尼罗红与油红 O 染色法测定秀丽线虫的脂质丰度及脂质分布评价

摘要

固定秀丽线虫的尼罗河红色染色是一种定量测量中性脂质矿床的方法, 而油红色 O 染色有助于定性评价组织间脂质的分布。

摘要

秀丽线虫是一种特殊的模型有机体, 用于研究脂质代谢和能量稳态。许多脂质基因在人类中被保存, 并与代谢综合征或其他疾病有关。通过固定染料或无标签的方法对机体脂质积累进行检查。像尼罗河红色和油红色 O 的固定污渍是廉价的, 可靠的方法来定量测量脂质水平, 并定性地观察各组织的脂质分布。此外, 这些污渍允许高通量筛选各种脂代谢基因和途径。此外, 其疏水性的性质有利于脂溶性, 减少与周围组织的相互作用, 并防止离解进入溶剂。虽然这些方法是有效的检查一般脂质含量, 他们没有提供详细信息的化学成分和多样性的脂质矿床。为了这些目的, 无标签的方法, 如 GC-MS 和汽车显微术更适合, 他们的成本尽管。

引言

血脂对生命至关重要。它们是膜的组成部分, 作为辅助信使和信号传感器, 在储能中具有重要的作用。当脂质代谢是失调, 它导致疾病, 如肥胖和 II 型糖尿病, 这是紧迫的公共卫生问题⁹。秀丽线虫(线虫) 是研究脂质代谢的优秀模型有机体, 因为它具有相对较短的生命周期、透明的身体、已知的细胞谱系和完全有序的基因组。主要是雌雄同体,线虫允许研究人员在短时间内培养大量的等基因系动物, 以进行高通量的前基因筛, 研究多种代谢基因和^通路4。这种方法在273种线虫脂代谢基因中发现了高度的保护, 如人类、老鼠、老鼠和果蝇。此外, 在线虫中有300多种脂质基因有与代谢综合征相关的疾病的人类 orthologues¹¹。传统上, 对线虫中脂质贮存的检查大多依赖于染料标记的化验, 这为脂质积累提供了可靠的信息。不太常见的是关于脂质的本地化和测量不同组织脂质丰度差异的描述。然而, 最近的工作表明, 脂质分布可以和脂质积累一样重要⁶。

最近, 研究已经开始整合的方法, 如高效液相色谱-质谱 (HPLC), 气相色谱-质谱 (GC), 和相干反斯托克斯拉曼散射 (汽车) 显微镜, 以解决通过直接分析脂质提取物、....

方案

1. 尼罗河红 (NR) 脂质染色

1. 5毫克/毫升 NR 溶液的制备
   1. 在一个500毫升瓶中, 加入100毫克的 NR 粉到200毫升100% 丙酮。
   2. 用铝箔盖住瓶子, 以免暴露在光线下。
   3. 使用前, 在黑暗中搅动2小时的溶液。
   4. 长期使用, 将 NR 库存解决方案储存在密封的瓶子里, 不暴露任何光线。根据研究需要, 规模化 NR 库存解决方案。确保在 NR 染色实验中使用相同的库存解决方案, 以获得一致的染色和成像结果。
2. NR 工作液的制备
   1. 每1毫升40% 异丙醇 (v/v), 添加6µL 的 NR 库存解决方案。
   2. 为每个样品准备600µL 的 NR 工作溶液。
      注: 在染色前, 应先制作新鲜的 NR 工作溶液。根据 NR 库存解决方案的需要, 使用15毫升或50毫升毕业圆锥管。
3. NR 脂质染色蠕虫的制备
   1. 生长蠕虫到早 L4 阶段在20°c 在线虫生长培养基 (NGM) 播种与晚日志 OP50大肠杆菌。
   2. 用1毫升的1x 磷酸盐缓冲盐水 + 0.01% X-100 (PBST) 溶液把盘子上的蠕虫洗净, 并将蠕虫悬浮在1.5 毫升离心管中。
   3. 将蠕虫在 560 x g上离心1分钟. 移除上清, 并重复此步骤, 直....

结果

SKN-1 是一个 bZip, 细胞保护转录因子, 与哺乳动物 NRF2 同源, 并已被证明介导脂肪酸氧化。根据其饮食中的葡萄糖浓度, 带有组成性激活的 skn-1 等位基因的蠕虫在沾上尼罗河红色7时显示出不同的血脂水平. 图 1A-c显示已激活的skn-1动物, 它们暴露在导致血脂水平升高的条件下。使用 FITC/GFP 通道捕获的 NR 荧光是沿肠道突出的, 但在头部、尾部和肠道腔内较暗。随着血脂水平的提高, 分离的 NR 染色颗粒更难以辨别, 这可能需要较低的暴露时间。该方法采用荧光强度作为脂质积累的定量代理, 但不足以区分非脂肪贮存的细胞结构的非特异性染色, 容易引起肠道自动信号干扰。荧光.因此, 替代标签和非标签方法必须并行使用, 以明确量化中性脂在动物的¹⁰。

讨论

肥胖和代谢性疾病发病率的上升使线虫成为研究细胞和组织中脂肪积累机制的合适模型。最近的证据表明, 脂质水平的变化与细胞过程相关, 从胰岛素信号⁸, 激活激素受体², 到生殖输出⁵。与无标签显微镜和色谱方法相比, 尼罗河红和油红色 O 是相对便宜的染料, 用于染色蠕虫的中性脂一贯和重现性 10, 12, 13.第一种方法是对总脂质水平进行量化, 第二种方法有助于评价组织中的脂质分布, 如皮下组织、肠道和细菌线。在联合使用时, NR 和破产的研究人员可以确定基因型和环境变化如何影响脂质积累以及蠕虫在哪里发生这些变化。

然而, 这些染料并没有直接评估与汽车显微学¹²相同的非侵入性的脂质积累。因此, .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Imager.M2m 显微镜	蔡	n/a	荧光显微镜
ERC5s 相机	Axiocam	n/a	彩色
MRm 相机	Axiocam	n/a	荧光
尼罗红	Thermo Fisher	N1142	脂质染色剂
油红 O	Alfa Aesar	A12989	脂质染色剂
DAPI	Thermo Fisher	D1306	DNA 染色
丙醇	BDH	BDH1133-1LP	固定液
0.2 µm seterile 针头式过滤器	VWR	28145-477	醋酸纤维素过滤器
离心机 5430	Eppendorf	5428000015	离心机
烤肉店	实验室 Quake	400110Q	摇床
管旋转器	VWR	10136-084	旋转器
K2HPO<>4	>Sigma-Aldrich	7758-11-4	NGM
KH2PO4	Sigma-Aldrich	7778-77-0	NGM
MgSO4	Alfa Aesar	7786-30-3	NGM
CaCl2	Sigma-Aldrich	10035-04-8	NGM
NaCl	Sigma-Aldrich	7647-14-5	NGM
胆固醇	Sigma-Aldrich	57-88-5	NGM
蛋白胨	BD Biosciences 211677		NGM
琼脂	Teknova	L9110	NGM
LB 培养基	Sigma-Aldrich	L3147	细菌生长