对固定后的Caenorhabditis elegans进行尼罗红染色是一种定量检测中性脂质沉积的方法，而油红O染色则有助于定性评估脂质在不同组织中的分布情况。
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摘要
摘要
Caenorhabditis elegans 是研究脂质代谢和能量稳态的优秀模式生物。其许多脂质相关基因在人类中具有保守性，并与代谢综合征或其他疾病相关。对该生物体内脂质积累的检测可通过固定性染料或无标记方法进行。固定性染料如尼罗红和油红O是经济可靠的方法，可分别用于定量测定脂质水平和定性观察脂质在组织中的分布情况。此外，这些染料适用于对多种脂质代谢基因和通路进行高通量筛选。它们的疏水特性有助于脂质溶解，减少与周围组织的相互作用，并防止染料解离至溶剂中。尽管这些方法在检测总体脂质含量方面效果显著，但无法提供关于脂质沉积物化学组成及多样性的详细信息。针对此类需求，尽管成本较高，无标记方法如气相色谱-质谱联用（GC-MS）和相干反斯托克斯拉曼散射显微镜（CARS显微镜）则更为适用。
引言
脂质对生命至关重要。它们是细胞膜的组成成分，可作为第二信使和信号转导分子，并在能量储存中发挥关键作用。当脂质代谢失调时，会导致肥胖和2型糖尿病等疾病，这些是当前重要的公共卫生问题9。Caenorhabditis elegans（C. elegans）是研究脂质代谢的优良模式生物，因其具有相对较短的生命周期、透明的身体、已知的细胞谱系以及完全测序的基因组。C. elegans 主要为雌雄同体，使研究人员能够在短时间内培育大量同基因型个体，从而开展高通量的正向遗传筛选，以研究多种代谢相关基因和通路4。该方法已揭示，在人类、小鼠、大鼠和果蝇中，有273个 C. elegans 脂质代谢基因具有高度保守性。此外，C. elegans 中超过300个脂质基因具有与非代谢综合征相关疾病相关的人类直系同源基因11。传统上，对 C. elegans 中脂质储存的研究主要依赖染料标记检测法，该方法可提供关于脂质积累的可靠信息。然而，关于脂质在组织中的定位及其丰度差异的描述则较少见。但近期研究表明，脂质分布的重要性可能与脂质积累相当6。
近年来，研究开始整合高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）以及相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微镜等方法，分别通过直接分析脂质提取物、特定脂质组分和脂质沉积物来弥补基于染色方法的不足10,11。此外，CARS显微镜研究表明，尼罗红仅在作为固定染料使用时才能可靠地指示脂肪积累，而作为活体染料使用时会导致对自发荧光细胞器的非靶向性染色10。然而，这些色谱和显微镜技术所需的专业技术知识和高昂成本，使其在许多研究问题中难以推广应用。本文介绍一种简便且可靠的方法，利用尼罗红和油红O对秀丽隐杆线虫（C. elegans）中的中性脂质沉积进行固定和染色，以区分整体生物体及特定组织中的脂质丰度。
尼罗红（Nile red），即9-二乙氨基-5H-苯并[α]吩噁嗪-5-酮，是一种苯并吩噁嗪类染料，易溶于多种有机溶剂，但在水中几乎不溶。它是一种优良的脂溶性染料，常用于染色中性脂质，如甘油三酯或胆固醇酯，因其具有强着色性、在脂质中溶解性良好、与周围组织相互作用微弱，且在溶剂中的溶解度低于在脂质中的溶解度。其激发波长和发射波长最大值分别为450-500 nm和520 nm1。在观察经尼罗红染色的C. elegans绿色荧光时，可根据动物的基因型或实验处理条件，在肠道及其他组织中观察到呈簇状或均匀分布的离散脂滴7。
油红O是一种溶酶体染料，为脂溶性染料，用于染色甘油三酯和脂蛋白。由于其化学结构中含有两个连接在三个芳香环上的偶氮基团，因此被称为偶氮染料。该染料难以电离，因而对脂质具有高度溶解性。其染色呈红色，最大光吸收波长为518 nm3。C. elegans经油红O染色后，脂滴呈红色，在动物透明的身体背景下清晰可见，便于对不同组织间的脂质分布进行定性评估6。
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方案
1. 脂质的尼罗红（NR）染色
- 5 mg/mL NR 储存液的制备
- 在 500 mL 瓶中，将 100 mg NR 粉末加入 200 mL 100% 丙酮中。
- 用铝箔包裹瓶体，避免接触任何光线。
- 使用前，在避光条件下搅拌溶液 2 小时。
- 长期使用时，将 NR 储存液保存在密封严密、避光的瓶中。根据研究需要调整 NR 储存液的配制量。为获得一致的染色和成像结果，所有 NR 染色实验应使用同一批次的储存液。
- NR 工作液的制备
- 每 1 mL 40% 异丙醇（v/v），加入 6 µL NR 储存液。
- 每个样品准备 600 µL NR 工作液。
注意：染色前现配 NR 工作液。根据所需 NR 储存液的体积，选用 15 mL 或 50 mL 带刻度的锥形管。
- 线虫 NR 脂质染色前处理
- 在接种了对数晚期 OP50 大肠杆菌（E. coli）的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至早期 L4 阶段。
- 用 1 mL 1× 磷酸盐缓冲液 + 0.01% Triton X-100（PBST）溶液将线虫从培养板上冲洗下来，并将线虫悬液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，重复此步骤直至悬液中无 E. coli 残留。
- 向线虫沉淀中加入 100 µL 40% 异丙醇，在室温下孵育 3 分钟。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，注意不要扰动线虫沉淀。
注意：若使用较大培养板或每板染色更多线虫，应增加 PBST 用量以充分冲洗线虫。线虫固定前，PBST 清洗时间不应超过 15 分钟。若上清液中细菌未完全清除，需增加清洗次数。在 40% 异丙醇中的孵育步骤应使用旋转混合仪（nutator）或摇床进行。始终监控离心管，确保样品充分混匀。
- NR 脂质染色
- 在避光条件下，向每个样品中加入 600 µL NR 工作液，轻轻颠倒离心管三次，使线虫在 NR 溶液中充分混匀。
- 在室温避光条件下旋转孵育 2 小时。
- 孵育结束后，以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液。
- 加入 600 µL PBST，在避光条件下孵育 30 分钟，以去除多余的 NR 染料。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，弃去上清液，仅保留约 50 µL 上清液。
注意：NR 孵育步骤无需振荡。此过程中线虫沉淀是正常现象。
- 显微镜成像载玻片的制备
- 将线虫沉淀用剩余上清液重悬。
- 取 5 µL 线虫悬液滴加于显微镜载玻片上，小心盖上盖玻片，避免产生气泡。
- 成像前用指甲油密封盖玻片边缘。
- 每次仅制备少量载玻片，以确保各样品间 NR 成像条件一致。NR 染色样品的图像质量在 6 小时后逐渐下降，脂滴结构变得难以分辨，背景荧光增强，干扰 NR 信号的检测。
- NR 染色线虫的成像
- 以 5× 放大倍数成像，使每个视野中包含多个个体。
- 切换至 10× 放大倍数，以便更准确地对单个线虫进行定量分析。
- 使用 FITC/GFP 通道对 NR 染色线虫进行成像，并尝试不同曝光时间，以确定最佳定量条件。
- 将文件保存为 TIF 格式，避免因压缩导致数据丢失。
注意：典型曝光时间范围为 100–1000 ms。确定最佳曝光时间后，所有样品均应使用相同参数，以保持成像一致性。
- NR 染色图像的定量分析
- 将显微图像上传至 ImageJ 软件。若图像文件未被识别，可在 Plugins 下拉菜单中使用 Bio-Formats 功能。
- 在 Image 下拉菜单中，通过 Stacks 功能下的 Images-to-Stack 选项，将多张显微图像合并为图像栈。
- 在同一菜单中，调整图像栈的亮度/对比度，并点击 Apply 以将更改应用至所有图像。
- 使用多边形选择工具（Polygon selection tool）勾勒每个成像线虫的轮廓，并通过 Analysis 下拉菜单中的 Measure 功能，量化 NR 发出的荧光强度。
- 对每张图像，测量五个背景区域，计算平均背景荧光强度。
- 使用公式 N = G - (A × B) 从每个线虫的总荧光强度中扣除背景信号，其中 N 代表净荧光强度，G 代表总荧光强度，A 代表线虫总面积，B 代表平均背景荧光强度。
- 为根据线虫大小对荧光强度进行归一化处理，将每个线虫的净荧光强度除以其总面积。结果以每像素的任意单位（a.u.）荧光强度表示。
注意：避免将图像导出为 JPEG 格式。尽管该格式可减小文件体积，但会损害数据完整性。确保所有图像经过相同的处理和分析流程。务必添加比例尺，以便在不同放大倍数下准确评估尺寸。为在 ImageJ 中更清晰地显示荧光强度差异，可将图像类型从 RGB 转换为 8 位，并在图像查找表（LUT）菜单中选择 Fire 选项。此操作将生成热图图像，其中颜色亮度越高表示荧光强度越强。
2. 脂质的油红O染色（ORO）
- ORO 储存液的制备
- 在 250 mL 的瓶子中，将 500 mg ORO 粉末加入 100 mL 100% 异丙醇中，并充分混匀。
- 配制完成后，将溶液密封保存，避免光照。
- ORO 工作液的制备
- 将 ORO 储存液按 3:2 的比例用水稀释，得到 60% 的异丙醇溶液。
- 使用前，用 0.2 µm 醋酸纤维素无菌注射滤器过滤 ORO 工作液。
注意：为获得最佳溶液质量，建议在使用前一天配制 ORO 工作液，并过夜混匀。若需当天配制，则稀释后在摇床中混匀至少 2 小时。摇动前，用石蜡膜包裹锥形管，防止 ORO 溶液泄漏。
- 用于 ORO 脂质染色的线虫制备
- 在接种了对数后期 OP50 E. coli 的线虫生长培养基（NGM）上，于 20 °C 培养线虫至所需发育阶段。
- 向培养皿中加入 1 mL PBST 溶液，轻轻旋转使所有线虫脱离培养基表面。倾斜培养皿，再用 1 mL PBST 冲洗一次。将线虫悬液转移至 1.5 mL 微离心管中。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，小心去除上清液，保留沉淀。用 1 mL PBST 重复洗涤三次，每次均去除上清液，最后仅保留 100 µL 上清液。
- 向线虫沉淀中加入 600 µL 40% 异丙醇，在室温下摇动 3 分钟。
- 以 560 × g 离心 30 秒，去除上清液，仅保留 100 µL，注意不要破坏线虫沉淀。
注意：若进行高通量染色，可使用更大体积的 PBST 将线虫从培养皿中洗下。在固定样品前，不要提前超过 15 分钟用 PBST 洗涤线虫。若上清液中仍有细菌残留，应增加洗涤次数。在 40% 异丙醇中的孵育步骤应使用旋转混合仪或摇床进行。始终监控离心管，确保样品充分混匀。
- 使用 ORO 进行脂质染色
- 向每个样品中加入 600 µL ORO 工作液，轻轻颠倒离心管三次，使线虫在 ORO 溶液中充分混匀。
- 在室温下以 30 rpm 转速旋转孵育 2 小时。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，去除上清液，仅保留 100 µL。
- 用 600 µL PBST 重悬样品，在 30 rpm 转速下旋转 30 分钟，以去除多余的 ORO 染料。
- 以 560 × g 离心 1 分钟，去除上清液，仅保留 50 µL。
- 为更清晰地区分动物生殖系和肠细胞的位置，可在每 1 mL ORO 工作液中加入 1 µL 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行染色。在载玻片封片成像前加入 DAPI，并继续 ORO 染色 2 小时。肠细胞核体积较大，而生殖腺可通过发育中的生殖细胞加以识别。
注意：ORO 染色后，线虫可能粘附在微离心管壁上，难以形成明显的沉淀。若发生此情况，可再次离心，或让线虫在重力作用下静置沉降至少 10 分钟。
- 用于线虫成像的载玻片制备
- 将线虫在剩余上清液中重悬，并充分混匀。
- 取 5 µL 线虫悬液滴加在显微镜载玻片上，小心盖上盖玻片，确保无气泡产生。
- 用指甲油密封盖玻片边缘，然后进行成像。
注意：固定和染色后，线虫可能变得非常僵硬，难以用常规移液器操作。为避免此问题，可通过剪切移液器吸头末端制备宽口移液器。 - 若染色后不立即成像，可将载玻片置于 4 °C 的微离心管架中保存，最长可保存 24 小时。
- ORO 染色线虫的成像
- 使用支持彩色成像的相机对 ORO 染色线虫进行成像。
- 使用 5X 放大倍数，在一个视野中成像多个线虫。
- 切换至 10X 放大倍数，以便更详细地观察单个线虫。
- 将图像导出为 TIF 格式，以避免因压缩导致的数据丢失。
注意：若使用 ORO + DAPI 染色，应将彩色相机切换为可检测荧光信号的相机。
- ORO 染色线虫的图像分析
- 将显微图像上传至 ImageJ 软件。若图像文件未被识别，可在 Plugins 下拉菜单中使用 Bio-Formats 功能。
- 在 Image 下拉菜单中，选择 Stacks 功能下的 Images-to-Stack，当需要比较多张显微图像时，可创建图像堆栈。
- 在相同下拉菜单中调整亮度/对比度，以增强脂滴的可见性。
- 根据动物全身或特定组织中的脂质积累情况对图像进行分类。
- 为更准确评估脂质定位并识别 ImageJ 中的非特异性图像伪影，可在 Image 下拉菜单中选择 Color 功能，点击 Stack to RGB，以分别显示各 RGB 通道的信号。
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结果
SKN-1 是一种 bZip 类细胞保护性转录因子，与哺乳动物的 NRF2 具有同源性，并已被证明可介导脂肪酸氧化。根据饮食中葡萄糖浓度的不同，携带组成型激活 skn-1 等位基因的线虫在经尼罗红染色后表现出不同的脂质水平7。图 1A-C 展示了在导致脂质水平升高的条件下，skn-1 激活型动物的表型。使用 FITC/GFP 通道捕获的尼罗红荧光在肠道区域明显，而在头部、尾部及肠腔中较弱。随着脂质水平升高，尼罗红染色的颗粒变得难以分辨，可能需要缩短曝光时间。尽管该方法使用荧光强度作为脂质积累的定量替代指标，但其无法有效区分非脂质储存结构的非特异性染色，且易受肠道自发荧光的信号干扰。因此，必须并行使用其他标记或非标记方法，以明确量化动物体内的中性脂质10。
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讨论
肥胖症和代谢性疾病发病率的上升使得C. elegans成为研究调控细胞和组织中脂肪积累机制的合适模型。最近的研究表明，脂质水平的变化与多种细胞过程相关，包括胰岛素信号传导8、激素受体的激活2以及生殖输出5。与无标记显微镜和色谱法相比，尼罗红（Nile red）和油红O（oil red O）是相对廉价的染料，可用于在蠕虫中稳定且可重复地染色中性脂质10,12,13。前者可用于定量总脂质水平，后者则有助于评估脂质在表皮、肠道和生殖系等组织中的分布情况。当联合使用时，NR和ORO使研究人员能够确定基因型和环境变化如何影响脂质积累，以及这些变化在蠕虫体内的具体发生位置。
然而，这些染料无法像CARS显微镜那样以非侵入性方式直接评估脂质积累
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目：R01GM109028（S.P.C.）支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Imager.M2m 显微镜 | Zeiss | n/a | 荧光显微镜 |
| ERC5s 相机 | Axiocam | n/a | 彩色成像功能 |
| MRm 相机 | Axiocam | n/a | 荧光成像功能 |
| Nile red | Thermo Fisher | N1142 | 脂质染色剂 |
| Oil red O | Alfa Aesar | A12989 | 脂质染色剂 |
| DAPI | Thermo Fisher | D1306 | DNA 染色剂 |
| 异丙醇 | BDH | BDH1133-1LP | 固定液 |
| 0.2 µm 无菌注射器滤器 | VWR | 28145-477 | 醋酸纤维素滤膜 |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 5428000015 | 离心机 |
| Shaker Rotisserie | Lab Quake | 400110Q | 摇床 |
| Tube Rotator | VWR | 10136-084 | 旋转混合器 |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | 7758-11-4 | NGM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | NGM |
| MgSO4 | Alfa Aesar | 7786-30-3 | NGM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10035-04-8 | NGM |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | NGM |
| 胆固醇 | Sigma-Aldrich | 57-88-5 | NGM |
| 蛋白胨 | BD Biosciences | 211677 | NGM |
| 琼脂 | Teknova | L9110 | NGM |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich | L3147 | 细菌培养 |
参考文献
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重印与许可
