本方案分析导航行为 黑腹果蝇 幼虫在嗅觉神经元同时接受光遗传学刺激时的行为反应。使用波长为630 nm的光激活表达红移通道视紫红质的单个嗅觉神经元。幼虫运动同时被追踪、数字记录，并通过自行编写的软件进行分析。
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本文内容
摘要
摘要
昆虫向气味源导航的能力依赖于其初级嗅觉受体神经元（ORNs）的活动。尽管目前已有大量关于ORNs对气味分子响应特性的研究，但特定ORNs在驱动行为反应中的作用仍不清楚。行为分析中的复杂性源于激活不同ORNs的气味物质具有不同的挥发性，单个气味分子可激活多个ORNs，以及传统实验室气味递送方法难以重现自然界中观察到的嗅觉刺激的时间动态变化。本文描述了一种分析方案 果蝇 幼虫在光遗传学同时刺激其嗅觉受体神经元（ORNs）条件下的行为反应。此处使用的光遗传学技术可实现对ORN激活的特异性以及对激活时间模式的精确控制。相应的幼虫运动被追踪、数字记录，并通过自行编写的软件进行分析。通过以光刺激替代气味刺激，该方法能够更精确地控制单个ORN的激活，从而研究其对幼虫行为的影响。该方法还可进一步拓展用于研究二级投射神经元（PNs）以及局部神经元（LNs）对幼虫行为的作用。因此，该方法将有助于全面解析嗅觉神经回路的功能，并补充关于嗅觉神经元活动如何转化为行为反应的研究。
引言
嗅觉信息在 果蝇 幼虫的环境仅由21种功能上不同的嗅觉受体神经元（ORNs）感知，这些神经元的活动最终决定了幼虫的行为1,2,3,4然而，关于这些21种嗅觉受体神经元（ORN）如何通过其活动编码感觉信息的机制，目前所知仍然较少。因此，有必要通过实验手段测量每种幼虫期ORN对行为的功能性贡献。
尽管对 Drosophila 幼虫全部嗅觉受体神经元（ORNs）的感官反应谱已有深入研究1,4,5，但单个 ORN 在嗅觉回路中的作用及其对导航行为的贡献仍 largely 未知。目前幼虫行为研究的困难主要源于无法在空间和时间上特异性地激活单个 ORN。最近已有一组气味分子被鉴定出来，可特异性激活 21 种 Drosophila 幼虫 ORN 中的 19 种1。该组气味分子在低浓度下仅引发其对应 ORN 的生理反应。然而，在常规行为实验通常使用的较高....
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方案
1. 构建行为实验装置并准备硬件以实现在行为实验装置中的光遗传学刺激
- 为构建一个避光行为实验装置，使用黑色亚克力板（厚度3 mm）制作一个尺寸为89 × 61 × 66 cm3（35" 长 × 24" 宽 × 26" 高）的箱体（参见材料表）。用于制作该箱体的材料在当地五金商店通常可购得。将此箱体放置于行为实验室内的一张实验台面上（图1A）。
- 将配备红外长通830 nm滤光片和8 mm F1.4 C接口镜头的单色USB 3.0 CCD相机安装在黑色箱体顶部中央位置（参见材料表）。在实验台面上放置两条红外LED灯带（参见材料表），以在黑暗环境中照亮幼虫（图1A）。
- 为制作LED平台，准备一块22 cm × 22 cm的方形铝板（建议喷涂哑光黑色漆以消除反光）。使用金属切割工具在铝板中央切割一个足够大的孔，以便容纳CCD相机穿过。
- 用红色LED灯带覆盖该金属铝板（参见材料表）。将LED灯带的导线串联焊接，并将导线接入由树莓派2B微处理器控制的光电耦合继电器（参见材料表
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结果
为验证嗅觉受体神经元（ORN）激活的特异性，本方法已成功应用于测定两种不同嗅觉受体神经元（ORN::7a）激活的影响 & ORN::42a)（表达 Or7a 或 Or42a 的嗅觉受体神经元）激活对幼虫行为的影响（图3）。这与近期研究结果一致，即单个幼虫嗅觉受体神经元在功能上具有差异1,10,13我们的代表性数据表明，当表达 CsChrimson 的 ORN::7a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运行长度显著缩短；相反，当表达 CsChrimson 的 ORN::42a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运行长度显著增加（图3）。从每种基因型进行的（n = 8）次实验中获取的约100–120条幼虫运动轨迹的综合数据分析得出。误差线表示标准误（SEM）。此处我.......
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讨论
在此，我们描述了一种可用于测量的方 果蝇 对嗅觉神经元进行光遗传学同步激活时的幼虫行为。先前描述的幼虫追踪方法1,8 使用不同的气味递送技术来激活嗅觉受体神经元（ORNs）。然而，这些方法无法控制ORN激活的特异性或时间模式。我们的方法通过使用光刺激替代气味刺激，实现了对ORN激活更精确的控制，从而克服了这些缺陷。
构建行为实验装置所需的材料可轻松在当地五金店购得，组装过程也极为简便。用于制备光遗传学模块的电子元件同样易于获取且便于搭建。本文所述方法采用红光激活在特定神经元中表达的红移通道视紫红质（CsChrimson）。通过CCD相机记录相应嗅觉受体神经元（ORN）激活后幼虫的行为反应，并利用本文提供的自编软件进行量化分析。本方法使研究人员能够回答此前难以解决的多个问题：1）不同的嗅觉刺激模式对动物趋向气味能力有何影响？2）类似于哺乳动物视网膜中的ON-中心和OFF-中心神经节细胞16
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了内华达大学雷诺分校的启动资金以及美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助项目（资助号：P20 GM103650）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 用于捕获幼虫运动的摄像机 | |||
| CCD 相机 | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 至 M55 滤光片螺纹转接器 | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" 方形螺纹滤光片支架（用于成像镜头） | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715，2" 方形长通滤光片 | Edmund Optics | 46-066 | |
| 光遗传学装置用电子元件 | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 三通道可编程电源 | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 八通道光耦继电器 | amazon.com | 6454319 | |
| 630 nm 四排 LED 灯带 | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850 nm LED 灯带 | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60x2-kit | |
| 软件 | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| 其他物品 | |||
| 黑色亚克力有机玻璃 | Home Depot | MC1184848bl | |
| 果蝇食物及其他试剂 | |||
| Nutrifly 果蝇食物 | Genesee Scientific | 66-112 | |
| 琼脂糖粉末 | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22 cm × 22 cm 方形培养皿 | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| 全反式视黄醛 | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| 果蝇品系 | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
参考文献
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al.
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重印与许可
