl、10%甘油和1 mM TCEP。用于重悬或稀释RNA的缓冲液必须始终使用无核酸酶水，以防止RNA降解。
    4. 通过以下方式制备向导RNA（tracrRNA和crRNA或sgRNA） 体外 使用已发表的方法进行转录，或从核酸合成公司购买17,21,49,50,51.
    5. 若要插入基因，需合成或购买供体DNA模板。
    6. 将蛋白和RNA分装样品于-80 °C保存，使用前在冰上立即解冻。
      ​注意：每次冻融都会略微降低效率。Cas9 纯化的详细开放获取方案52 以及 体外 sgRNA的转录53 在其他地方有提供。
  2. 如果正在进行 秀丽隐杆线虫，跳至步骤1.5。对于 P. hawaiensis 方案，跳至步骤 1.6。若使用 sgRNA，跳至步骤 1.4。进行步骤 1.3 以组装用于原代细胞编辑的 gRNA。
  3. 将等摩尔量的tracrRNA和crRNA混合，组装成gRNA。配制100 µL浓度为80 µM的gRNA储存液，可供约50次基因组编辑实验使用。
    1. 将gRNA在37 °C孵育30分钟，然后缓慢冷却至室温。
  4. HSPC和T细胞编辑的RNP制备：在总体积为10 µL的体系中，将1-2倍摩尔量的gRNA与200 pmol Cas9蛋白混合，形成RNP复合物。将浓缩的Cas9蛋白缓慢加入已预先用Cas9缓冲液稀释的gRNA中，持续约30秒，同时用移液器快速吹打混匀，使Cas9的终浓度为20 µM。
    1. 准备电穿孔小室。
      注意：本方案仅适用于文中提及的商用系统 材料表但RNP编辑也可通过其他电穿孔设备实现。
    2. 向每个比色杯中加入 5 µL（100 pmol，T 细胞）或 10 µL（200 pmol，HSPCs）RNP。
    3. 若插入新 DNA 而非构建基因敲除，需加入 1 µL 的 100 µM（100 pmol）单链寡核苷酸供体 DNA（ssODN）25,54,55 加入比色杯或培养板的孔中。
    4. 跳至第2步以获取原代细胞编辑的下一步操作说明 实验方案
  5. RNP 制备用于 秀丽隐杆线虫 编辑：按以下顺序加入试剂，配制终体积为 20 µL 的 RNP 复合物（括号内为终浓度）：Cas9（2 µM）、HEPES pH 7.5（10 µM）、KCl（115 µM）、crRNA（12 µM）、tracrRNA（40 µM）以及修复模板 如有需要 （0.5 µM 单链DNA或最高350 ng/µL 双链DNA）。
    ​注意：Cas9介导的双链断裂（DSB）模板修复效率与dsDNA修复载体的浓度成正比；因此，修复模板浓度越高，模板修复效率也越高。然而，已有研究表明，注射液中若含有超过350 ng/µL的dsDNA，会降低注射线虫的存活率。因此，为在最大化修复效率的同时最小化致死效应，建议在混合液中使用的dsDNA浓度最高不超过350 ng/µL。
    1. 根据步骤5.4中所述的共CRISPR/共转化筛选方法的需要，可添加多个crRNA以同时靶向多个位点。当添加多个crRNA时，应依次将每种crRNA逐个加入主混合液中。
      ​注意：每种crRNA的用量无需相同，即使在不改变Cas9浓度的情况下将crRNA总浓度在预混液中加倍，似乎也不会影响特定基因座的诱变频率。相关示例详见Paix 等56.
    2. 用移液器吹打混匀，然后在16,000 × g离心5秒，确保溶液聚集在管底。
    3. 在 37 °C 下孵育溶液 15 分钟。
    4. 以16,000 × g离心1分钟，使可能堵塞微注射细针的颗粒沉淀。后续步骤使用上清液。
    5. 其余部分请跳至第4步 秀丽隐杆线虫 实验方案
  6. RNP 制备用于 P. hawaiensis 编辑：通过将Cas9用无核酸酶水和酚红（用于可视化注射）稀释，制备一次性使用的Cas9分装液，终浓度为6.25 µM Cas9和0.15%酚红。
    1. 通过将2-5倍摩尔过量的gRNA与Cas9蛋白混合，总体积为6 µl，组装RNP复合物。向gRNA中加入12 pmol Cas9，使最终Cas9浓度为2 µM，gRNA浓度为4 - 8 µM，酚红浓度为0.05%。
    2. 室温孵育混合物10分钟，以形成RNP复合物。
    3. 请跳至第6步以查看接下来的说明 P. hawaiensis 编辑方案

2. 细胞培养与制备

注意：步骤 2.1.1 至 3.3.3 需在生物安全柜中进行。

  1. 从供应商处购买冻存的人类动员外周血CD34+ HSPCs。
    1. 在37 °C水浴中解冻约1 × 106个HSPCs，持续3分钟，然后转移至15 mL锥形管中。加入10 mL市售的无血清扩增培养基，以100 × g离心10分钟。弃去上清液，将细胞重悬于2 mL添加补充物的SFEM培养基中。将细胞接种至6孔板中，在37 °C培养箱中培养24–48小时，随后进行RNP电穿孔。
    2. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将所需总数的HSPCs（每比色皿电穿孔需150,000–200,000个HSPCs）转移至离心管中。
    3. 以100 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
  2. 从供应商处购买人原代CD4+ T细胞，或通过密度梯度离心法从人全血中分离获得29。
    1. 在T细胞活化前，预先用αCD3 (UCHT1) 和 αCD28 (CD28.2) 包被48孔培养板。在37 °C条件下，使用500 µL含10 µg/mL αCD3和10 µg/mL αCD28的PBS溶液包被，孵育至少2小时。
      注意：对于某些基因位点，无需预刺激即可实现NHEJ，但加入此步骤可最大化其效率。
    2. 将T细胞接种于包被有αCD3/αCD28抗体的48孔板中，在RPMI完全培养基[RPMI-1640补充5 mM HEPES、2 mM商用L-谷氨酰胺替代物、50 µg/mL青霉素/链霉素、50 µM 2-巯基乙醇、5 mM非必需氨基酸、5 mM丙酮酸钠和10% (vol/vol) FBS]中，于37 °C培养48小时。每孔加入500 µL培养基，接种密度为每孔2,000,000个T细胞。
    3. 使用血细胞计数板对T细胞进行计数，并将电穿孔实验所需总数的T细胞（每比色皿电穿孔需100,000–1,000,000个T细胞）转移至离心管中。
    4. 以90 × g离心8分钟，使细胞沉淀。若细胞在2天内已通过密度梯度法分离，则以200 × g离心8分钟。
  3. 对于两种细胞类型，均使用移液器或真空泵小心吸弃上清液，避免产生气泡。
    1. 每比色皿中加入20 µL电穿孔缓冲液，轻柔重悬细胞。
    2. 将20 µL细胞悬液（含150,000–200,000个HSPCs或100,000–1,000,000个T细胞）加入已含10 µL RNP的比色皿中，通过上下吹打充分混匀，避免产生气泡。

3. RNP 电穿孔

  1. 将电穿孔杯放入核转染仪后进行电穿孔。对于造血干细胞和祖细胞（HSPCs），使用脉冲代码 ER100；对于T细胞，使用脉冲代码 EH-115。
  2. 仅限HSPCs： 电穿孔后立即将100 µL补充了添加剂的SFEM培养基（预热至37 °C）加入每个比色皿中，让细胞恢复10–15分钟。
    1. 将细胞转移至96孔圆底培养板中，在补充了添加剂的SFEM培养基中继续培养24小时，额外加入100 µL培养基。
    2. 更换为新鲜的添加补充剂的SFEM培养基，并继续培养24至72小时。
    3. 在电穿孔后48-96小时收集细胞用于基因分型。在开始DNA提取（步骤8.2）前，以300 × g离心5分钟，弃去上清液。
  3. 仅T细胞：使用多通道移液器（如有需要），从储液器中向每个比色皿或孔中加入80 µL预热至37 °C的RPMI完全培养基。
    1. 在37 °C下孵育15分钟。
    2. 加入适当的培养基、抗体、细胞因子 等等。 转移到目标培养板并置于37 °C培养箱中预热。
    3. 使用多通道移液器（如有必要），将电穿孔后的细胞从孔中转移107 µL至圆底96孔板中。
  4. 有关评估编辑结果的信息，请跳至步骤8。

4. C. elegans 的制备

  1. 显微注射前一天：制备琼脂糖垫。
    1. 通过将琼脂糖加入水中，并在电热板或微波炉中加热至沸腾，制备3%（w/v）的琼脂糖水溶液。
    2. 将24 mm × 50 mm × 1.5 mm的盖玻片平放在桌面上，使用玻璃巴斯德吸管将少量（约15 µL）琼脂糖溶液滴加到盖玻片上。迅速将另一张盖玻片覆盖在液滴上将其压平。待琼脂糖凝固后，移除其中一张盖玻片。
    3. 将带有琼脂糖涂层的盖玻片正面朝上放置于桌面过夜干燥。24小时后，将琼脂糖垫存放在洁净干燥的容器中。
      注意：这些琼脂糖垫可长期使用。
  2. 拉制显微注射针：使用带内丝的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm），参照Mello和Fire57及其他文献方法58拉制注射针。注射针可立即使用，也可用黏土支架固定后存放在洁净干燥的容器中。
  3. 为维持线虫生长，准备倒入培养皿中的线虫生长培养基（NGM）琼脂，并接种OP50细菌（有关标准C. elegans培养方法及培养基配方，请参见Stiernagle59）。
  4. 为显微注射准备线虫：在显微注射前12–24小时，挑选L4期的雌雄同体线虫至新的含OP50细菌的NG-琼脂平板上，于20 °C过夜培养。针对每个Cas9靶点/注射混合物，每板挑选约30条线虫。
  5. 显微注射当天：将步骤1.5中制备的RNP溶液上清液装入已拉制好的显微注射针中。
    1. 用移液器将步骤1.5.4所得上清液吸入已拉制的毛细吸管中，并从毛细吸管向已准备好的显微注射针内反向填充溶液（通常加载量小于0.1 µL）。
  6. 将装有溶液的注射针安装到连接于显微操作器的显微注射装置上。设定注射压力为250 kPa，平衡压力为25 kPa。
  7. 回折已装液的注射针尖以形成锐利的针缘。将一块15 mm × 15 mm × 1.5 mm的方形盖玻片置于一块24 mm × 50 mm × 1.5 mm的盖玻片之上。
    1. 在方形盖玻片的一侧边缘覆盖卤代烃油700。
    2. 将注射针置于油中，位于15 mm方形盖玻片的边缘处。
    3. 用手控制显微镜载物台和盖玻片，将载玻片沿注射针边缘向上轻刷，同时踩下注射踏板/按钮。回折针尖，增加液体流出量。通过调节使注射液沿针缘稳定流出，形成约每秒1个气泡的流速，以达到最佳流速。
  8. 确认在显微注射前12–24小时挑选的L4期线虫在注射当天已发育为年轻的成虫。将年轻成虫转移至不含OP50细菌的NG-琼脂平板上，让其爬行约5分钟。此举可减少转移至注射垫的细菌量，从而降低针头堵塞风险。
  9. 将琼脂糖注射垫/盖玻片置于解剖显微镜载物台上。使用线虫挑取工具，在垫片一侧边缘涂抹一条细小的卤代烃油轨迹。
  10. 用涂有油的线虫挑取工具将数条线虫从NG-琼脂平板挑起并放入油迹中。使用连接在移液器上的细毛（如睫毛或猫须），将线虫平行排列，并轻轻将其推入琼脂糖垫中。在尚未熟练掌握显微注射操作前，建议每次仅固定并注射一条线虫。
    ​注意：干燥的琼脂糖会吸收线虫体表水分，导致其粘附于垫片上。因此操作需迅速，以防线虫脱水。
    1. 线虫定位并固定后，用线虫挑取工具尖端再滴加数滴卤代烃油（约20 µL）覆盖线虫。

5. 使用核糖核蛋白复合物对秀丽隐杆线虫（C. elegans）性腺进行显微注射及注射后护理

注意：显微注射方案改编自 Mello 和 Fire57，并在其他文献中有详细描述60,61。

  1. 将载有线虫的盖玻片放置于显微注射镜下。在低倍镜（5X物镜，10X目镜）下，使线虫与注射针垂直排列。
    1. 切换至高倍镜（40X物镜，10X目镜），重新调整针头位置，使其紧邻对应于中期至晚期粗线期细胞核区域的性腺臂。
    2. 使用显微操作器将针头推向线虫，轻微压陷角质层。然后，用一只手轻敲显微镜载物台侧面，使针头刺穿角质层。踩下注射踏板/按钮，缓慢将注射混合液注入性腺臂，随后撤出针头。
    3. 对另一侧性腺臂重复此步骤。
  2. 完成注射后，取下盖玻片/琼脂糖垫，将其转移至解剖显微镜下。
    1. 使用拉制的毛细移液管，通过在线虫上方滴加M9缓冲液以置换其周围的油滴。此操作可使线虫从琼脂中释放出来。
    2. 10分钟后，当线虫在缓冲液中剧烈游动时，使用拉制的毛细移液管将其转移至含有OP50细菌的NG-琼脂平板上。将平板置于20 °C环境中孵育2–3小时，直至线虫恢复活动。
  3. 恢复活动后，将每条线虫单独转移至含OP50细菌的NG-琼脂平板，并将平板转移至25 °C培养箱中。
  4. 让P0代注射线虫生长并产卵3天，随后筛选F1代子代。
    1. 若采用共CRISPR（co-CRISPR）或共转化（co-conversion）62,63,64,65策略，则根据参考基因是否出现突变表型来选择候选线虫进行筛选。将这些带有标记的线虫单独转移至新的含OP50细菌的NG-琼脂平板，于20 °C下使其产下F2代子代。
      注：用于共CRISPR筛选或选择的表型应能早期评估Cas9编辑是否成功。
    2. 若未观察到共CRISPR表型，可显微注射阳性对照质粒以帮助提高显微注射效率。
      注：例如，在注射混合液中加入编码mCherry标记的MYO-2的质粒，有助于评估注射效率。成功注射pCFJ90质粒的线虫，其部分子代将表现出咽部荧光。
  5. 检查F1代线虫是否携带目标编辑。挑选单个F1母本至96孔板的独立孔中，裂解该个体，并通过插入片段特异性PCR扩增、DNA测序分析或Surveyor核酸酶检测（CEL-1）66分析其DNA。
    注：这些检测方法适用于采用共CRISPR/共转化或其他筛选或选择策略时65,66,67,68。
  6. 如需了解编辑结果的评估方法，请跳至第8步。

6. P. hawaiensis 的制备

  1. 显微注射前一天，通过在前一晚设置“配对缸”来富集早期胚胎；新分离的雌性个体将含有新近受精的胚胎。详见 Rehm et al.69。
  2. 显微注射当天，通过在海水中使用 0.02% 丁香油麻醉怀卵雌性个体，用火焰拉制并磨圆的玻璃移液管和钝头 #3 镊子，轻轻从其腹侧育卵囊中刮取单细胞 Parhyale 胚胎（受精后 0–4 小时）。

7. P. hawaiensis 胚胎的RNP显微注射及注射后护理

  1. 用上述的RNP注射混合物回填拉制好的毛细管，体积约为1 µL。
  2. 使用压缩氮气对每枚胚胎进行显微注射，操作步骤详见 Rehm 方法 等69.
    1. 注射 Parhyale 使用显微注射仪和显微操作器，在解剖显微镜下对胚胎进行显微注射。用移液器吸头将1.5 µL注射混合液吸入拉制好的毛细管（4英寸-1.0 mm，带纤维丝，使用微玻管拉制仪拉制而成）尾部。
    2. 在解剖显微镜下，使用镊子将注射装置上的针头尖端轻轻折断（折断极小部分）。通过向卤代烃油700中注射并测量气泡直径，校准所递送的液体体积。
    3. 用剃刀片从固化剂中切出一个“槽”。加入一半体积的滤膜除菌海水，并沿其内壁贴合 Parhyale 将胚胎置于槽中以稳定。
    4. 使用显微注射装置注射胚胎，注射过程中用一对镊子固定每个胚胎。注射完成后，用玻璃转移移液管将胚胎转移至盛有半量滤膜除菌海水的新鲜60 mm培养皿中。
  3. 如果第一次分裂已经发生，形成二细胞胚胎（受精后4-6小时），则通过注射两个卵裂球来获得完全突变个体。为确保二细胞阶段完全分裂，可将FITC或TRITC葡聚糖与编辑试剂共同注射至卵裂球中，并在注射后于荧光体视显微镜下观察，确认信号仅局限于单个卵裂球。
    1. 或者，通过在2细胞期仅注射两个卵裂球中的一个，来产生“半突变”动物（根据组织类型及沿前后轴的位置，大致分为左右两部分）。
    2. 在受精后7.5-9小时的8细胞期胚胎中注射一个细胞，以将基因编辑限制在单一胚层。参见Gerberding 等70 用于早期卵裂球谱系的图谱。
  4. 将胚胎孵育于60 mm培养皿中（每皿不超过25枚），培养皿中加入半量经滤膜除菌的海水，并通过水族箱气泵曝气或剧烈摇晃进行“预充氧”。
    1. 将胚胎培养皿置于密封不严的塑料容器内，容器内衬浸湿的纸巾以维持湿度，并将容器放入26 °C、12小时光照-12小时黑暗循环的培养箱中。
    2. 每隔几天将存活的胚胎转移至干净的海水培养皿中。
      ​注意：胚胎可在室温下培养，但其发育速度会明显减慢。
  5. 在不同发育阶段解剖并固定胚胎，以进行表达分析 原位 杂交或抗体染色（参见Browne 等71 用于分期的指导，以及解剖与固定的附加参考文献72, 原位 杂交73以及抗体染色74).
    1. 使用约0.5英寸长的弯曲钨丝，将其插入胰岛素针头末端，制成解剖针。在电流作用下，将针头置于氢氧化钠溶液中进行 sharpening。采用1 mL注射器作为解剖针的手柄。
    2. 在3孔玻璃培养皿的一个孔中加入新配制的溶液至半满，溶液组成为9份PEM缓冲液（0.1 M PIPES，pH 6.95，2 mM EGTA，1 mM MgSO₄）4)，1 份 10× PBS 和 1 份 32% PFA。将 3–5 个胚胎放入培养皿中，使用锋利的钨针在每个胚胎上刺一个小孔，同时用稍钝的钨针固定胚胎以保持稳定，使卵黄流出并让固定液进入。
    3. 使用一对锋利的钨针，轻轻剥离环绕的最外两层膜 Parhyale 胚胎。在固定液中进行解剖，以增强胚胎的结构强度，但操作需迅速，防止膜与胚胎之间发生固定，否则将增加去膜难度。胚胎总体固定时间为15–20分钟（用于抗体染色）或40–50分钟（用于 原位 杂交。
  6. 对活体刚孵化的幼体进行成像，分析其形态学和行为表型；或对其进行固定和染色，以开展更详细的分析。将孵化的幼体饲养至性成熟，通常需要2-3个月，以建立基因敲除和转基因品系（参见 Kontarakis 和 Pavlopoulos）。75 用于幼体护理及其他有用信息。

8. 评估编辑结果

  1. 若适用，观察经编辑的细胞或生物体是否存在可视或功能性的表型。
    注意：此过程因具体应用而异，上述相关实验方案步骤末尾已描述若干示例。在对造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中的镰状细胞突变进行校正后，可通过高效液相色谱法（HPLC）分析分化所得成红细胞的血红蛋白生成情况（图1A）。通过细胞表面染色和流式细胞术可验证T细胞中IL-2受体基因的敲除效果（图1B）。为评估 C. elegans 和 P. hawaiensis 的表型，可在光学显微镜或荧光显微镜下观察动物的形态与行为（图1C 和 1D）。
  2. 为确定所产生基因组编辑的效率和类型，裂解经编辑的细胞混合群体，并使用商业化的DNA提取试剂盒提取其基因组DNA21。
  3. 为快速估计插入缺失（indel）的形成情况，以Cas9切割位点为中心，扩增至少200个碱基对的片段，并进行T7内切酶1（T7E1）76 或Surveyor（CEL-1核酸酶）检测77。
    1. 若Cas9切割位点处的插入缺失或成功的同源定向修复（HDR）会创建或消除已知的限制性酶切位点，可考虑使用限制性内切酶消化法来估算编辑效率6。若条件允许，限制性片段长度多态性（RFLP）分析是一种便捷的效率检测方法。
    2. 为准确量化编辑效率并确定主要的编辑结果，将PCR扩增产物使用正向和反向引物进行标准Sanger测序。
      注意：若分析单个克隆或个体，Sanger测序结果的分析较为简单，如 图2A 所示。若分析细胞混合群体，则需使用在线工具分析测序图谱，如 图2B 所示78。
    3. 为全面定量并获取编辑结果的具体序列信息，应进行深度测序27,54，如 图2C 所示。
    4. 为评估特定的一组脱靶改变，可对预测的脱靶位点进行PCR扩增，并送检下一代测序（NGS）。为检测染色体易位，可进行GUIDE-seq79 或高通量全基因组易位测序（HTGTS）80。为全面了解克隆群体中的脱靶编辑情况，应进行全基因组测序（WGS）81,82,83。
      注意：目前已有多种方法用于量化靶向和脱靶基因组编辑，相关综述文章对此有进一步说明84,85,86。

结果

这些实验展示了如何利用预先组装的 Cas9 核糖核蛋白复合物（RNP）对原代细胞和完整生物体的基因组进行操作。研究人员纯化或购买 Cas9 蛋白与单导向 RNA（sgRNA），将这两种组分混合以预先形成复合物，并将该 RNP 导入目标细胞或生物体中。在给予足够时间以完成基因编辑并产生下一代后代（如适用）后，检测表型和/或收集细胞进行基因分型。根据实验设计，可通过功能检测、表达分析、肉眼或显微镜观察，或其他方法观察表型。

例如，经过基因编辑以纠正导致镰状细胞病的β-珠蛋白突变的造血干细胞和祖细胞，可被诱导分化为红细胞，并检测其是否产生正常血红蛋白或镰状血红蛋白27,87 (图1A). 敲除高亲和力IL-2受体基因CD25的T细胞IL2RA可通过表面染色和流式细胞术进行分析88，并通过功能分析检测对IL-2刺激的信号响应（图1B。T细胞还可通过多种具有重要临床意义的方式进行重编程，这些方式需要评估不同的表型，包括HIV感染的有效性89 以及 体内 CAR-T细胞的抗肿瘤功效11.

采用共CRISPR/共转化筛选策略，可同时对 C. elegans 蚓在两个位点进行基因编辑62。利用ssODN修复模板在参考基因 dpy-10 处进行HDR，可产生易于观察的显性 dpy-10 功能获得性突变。杂合的F1 dpy-10(gof) 个体表现为滚动表型（Rol），而纯合的 dpy-10(gof) 个体则表现为矮胖表型（Dpy）。该表型的出现表明Cas9已在这些个体中成功编辑，从而提高了在Rol或Dpy的F1个体中鉴定出第二个位点编辑事件的概率。一次成功的编辑实验中，应有33–50%的注射P0个体产生20个或更多具有Rol或Dpy表型的F1后代90。随后可选择非Rol个体，使 dpy-10 恢复为野生型，并筛选目标基因的纯合编辑子。一般经验法则是，靶向共CRISPR参考基因的crRNA浓度应为目标基因crRNA浓度的一半。若未能获得目标基因的编辑，可调整两种CRISPR RNA的比例，以提高获得目标突变的可能性。例如，相对于参考基因的crRNA，增加目标基因crRNA的用量，可提高在同时具有参考基因位点编辑的虫群中，目标基因发生编辑的个体比例。共转化频率存在差异，但通常为20–60%，常可在F1代获得纯合编辑（图1C）。

P. hawaiensis 孵化幼体经基因编辑敲除Abdominal-B基因（Abd-B）后表现出明显的形态学异常3（图1D）。该基因对腹部正确模式形成至关重要，其功能缺失会导致原本应出现在腹部的游泳足和锚定足被胸节类型的跳跃足和行走足所取代。

在基因型水平上确定基因组编辑结果需要进行测序或采用其他相应方法 体外 检测序列变化的实验方法。在此，我们展示了来自模式细胞类型和生物体的代表性测序数据，重点说明了不同编辑效率定量分析方法。请注意，图中标签为通用化表示，因为此处展示的所有方法均可适用于任何生物系统。

基于测序的分析方法在技术复杂性和结果深度方面各不相同。对于克隆性编辑群体或易于分离的个体生物，可在提取基因组DNA后对编辑个体进行测序。标准的Sanger测序结果将揭示特定个体中Cas9切割位点的序列变化，并可推测可能破坏其功能的移码突变（图2A）。另一种基于Sanger测序的方法是使用在线工具，适用于混合群体而非单个突变体78。该工具可通过在线分析估算总体编辑效率以及主要的序列编辑结果。代表性数据如图2B所示。

此处描述的最全面的测序方法是深度测序（有时称为高通量测序或下一代测序）。该方法可从混合群体中的单个基因组获取DNA序列。此类数据可以通过多种方式展示。在此，我们根据编辑结果对来自编辑细胞的单个测序读段进行了分类（图2C）。大多数细胞通过NHEJ通路被编辑，这通常导致基因功能破坏。在其他细胞中，目标基因则通过HDR被替换为另一种版本27。

基因编辑方法表格；HSPCs、T细胞、秀丽线虫、夏威夷嗜皮菌；测序与分析。
表1：初步基因组编辑实验的阳性对照。本表列出了在本实验方案所述的每种细胞和生物中首次进行基因组编辑实验所需的关键信息。遵循这些参数通常可获得成功的结果，可用于验证实验流程，或作为研究者后续针对自身感兴趣基因进行编辑时的基准对照。F：正向，R：反向，HDR：同源定向修复。请点击此处下载该表格。

HSPCs HBB, T细胞 CD25, C. elegans yfg, P. hawaiensis Abd-B 表型评估示意图。
图1：Cas9 RNP编辑人原代细胞及模式生物后的代表性表型结果。（A） 此图为高效液相色谱（HPLC）图谱，显示基因组编辑成功后，分化为晚期成红细胞的人造血干细胞和祖细胞（HSPCs）产生的功能性血红蛋白多于镰状血红蛋白。突变红细胞产生镰状血红蛋白（HbS），而成功编辑的细胞则可产生健康血红蛋白（HbA 和 HbA2）以及胎儿血红蛋白（HbF）。吸光度以任意单位（au）表示。该图首次发表于 DeWitt 等人27，经美国科学促进会许可转载。（B） 左侧图示显示，在每种实验条件下，经表面染色的T细胞在使用RNP敲除CD25基因后不再表达CD25的流式细胞术数据。CD25丰度显示在x轴，细胞大小显示在y轴。右侧图示显示在IL-2诱导后，各条件下的磷酸化Stat5（pStat5）定量结果。当IL-2受体缺失（CD25基因敲除）时，信号通路显著减弱。pStat5丰度显示在x轴，三组不同浓度IL-2刺激下的数据在垂直方向上进行比较。（C） 该图示展示了一项针对Caenorhabditis elegans的共CRISPR/共转化筛选实验，以dpy-10作为共转化标记。两条向导RNA在同一P0代显微注射动物中分别靶向dpy-10和目标基因（yfg）。在dpy-10位点发生HDR（同源定向修复）后，产生Rol或Dpy表型。筛选出Rol或Dpy表型的F1代个体，可显著提高在第二个靶位点检测到基因编辑事件的概率。（D） 该图示显示野生型Parhyale hawaiensis幼体具有正常腹部结构，带有游泳肢和锚定肢。而Abd-B基因敲除的幼体（F0个体）腹部向胸节转化，导致游泳肢和锚定肢消失，并被与正常胸节相关的跳跃肢和行走肢所取代。请点击此处查看该图的放大版本。

基因编辑分析；包括Sanger测序、TIDE、深度测序；CRISPR Cas9编辑结果。
图2：编辑结果分析方法的典型结果。（A）本图展示了来自单个F1 P. hawaiensis个体的Sanger测序结果示例，包括野生型序列以及三种通过移码突变破坏基因功能的不同插入缺失（indel）。（B）这些TIDE结果展示了在一批测序的T细胞中，Cas9靶位点处发生的插入和缺失事件的范围。横轴表示特定插入或缺失的核苷酸长度。（C）这些深度测序结果表明，在未进行核转染或未使用gRNA的情况下无基因组编辑发生，而在HSPCs中使用完整的Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）可实现成功的基因编辑，结果按DNA修复类型分组。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在目标细胞系或生物体中建立可靠的基因组编辑方案，需要对本节讨论的多个关键参数进行优化和实证测试。强烈建议尝试此处提供的通用方法的若干变体。本方案的主要局限性在于，将这些方法应用于其他细胞或生物体时，结果可能因所研究物种的不同而有所差异；此外，能够实现高效基因敲除的实验设计，未必能促进DNA插入。因此，我们建议从本文所述方法入手，并按照下文所述进行问题排查与优化。

基因编辑试剂质量的故障排除：
生成或购买高质量的试剂是任何基因编辑实验方案中的关键步骤。Cas9 蛋白可在实验室中纯化，也可从商业途径获得。许多实验方案中会注明核糖核蛋白（RNP）配制中 Cas9 的终浓度，但最佳的基因编辑活性取决于每批 Cas9 蛋白制备物的特异性活性，而该活性因来源不同而有所差异。在成功运行本文所述方案后，建议通过滴定 Cas9 的用量来优化所用 RNP 的量，以确定最佳浓度：即在实现高效特异性靶标 DNA 切割的同时，避免因 Cas9 过量导致不必要的脱靶切割40。

向导RNA的纯度和均一性也可能是基因组编辑成功与否的决定因素22购买的sgRNA或单独的crRNA与tracrRNA组分通常是高质量的试剂，且提供多种化学修饰选项，可用于解决RNA降解问题或为核糖核蛋白复合物（RNP）赋予额外特性91尽管在常规基因组编辑实验中可能无需使用化学修饰的gRNA，但一些研究团队发现，使用此类试剂可显著提高编辑效率。因此，在熟练掌握实验流程后，或当gRNA降解问题较为明显时，尝试化学修饰的gRNA可能是值得的。22,91. 体外 转录后进行凝胶纯化是一种经济的替代方法，对于常规基因组编辑实验可能已足够17,21,49,50此外，有几种常用方法可用于制备均一的gRNA群体 体内包括基于核酶和tRNA的单个向导RNA切除方法，可扩展应用于 体外 RNA制备以获得更纯净的产物92.

向导RNA与供体DNA设计技巧：
向导RNA的选择是实现高效靶向编辑并最大限度降低脱靶切割风险的关键因素。为辅助向导RNA的筛选，多项研究已采用高通量筛选结合下一代测序技术，以整合高效向导RNA的序列特征47,79,93,94,95,96这些特征已被用于开发预测算法和在线工具，以辅助向导序列的选择44,45,46,47,48此类算法基于使用DNA系统进行向导RNA表达的筛选。向导RNA通过Pol III启动子表达，因此容易受到Pol III转录相关局限性的影响，例如在遇到连续尿嘧啶序列时可能发生提前终止97,98,99然而，使用由RNPs制备的 体外合成的引导RNA可规避上述问题，并简化了引导序列设计的限制条件。这些算法得出的一个共同特征，已在多种生物体的高效基因组编辑研究中得到验证，即引导序列靶向特异性区域的3′端倾向于存在一个嘌呤，尤其是鸟嘌呤。这一引导序列特征在从哺乳动物到其他生物的多种生物体中均表现出显著有效性。 秀丽隐杆线虫果蝇和斑马鱼65,100,101此外，对于 秀丽隐杆线虫在设计向导RNA时，使其靶向区域的3′端包含一个GG二核苷酸，是预测高效向导RNA的有效策略65理想情况下，应平行测试多个向导序列，以确定哪种向导在特定应用中效果最佳。

在尝试将DNA序列导入基因组时，供体或模板DNA的设计也至关重要。单链寡核苷酸供体（ssODNs）比其他常见的修复模板（如线性双链DNA和质粒DNA）更可靠地插入54,55,102。在某些基因位点，使用与非靶向链或被置换DNA链互补、且具有不对称长度同源臂的ssODNs可提高HDR效率27,55。由于修复模板将被插入到切割位点，并包含靶向序列，因此必须采取措施防止Cas9在基因组插入前后切割供体DNA。这可通过在PAM序列或种子区域引入同义突变来实现，在避免Cas9识别的同时保留插入基因的功能21,103。尽管仅单个核苷酸的PAM改变就可能完全消除Cas9结合104，但仍建议至少改变四个核苷酸以确保安全。

意义与未来应用：
利用 CRISPR-Cas9 进行基因组编辑已成为一种强大的方法，可实现对任何生物体的便捷遗传操作。尽管 Cas9 RNP 编辑在初期需要更多准备工作，但一旦实验室建立了相应的试剂和实验方案，其使用将变得十分简便。与使用质粒 DNA 相比，采用预先组装的 RNP 对细胞进行编辑可实现更高的整体编辑效率，包括通过同源定向修复（HDR）实现的较难完成的基因插入，并且脱靶效应更少24,25,26,27,29。此外，实验人员可避免因在细胞内分别合成 gRNA 与 Cas9 分子而导致的基因表达、RNA 降解、蛋白质折叠以及二者结合效率等问题22,23。RNP 编辑还可规避在临床应用中使用病毒递送方法时可能出现的插入突变和持续表达所带来的安全性问题14。由于这些优势，许多开展临床前概念验证实验的科学家更倾向于采用 RNP 编辑用于人类治疗。目前，基于 RNP 的体内（in vivo）和体外（ex vivo）基因组编辑策略正在开发中，旨在治疗甚至治愈多种疾病，包括杜氏肌营养不良症105和镰状细胞病27等遗传性疾病，以及 HIV29和癌症11。有趣的是，Cas9 RNP 越来越多地被用作农业工程中的递送手段，因为它能够实现植物的“无 DNA”编辑33,34,36。

披露

作者 Alexander Marson 和 Jacob E. Corn 是 Spotlight Therapeutics 的联合创始人。Jacob E. Corn 担任 Mission Therapeutics 的顾问，其实验室已获得阿斯利康（AstraZeneca）和辉瑞（Pfizer）的资助研究支持。Alexander Marson 担任 Juno Therapeutics 和 PACT Therapeutics 的顾问，其实验室已获得 Juno Therapeutics、 Epinomics、 和赛诺菲（Sanofi）的资助研究支持。其实验室还就 Cas9 RNP 技术申请了相关专利。

致谢

我们感谢实验室众多前成员以及湾区基因组编辑领域社区为这些方法的开发所做出的贡献。我们感谢 Ross Wilson 对本文手稿的审阅。

Alexander Marson 的研究得到了 Jake Aronov 捐赠以及美国国家多发性硬化症学会资助（CA 1074-A-21）的支持。Alexander Marson 获得了伯勒斯·威康基金（Burroughs Wellcome Fund）授予的医学科学家职业奖，并且是陈·扎克伯格生物中心（Chan Zuckerberg Biohub）研究员。Jacob E. Corn 的研究得到了李嘉诚基金会、遗产医学研究所（Heritage Medical Research Medical Institute）以及加州再生医学研究所的支持。Behnom Farboud 和 Barbara J. Meyer 的研究部分由美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）资助项目 R01 GM030702 支持，Barbara J. Meyer 同时也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。Erin Jarvis 和 Nipam H. Patel 的研究部分由美国国家科学基金会（NSF）资助项目 IOS-1257379 支持，Erin Jarvis 还获得了 NSF 研究生奖学金（GRFP）以及 Philomathia 研究生奖学金的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
DNA寡核苷酸Integrated DNA Technologies-IDT将提供定制DNA序列，包括表1中的序列
向导RNA（gRNA）Synthego-Synthego将提供高质量的S. pyogenes Cas9用sgRNA，包括含有表1中靶向序列的定制sgRNA
纯化的Cas9蛋白（EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes）New England BiosciencesM0646T如有可能，自行纯化Cas9或从本地核心设施购买是成本较低的选择
正常外周血CD34+干细胞/祖细胞AllCellsPB032-2
StemSpan SFEM StemCell Technologies09650
StemSpan CC110StemCell Technologies02697
P3原代细胞4D-核转染X试剂盒LonzaV4XP-3032
RPMI-1640培养基，含碳酸氢钠，不含L-谷氨酰胺，液体SigmaR0883-6X500ML
EasySep™人T细胞分离试剂盒Stemcell17951
细胞培养板，96孔，圆底Fisher Scientific3799
CTS（细胞治疗系统）Dynabeads CD3/CD28Life Tech40203D 
重组人IL-2UCSF药房NA
SepMate-50 500个装 IVDStemcell Technologies85460
OP50 Escherichia coli线虫遗传学中心OP-50https://cgc.umn.edu/
含线虫生长培养基的琼脂培养皿--参见Stiernagle T（参考文献59）
带细丝的标准硼硅酸盐玻璃毛细管： 4英寸（100 mm），外径/内径1/0.58World Precision Instruments1B100F-4
单通道标准硼硅酸盐玻璃毛细管：6英寸（152 mm），外径/内径2/1.12 World Precision Instruments1B200-6 
盖玻片；24 × 50 mmThermo Fisher Scientific12-544E
盖玻片；22 × 22 mmThermo Fisher Scientific12-518-105K
Apex LE琼脂糖Genesee Scientific20-102
卤碳油700Sigma-Aldrich H8898-100ML
pCFJ90质粒Addgene19327
压缩氮气-
60 mm培养皿BD
带细丝的毛细管：4英寸（1.0 mm） World Precision InstrumentsT2100F-4
Sylgard 184Dow Corning
培养皿（100 × 15 mm）-
钨丝（直径0.005英寸）Ted Pella
全氟烷氧基烷烃（PFA）-
海水盐-
9"巴斯德移液管-
酚红-
无核酸酶水-
设备
4D核转染仪LonzaAAF-1002X
MZ75 体视显微镜Leica 已停产。当前型号为M80体视显微镜
Axio Vert35倒置相差荧光显微镜Zeiss已停产。当前型号为Axio VertA.1
基于激光的微移液管拉制仪（用于秀丽隐杆线虫实验方案）Sutter Instrument FG-P2000
皮升级微注射仪（用于秀丽隐杆线虫实验方案）Warner InstrumentsPLI-100A
三轴操纵杆油压微操纵器Narishige InternationalMO-202U
粗调操纵器Narishige InternationalMMN-1
微移液管拉制仪（用于夏威夷短尾乌贼实验方案）Sutter Instrument P-80/PC
微注射仪（用于夏威夷短尾乌贼实验方案）NarishigeIM300
Microloader移液器吸头Eppendorf5242956003
NG-琼脂

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CRISPR Cas9 RNA T Parhyale
利用Cas9核糖核蛋白在多种细胞和生物体中实现增强的基因组编辑
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