脂质丰度的定量与脂质分布的评估 秀丽隐杆线虫 通过尼罗红和油红O染色

摘要

对固定后的Caenorhabditis elegans进行尼罗红染色是一种定量检测中性脂质沉积的方法，而油红O染色则有助于定性评估脂质在不同组织中的分布情况。

摘要

Caenorhabditis elegans 是研究脂质代谢和能量稳态的优秀模式生物。其许多脂质相关基因在人类中具有保守性，并与代谢综合征或其他疾病相关。对该生物体内脂质积累的检测可通过固定性染料或无标记方法进行。固定性染料如尼罗红和油红O是经济可靠的方法，可分别用于定量测定脂质水平和定性观察脂质在组织中的分布情况。此外，这些染料适用于对多种脂质代谢基因和通路进行高通量筛选。它们的疏水特性有助于脂质溶解，减少与周围组织的相互作用，并防止染料解离至溶剂中。尽管这些方法在检测总体脂质含量方面效果显著，但无法提供关于脂质沉积物化学组成及多样性的详细信息。针对此类需求，尽管成本较高，无标记方法如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和相干反斯托克斯拉曼散射显微镜（CARS显微镜）则更为适用。

引言

脂质对生命至关重要。它们是细胞膜的组成成分，可作为第二信使和信号转导分子，并在能量储存中发挥关键作用。当脂质代谢失调时，会导致肥胖和2型糖尿病等疾病，这些是当前重要的公共卫生问题⁹。Caenorhabditis elegans（C. elegans）是研究脂质代谢的优良模式生物，因其具有相对较短的生命周期、透明的身体、已知的细胞谱系以及完全测序的基因组。C. elegans 主要为雌雄同体，使研究人员能够在短时间内培育大量同基因型个体，从而开展高通量的正向遗传筛选，以研究多种代谢相关基因和通路⁴。该方法已揭示，在人类、小鼠、大鼠和果蝇中，有273个 C. elegans 脂质代谢基因具有高度保守性。此外，C. elegans 中超过300个脂质基因具有与非代谢综合征相关疾病相关的人类直系同源基因¹¹。传统上，对 C. elegans 中脂质储存的研究主要依赖染料标记检测法，该方法可提供关于脂质积累的可靠信息。然而，关于脂质在组织中的定位及其丰度差异的描述则较少见。但近期研究表明，脂质分布的重要性可能与脂质积累相当⁶。

近年来，研究开始整合高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、气....

方案

1. 脂质的尼罗红（NR）染色

1. 5 mg/mL NR 储存液的制备
   1. 在 500 mL 瓶中，将 100 mg NR 粉末加入 200 mL 100% 丙酮中。
   2. 用铝箔包裹瓶体，避免接触任何光线。
   3. 使用前，在避光条件下搅拌溶液 2 小时。
   4. 长期使用时，将 NR 储存液保存在密封严密、避光的瓶中。根据研究需要调整 NR 储存液的配制量。为获得一致的染色和成像结果，所有 NR 染色实验应使用同一批次的储存液。
2. NR 工作液的制备
   1. 每 1 mL 40% 异丙醇（v/v），加入 6 µL NR 储存液。
   2. 每个样品准备 600 µL NR 工作液。
      注意：染色前现配 NR 工作液。根据所需 NR 储存液的体积，选用 15 mL 或 50 mL 带刻度的锥形管。
3. 线虫 NR 脂质染色前处理
   1. 在接种了对数晚期 OP50 大肠杆菌（E. coli）的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至早期 L4 阶段。
   2. 用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液 + 0.01% Triton X-100（PBST）溶液将线虫从培养板上冲洗下来，并将线虫悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
   3. 以 560 ....

结果

SKN-1 是一种 bZip 类细胞保护性转录因子，与哺乳动物的 NRF2 具有同源性，并已被证明可介导脂肪酸氧化。根据饮食中葡萄糖浓度的不同，携带组成型激活 skn-1 等位基因的线虫在经尼罗红染色后表现出不同的脂质水平⁷。图 1A-C 展示了在导致脂质水平升高的条件下，skn-1 激活型动物的表型。使用 FITC/GFP 通道捕获的尼罗红荧光在肠道区域明显，而在头部、尾部及肠腔中较弱。随着脂质水平升高，尼罗红染色的颗粒变得难以分辨，可能需要缩短曝光时间。尽管该方法使用荧光强度作为脂质积累的定量替代指标，但其无法有效区分非脂质储存结构的非特异性染色，且易受肠道自发荧光的信号干扰。因此，必须并行使用其他标记或非标记方法，以明确量化动物体内的中性脂质¹⁰。

讨论

肥胖症和代谢性疾病发病率的上升使得C. elegans成为研究调控细胞和组织中脂肪积累机制的合适模型。最近的研究表明，脂质水平的变化与多种细胞过程相关，包括胰岛素信号传导⁸、激素受体的激活²以及生殖输出⁵。与无标记显微镜和色谱法相比，尼罗红（Nile red）和油红O（oil red O）是相对廉价的染料，可用于在蠕虫中稳定且可重复地染色中性脂质^10,12,13。前者可用于定量总脂质水平，后者则有助于评估脂质在表皮、肠道和生殖系等组织中的分布情况。当联合使用时，NR和ORO使研究人员能够确定基因型和环境变化如何影响脂质积累，以及这些变化在蠕虫体内的具体发生位置。

然而，这些染料无法像CARS显微镜那样以非侵入性方式直接评估脂质积累

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Imager.M2m 显微镜	Zeiss	n/a	荧光显微镜
ERC5s 相机	Axiocam	n/a	彩色成像功能
MRm 相机	Axiocam	n/a	荧光成像功能
Nile red	Thermo Fisher	N1142	脂质染色剂
Oil red O	Alfa Aesar	A12989	脂质染色剂
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA 染色剂
异丙醇	BDH	BDH1133-1LP	固定液
0.2 µm 无菌注射器滤器	VWR	28145-477	醋酸纤维素滤膜
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	离心机
Shaker Rotisserie	Lab Quake	400110Q	摇床
Tube Rotator	VWR	10136-084	旋转混合器
K2HPO4	Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
胆固醇	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
蛋白胨	BD Biosciences	211677	NGM
琼脂	Teknova	L9110	NGM
LB 培养基	Sigma-Aldrich	L3147	细菌培养