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追踪 果蝇 幼虫对嗅觉神经元光遗传学刺激的行为反应

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DOI：

10.3791/57353

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2018年3月21日

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1Department of Biology, MS-0314, University of Nevada, 2Integrated Neuroscience Graduate Program, University of Nevada

本文内容

摘要

本方案分析导航行为 黑腹果蝇 幼虫在嗅觉神经元同时接受光遗传学刺激时的行为反应。使用波长为630 nm的光激活表达红移通道视紫红质的单个嗅觉神经元。幼虫运动同时被追踪、数字记录，并通过自行编写的软件进行分析。

摘要

昆虫向气味源导航的能力依赖于其初级嗅觉受体神经元（ORNs）的活动。尽管目前已有大量关于ORNs对气味分子响应特性的研究，但特定ORNs在驱动行为反应中的作用仍不清楚。行为分析中的复杂性源于激活不同ORNs的气味物质具有不同的挥发性，单个气味分子可激活多个ORNs，以及传统实验室气味递送方法难以重现自然界中观察到的嗅觉刺激的时间动态变化。本文描述了一种分析方案 果蝇 幼虫在光遗传学同时刺激其嗅觉受体神经元（ORNs）条件下的行为反应。此处使用的光遗传学技术可实现对ORN激活的特异性以及对激活时间模式的精确控制。相应的幼虫运动被追踪、数字记录，并通过自行编写的软件进行分析。通过以光刺激替代气味刺激，该方法能够更精确地控制单个ORN的激活，从而研究其对幼虫行为的影响。该方法还可进一步拓展用于研究二级投射神经元（PNs）以及局部神经元（LNs）对幼虫行为的作用。因此，该方法将有助于全面解析嗅觉神经回路的功能，并补充关于嗅觉神经元活动如何转化为行为反应的研究。

引言

嗅觉信息在 果蝇 幼虫的环境仅由21种功能上不同的嗅觉受体神经元（ORNs）感知，这些神经元的活动最终决定了幼虫的行为1,2,3,4然而，关于这些21种嗅觉受体神经元（ORN）如何通过其活动编码感觉信息的机制，目前所知仍然较少。因此，有必要通过实验手段测量每种幼虫期ORN对行为的功能性贡献。

尽管对 Drosophila 幼虫全部嗅觉受体神经元（ORNs）的感官反应谱已有深入研究1,4,5，但单个 ORN 在嗅觉回路中的作用及其对导航行为的贡献仍 largely 未知。目前幼虫行为研究的困难主要源于无法在空间和时间上特异性地激活单个 ORN。最近已有一组气味分子被鉴定出来，可特异性激活 21 种 Drosophila 幼虫 ORN 中的 19 种1。该组气味分子在低浓度下仅引发其对应 ORN 的生理反应。然而，在常规行为实验通常使用的较高浓度下，每种气味分子会引发多个 ORN 的生理反应1,5,6。此外，该组气味分子的挥发性各不相同，这给依赖稳定气味梯度形成的行为学研究带来了复杂性7,8。最后，自然界中的气味刺激具有时间动态性，难以在实验室条件下准确模拟。因此，建立一种能够在空间和时间上同时激活单个 ORN 并测量幼虫行为的方法显得尤为重要。

在此，我们展示了一种优于先前所述幼虫追踪检测方法的技术1,8Gershow 中描述的追踪实验 等 使用电子控制阀门在行为实验区域内维持稳定的气味梯度8然而，由于构建气味刺激装置所需的工程复杂程度较高，该方法在其他实验室中难以复制。此外，使用气味分子特异性激活单一嗅觉神经元（ORN）的相关问题仍未解决。Mathew 中描述的追踪分析法 等 使用更简单的气味递送系统，但由此产生的气味梯度依赖于测试气味剂的挥发性，且在长时间的实验过程中不稳定1因此，通过以光刺激替代气味刺激，本方法具有特异性强、对嗅觉受体神经元激活的时间控制精确等优点，且不依赖于不同强度气味梯度的形成。

我们的方法易于建立，适用于希望研究黑腹果蝇（Drosophila）幼虫导航行为的研究人员。只要研究人员能够在自己偏好的模式系统中驱动CsChrimson在其目标神经元中的表达，该技术便可推广应用于其他模式系统。CsChrimson是通道视紫红质的一种红移版本，其激活波长对幼虫的趋光系统不可见。因此，我们能够以高特异性、可靠性和可重复性操控神经元活动9。通过修改自主编写的软件以适应实验对象的尺寸变化，该方法也可轻松适用于其他昆虫物种的爬行幼虫。

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方案

1. 构建行为实验装置并准备硬件以实现在行为实验装置中的光遗传学刺激

  1. 为构建一个避光行为实验装置，使用黑色亚克力板（厚度3 mm）制作一个尺寸为89 × 61 × 66 cm3（35" 长 × 24" 宽 × 26" 高）的箱体（参见材料表）。用于制作该箱体的材料在当地五金商店通常可购得。将此箱体放置于行为实验室内的一张实验台面上（图1A）。
  2. 将配备红外长通830 nm滤光片和8 mm F1.4 C接口镜头的单色USB 3.0 CCD相机安装在黑色箱体顶部中央位置（参见材料表）。在实验台面上放置两条红外LED灯带（参见材料表），以在黑暗环境中照亮幼虫（图1A）。
  3. 为制作LED平台，准备一块22 cm × 22 cm的方形铝板（建议喷涂哑光黑色漆以消除反光）。使用金属切割工具在铝板中央切割一个足够大的孔，以便容纳CCD相机穿过。
  4. 用红色LED灯带覆盖该金属铝板（参见材料表）。将LED灯带的导线串联焊接，并将导线接入由树莓派2B微处理器控制的光电耦合继电器（参见材料表）（图1B 和 2）。
  5. 在将光电耦合继电器连接至LED灯带之前，先在树莓派微处理器上安装并配置基于Ubuntu Mate/Raspbian Jesse/Linux的操作系统。连接电源以供给LED灯带和光电耦合继电器电力（图2）（参见材料表）。将LED平台安装在CCD相机周围（图1B）。
    注：Ubuntu Mate v16.04操作系统可免费获取。可通过一组简单的基于Python的指令轻松编程控制LED光刺激的模式（参见语法文件）。
  6. 确保行为实验装置内不同位置的辐照度均匀。使用光谱仪测量实验装置表面各点的绝对辐照度，并确认其在整个表面范围内约为~1.3 W/m2。
    注：在此强度下，实验过程中未观察到温度发生显著变化。另一项研究10使用了约~1.9 W/m2的更高辐照度，同样未观察到实验过程中温度变化。

2. 准备 果蝇 用于行为分析的幼虫

  1. 将果蝇饲养在标准果蝇培养基上（见材料表），条件为 25 °C、50–60% 相对湿度（RH）以及 12 小时光照/12 小时黑暗的光周期。
  2. 为了在单对嗅觉受体神经元（ORNs）中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 品系的处女雌蝇与 OrX-Gal4 品系的雄蝇杂交（“X”对应 21 个幼虫期气味受体（Or）基因中的一个，这些基因分别在 21 对 ORNs 中特异性表达）9,11。
    1. 或者，为了在全部 21 对幼虫期 ORNs 中表达 CsChrimson，将 UAS-IVS-CsChrimson 品系的处女雌蝇与 Orco-Gal4 品系的雄蝇杂交（“Orco”是所有 21 对 ORNs 中均表达的共受体）。
    2. 在这些实验中，单独使用 UAS-IVS-CsChrimson 品系作为对照。
      注：此处列出的果蝇品系均可从布卢明顿果蝇资源中心获取（见材料表）。
  3. 在杂交果蝇的雌雄个体交配并产卵 48 小时后，将成虫转移至新的培养管中。
    1. 向含有卵的培养管食物表面加入 400 µL 混合液，该混合液包含溶解于二甲基亚砜（DMSO）中的 400 µM 全反式视黄醛（ATR）以及溶解于蒸馏水中的 89 mM 蔗糖。
      注：少量蔗糖有助于幼虫摄食 ATR 溶液。ATR 是上调 CsChrimson 表达所必需的辅因子9,10。ATR 对光敏感。
    2. 在向含卵的培养管中加入 ATR 后，将培养管置于黑暗环境中继续孵育 72 小时。
      注：尽管本研究及前述两项研究均未观察到 ATR 摄食对幼虫行为产生影响，但仍建议通过让测试品系摄食不含 ATR 的上述混合液（等量）来控制 ATR 摄食可能带来的影响。
  4. 利用高密度（15%）蔗糖溶液将三龄幼虫（约在产卵后 120 小时）从果蝇培养基表面漂浮分离出来。使用 P1000 微量移液器将漂浮在蔗糖溶液表面的幼虫转移至一个 1000 mL 玻璃烧杯中。
  5. 每次用 800 mL 新鲜蒸馏水更换烧杯中的液体，清洗幼虫 3–4 次。在进行行为学实验前，让幼虫静置 10 分钟。

3. 行为实验

  1. 保持行为实验室内温度恒定（22–25 °C）和湿度恒定（50–60% RH）。
  2. 通过将150 mL融化后的琼脂糖（1.5%）倒入一个22 cm × 22 cm的方形培养皿中来制备幼虫爬行培养基。每次实验需进行8–10次试验，每次试验使用一个培养皿。将琼脂糖在培养皿中静置1–2小时，使其完全凝固并冷却后再用于行为实验。
    1. 将不超过20只准备好的三龄幼虫转移至培养皿中央（图1C）。用培养皿盖盖好，并将培养皿置于CCD相机下的行为检测区域。
      注意：根据实验设计，行为检测通常持续3–5分钟。若在实验中使用气味物质提供导向线索，已观察到所产生的气味梯度在约5分钟内保持稳定1。不建议延长实验时间。在此时间段内，未观察到幼虫因脱水或长时间暴露于630 nm红光而产生有害影响。
  3. 打开850 nm红外LED光源，以便在视频中观察幼虫。启动CCD相机以记录幼虫的运动轨迹。
  4. 使用与Raspberry Pi处理器配套的软件，编程设定合适的红光刺激模式。
    注意：可轻松修改一组基于Python的简单命令，以编程控制LED光刺激的模式（参见语法文件）。

4. 数据处理与分析

  1. 将每次试验的录制视频导入任意可用的编程软件（如Matlab）。
  2. 获取电影中每条幼虫随时间变化的 XY 坐标。根据追踪软件的限制，单部电影中可追踪 15–20 条三龄幼虫1,8.
    注意：提供了一套简单的 Matlab 代码（“Tracklarva”），可根据具体实验条件轻松调整（参见语法文件）。该程序可整合实验中的所有测试数据，并输出每次实验中每条幼虫在整个检测过程中的 XY 坐标（见下文代码语法）。此外，研究者也可选用多种基于开源平台且可免费获取的分析软件。 例如 JAABA（http://jaaba.sourceforge.net/）12.
  3. 利用生成的 XY 坐标绘制幼虫运动轨迹，并进一步分析幼虫运动行为。
    1. 在行为分析中，利用速度、路径曲率、航向角等导航统计参数，将单个幼虫的运动轨迹分割为交替出现的直线运动序列和转向序列。
    2. 运行定义为持续向前运动的时段，连续的运行之间由转向分隔。当轨迹方向角发生变化时，即标记为一次转向。 >45°（参见语法文件）。
  4. 根据需要计算运行速度、运行长度、运行方向及其他参数的平均值。
    注意：提供了一套简单的语法，用于从幼虫轨迹中提取“运行”（runs）和“停止”（stops）（见语法文件）。可对提取的数据应用简单的基于 Matlab 或 Excel 的函数，以计算“运行速度”（run speed）和“运行长度”（run length）的数值 等等.
  5. 将每项行为学指标的数据表示为均值 ± 标准误。

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结果

为了证明嗅觉受体神经元（ORN）激活的特异性，本方法已成功应用于确定两种不同嗅觉受体神经元（ORN::7a & ORN::42a）（分别表达 Or7a 或 Or42a 的 ORN）的激活对幼虫行为的影响（图3）。与近期研究一致，即单个幼虫嗅觉受体神经元在功能上具有差异性1,10,13，我们代表性数据显示，当表达 CsChrimson 的 ORN::7a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运动路径长度显著缩短。相反，当表达 CsChrimson 的 ORN::42a 受到光刺激时，与对照组动物相比，其运动路径长度显著增加（图3）。从约 100–120 条幼虫运动轨迹中汇总分析的数据来自每种基因型进行的（n = 8）次实验。误差线表示标准误（SEM）。本文仅...

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讨论

在此，我们描述了一种可用于测量的方 果蝇 对嗅觉神经元进行光遗传学同步激活时的幼虫行为。先前描述的幼虫追踪方法1,8 使用不同的气味递送技术来激活嗅觉受体神经元（ORNs）。然而，这些方法无法控制ORN激活的特异性或时间模式。我们的方法通过使用光刺激替代气味刺激，实现了对ORN激活更精确的控制，从而克服了这些缺陷。

构建行为实验装置所需的材料可轻松在当地五金店购得，组装过程也极为简便。用于制备光遗传学模块的电子元件同样易于获取且便于搭建。本文所述方法采用红光激活在特定神经元中表达的红移通道视紫红质（CsChrimson）。通过CCD相机记录相应嗅觉受体神经元（ORN）激活后幼虫的行为反应，并利用本文提供的自编软件进行量化分析。本方法使研究人员能够回答此前难以解决的多个问题：1）不同的嗅觉刺激模式对动物趋向气味能力有何影响？2）类似于哺乳动物视网膜中的ON-中心和OFF-中心神经节细胞16

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了内华达大学雷诺分校的启动资金以及美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所资助项目（资助号：P20 GM103650）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于捕获幼虫运动的摄像机
CCD 相机 Edmund Optics106215
M52 至 M55 滤光片螺纹转接器Edmund Optics59-446
2" 方形螺纹滤光片支架（用于成像镜头） Edmund Optics59-445
RG-715，2" 方形长通滤光片Edmund Optics46-066
光遗传学装置用电子元件
Raspberry Pi 2BRASPBERRY-PI.orgRPI2-MODB-V1.2
三通道可编程电源newegg.com9SIA3C62037092
八通道光耦继电器amazon.com6454319
630 nm 四排 LED 灯带environmentallights.comred3528-450-reel
850 nm LED 灯带environmentallights.comwp-4000K-CC5050-60x2-kit
软件 
MatlabMathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04Nubuntuhttps://github.com/yslo/nubuntu
其他物品
黑色亚克力有机玻璃Home DepotMC1184848bl
果蝇食物及其他试剂
Nutrifly 果蝇食物Genesee Scientific66-112
琼脂糖粉末Genesee Scientific20-102
22 cm × 22 cm 方形培养皿VWR Inc.25382-327
DMSOSigma-AldrichD2650
蔗糖Sigma-Aldrich84097
全反式视黄醛Sigma-AldrichR2500
果蝇品系
UAS-IVS-CsChrimson Bloomington Drosophila Stock Center55134
Orco-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center26818
Or42a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center9970
Or7a-Gal4Bloomington Drosophila Stock Center23907

参考文献

  1. Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
  2. Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
  3. Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
  4. Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
  5. Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
  6. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
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  18. Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).

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CsChrimson LED

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