通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽

摘要

我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。

摘要

在此，我们描述了一种利用树脂上分子内/分子间硫醇-烯烃加硫醇化反应制备硫醚连接肽的详细方案。此外，本方案还介绍了通过溶液中分子内硫醇-炔烃加硫醇化反应制备乙烯基硫醚连接肽的方法，该反应发生在侧链含烯烃/炔烃的氨基酸与位于i, i+4位置的半胱氨酸残基之间。线性肽采用标准的Fmoc基固相肽合成法（SPPS）进行合成。硫醇-烯烃加硫醇化反应根据肽链长度的不同，可选择分子内或分子间硫醇-烯反应方式进行。在本研究中，对于较短的肽链，在完成线性肽的全合成后，首先在树脂上脱除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基，随后进行分子内硫醇-烯反应。然后加入光引发剂4-甲氧基苯乙酮（MAP）和2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮（MMP），对树脂进行紫外光照射。分子间硫醇-烯反应则通过将Fmoc-Cys-OH溶于 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶剂。随后，利用树脂上带有烯烃的残基与肽进行反应。接着，在树脂上使用苯并三氮唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBop）、1-羟基苯并三氮唑（HoBt）和4-甲基吗啉（NMM）作为活化试剂进行大环内酰胺化反应。完成大环内酰胺化后，继续采用标准固相肽合成法（SPPS）进行肽链的延伸。在硫-炔氢硫化反应的情况下，将线性肽从树脂上裂解下来，干燥后溶于脱气的DMF中。然后在光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）存在下用紫外光照射。反应完成后，蒸发除去DMF，粗产物经沉淀并采用高效液相色谱法（HPLC）纯化。这些方法有望简化含硫醚键环肽的制备，得益于硫-烯/炔点击化学反应具有优异的官能团耐受性和较高的产率。将硫醚键引入肽分子中，可利用半胱氨酸残基的亲核性，且相较于二硫键，硫醚键具有氧化还原惰性。

引言

开发用于调控蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的配体，为现代药物发现提供了一种极具吸引力的策略。因此，大量研究致力于探索能够有效调控PPIs的新型化学模态^1,2,3。PPIs通常涉及浅表、大面积和/或不连续的相互作用界面，因此小分子通常被认为不适合用于调控PPIs^4,5。当存在合适的暴露相互作用表面积时，能够模拟蛋白质界面结构特征的短肽是解决这一问题的理想候选分子^6,7。然而，短肽在水溶液中通常缺乏明确的结构，这是因为水分子会与肽骨架的分子内氢键网络发生竞争，导致在水中形成明确构象在熵上不利⁸。此外，肽类固有的低稳定性和细胞通透性在很大程度上限制了其在生物应用中的使用^9,10。根据蛋白质数据库（PDB）的分析，>50%的PPIs涉及短α-螺旋相互作用¹¹。因此，已发展出多种化学方法用于螺旋结构的稳定化，包括二硫键/硫醚键的形成^12,13,14、环闭合复分解反应¹⁵、内酰胺环的形成¹⁶、"点击化学"¹⁷、引入全氟芳烃^18,19以及乙烯基硫醚的形成²⁰。

稳定化的螺旋肽被广泛用于多种细胞内靶点，包括 p53、雌激素受体、Ras、BCL-2 家族蛋白等^21,22,23,24。ALRN-6924 是一种全碳氢链固定的肽类双重抑制剂，可同时抑制 MDM2 和 MDMX，目前正处于临床研究阶段²⁵。在过去几年中，我们课题组致力于开发基于硫醇-烯和硫醇-炔反应的新型肽链稳定化方法^26,27,28。总体而言，我们已证明，当使用天然存在的半胱氨酸时，这些光引发反应在温和条件下具有高效性。此外，我们还表明，这些反应对官能团具有优异的耐受性，具有生物正交性，并已被证实适用于肽和蛋白质的修饰²⁹。所生成的硫醚/乙烯基硫醚连接肽显著拓展了约束肽的化学空间，提供了可进行连接链上修饰的活性位点，并已被证实可用于多种生物应用^30,31,32。迄今为止，关于硫醇-烯/硫醇-炔肽环化的报道仍十分有限。Anseth 等. 于 2009 年发表的一项研究中，展示了在树脂上通过活化烯烃与半胱氨酸发生分子内硫醇-烯反应实现肽环化的方法³³。2015 年，Chou 等. 描述了一种双组分自由基引发的硫醇-烯反应用于肽链固定³⁴，以及随后的连续硫醇-炔/烯偶联反应³⁵。最近，我们报道了一系列基于硫醚/乙烯基硫醚连接肽的研究工作^20,26,27。本实验方案详细描述了上述硫醚/乙烯基硫醚连接肽的合成方法，希望对更广泛的研究领域有所帮助。

方案

1. 仪器设备准备

1. 对于手动多肽合成装置，将真空多联管（材料表）置于通风良好的通风橱中。随后，将三通旋塞安装到真空多联管上，并将其连接至氮气或氩气管线。使用橡胶隔垫封闭所有未使用的入口。
2. 通过三通旋塞将装有树脂的柱子（0.8 × 4 cm，10 mL 储液端，参见 材料表）连接至多联管（图1）。使用连接至真空系统的泵进行抽滤，或通过挤压橡胶洗耳球去除柱中的溶剂。
3. 使用配备十个350 nm 灯管的光反应器（图2）进行紫外照射（材料表）。通过光反应器的进气口将灯管连接至氩气瓶，以确保在光反应开始前及进行过程中，光反应器内部充满氩气。
4. 在开启光反应器的紫外灯之前，务必确认光反应器门已关闭，以防紫外光辐射外泄。

2. 树脂准备

注意：通常，多肽底物的构建采用基于Fmoc的固相多肽合成方法。该方法使用Rink酰胺树脂，使多肽裂解后保留C端酰胺。本文中均采用此方案。

警告：N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、4-甲基吗啉（NMM）和N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）有毒，吸入、食入或皮肤接触均有害。乙醚高度易燃。三氟乙酸（TFA）具有腐蚀性。1,2-乙二硫醇（EDT）具有强烈恶臭。因此，所有有机溶剂和化学品均须在化学通风橱内操作，并佩戴适当的个人防护装备（腈类手套、实验服和护目镜）。

1. 使用以下公式计算所需树脂的量：
   规格（mmol）/（树脂载样量（mmol/g）× 1,000（mg/g））= 树脂质量（mg）
   例如，对于 25 µmol（即 0.025 mmol）反应规模，使用载样量为 0.5 mmol/g 的 Rink 酰胺 MBHA 树脂时，所需树脂质量为：0.025 mmol /（0.5 mmol/g × 1,000 mg/g）= 50 mg。随后，在反应柱中称取 50 mg 树脂，并使用三通活塞将其连接至真空 manifold 装置。
2. 向反应柱（尺寸 0.8 × 4 cm，配备 10 mL 储液器）中的树脂加入 1–2 mL DCM。为使树脂充分溶胀，用氮气或氩气气流轻轻吹洗 10 分钟。随后通过真空抽滤除去溶剂。

3. N端Fmoc脱保护与洗涤

1. 配制N端Fmoc脱保护溶液：在玻璃瓶中配制适量体积（200 mL）的含50%（v/v）吗啉的DMF溶液。
2. 向树脂中加入1 - 2 mL脱保护溶液，轻轻振荡10分钟，然后用真空抽滤除去溶液。依次使用DMF（1 - 2 mL）和DCM（1 - 2 mL）彻底洗涤树脂和反应容器，每种溶剂洗涤3次。随后，重复脱保护及洗涤步骤1次。

4. Fmoc 保护的氨基酸偶联

1. 以丙氨酸残基的偶联为例，在25 µmol规模的手动合成中，称取Fmoc-Ala-OH（5当量，41.4 mg）和2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸盐（HCTU；4.9当量，50.5 mg）于聚丙烯容器中，加入DMF（0.5 mL）溶解。
2. 加入 DIPEA（10 当量，43.5 µl），以制备 0.25 M 的活化氨基酸溶液（表 1）。预活化约 1 分钟后，将该溶液加入树脂中，然后用 N₂ 鼓泡₂ 约 1 - 2 小时。
3. 从这一步开始，按照以下步骤序列将每个氨基酸依次加入肽链：首先脱去N端的Fmoc保护基团，然后进行洗涤，接着使用HCTU活化进行氨基酸偶联。
   注意：更长的偶联时间（例如，建议在偶联位点后接有空间位阻较大的氨基酸残基时采用较长的偶联时间（2小时）[例如Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。含烯烃或炔烃的非天然氨基酸使用3当量而非5当量，并反应3小时。
4. 使用 Kaiser 或氯萘胺试验（chloranil test）监测肽的合成进程，具体方法参照 Arora 的描述 等³⁶ 这些测试可对游离伯胺和仲胺的存在与否进行定性评估。或者，可将约2 - 3 mg的肽从树脂上裂解下来，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行分析。

5. 巯基-烯烃加成反应与巯基-炔烃环化反应

1. 通过树脂上环化反应构建硫醚连接子（图3).
   1. 配制约 50 mL 去保护溶液（TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0）。对 Cys 和 mS 进行处理₅含树脂 [NH₂-R-mS₅-A-A-A-Cys(Trt)-R'-树脂，50 mg] 置于10 mL柱中，加入1–2 mL Trt脱保护溶液。用N₂轻轻搅拌溶液10分钟₂最后，用二氯甲烷（1–2 mL）洗涤，共洗涤 3 次。
      注意：MS₅ 表示带有亚烷基的构建单元（见所示结构图） 图6用于肽偶联和硫代-烯烃环化反应³⁸.
   2. 重复上述步骤，总共约进行6次，以去除半胱氨酸的三苯甲基保护基，直至溶液颜色不再呈黄色。
   3. 通入 N₂₂，洗涤R-mS₅-A-A-A-Cys(-SH)-R'-树脂 [含游离巯基(-SH)的半胱氨酸] 依次用DMF（1 - 2 mL）和DCM（1 - 2 mL）洗涤。随后用甲醇（1 - 2 mL）收缩树脂2分钟，通过过滤除去溶剂。接着，在氮气流下依次干燥树脂₂ 在色谱柱中用气体冲洗约5分钟。
   4. 提前在圆底烧瓶中通过长针向溶剂内通入氮气约1小时，以制备脱气的DMF。
   5. 将树脂通过称量纸转移至10 mL圆底烧瓶中。用2 mL脱气的DMF悬浮树脂，随后加入光引发剂2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮（MMP；1当量，5.6 mg）和4-甲氧基苯乙酮（MAP；1当量，3.8 mg）。
   6. 将一个搅拌子（0.3 cm）放入烧瓶中，并用合适的橡胶塞密封烧瓶，然后使用油泵用氮气置换烧瓶中的空气。
      注意：在固相上进行有效的硫醇-烯光反应时，惰性气氛并非严格必需。然而，在溶液相中进行硫醇-炔光反应时，惰性气氛则非常必要。 图5否则，硫将在紫外照射过程中发生氧化。
   7. 将反应烧瓶放入光反应器中，在室温下紫外光照射条件下搅拌树脂1小时（图2).
      警告：开启光反应器紫外灯前，务必关闭光反应器门，以防紫外光产生有害辐射。
      注意：对于新的反应序列，建议在光反应过程中频繁取样检测反应混合物，因为线性肽前体与产物的分子量相同。通常情况下，线性肽与环状肽在亲水性上存在显著差异，可通过高效液相色谱（HPLC）轻松区分。 alternatively，也可使用5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）试剂检测游离巯基的存在。³⁷.
   8. 将树脂从烧瓶转移至层析柱中，并通过真空过滤去除溶剂。按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。
   9. 准备约 10 mL 裂解缓冲液（TFA/TIPS/EDT/H₂O 94/1/2.5/2.5) 在通风橱中。
   10. 将树脂转移至一个2 mL聚丙烯容器中，加入1 mL裂解液（TFA/TIPS/EDT/H₂向容器中加入 O 94/1/2.5/2.5)，用螺旋盖将容器密封。然后在通风橱中，以 60 rpm 的转速在轨道摇床中轻轻振荡 1.5 - 2 小时。
       警告：三氟乙酸（TFA）具有强腐蚀性，操作时需穿戴防护服，并在通风良好的通风橱中进行。乙二硫醇（EDT）具有强烈恶臭，必须在通风良好的通风橱中操作。
   11. 通过氮气下蒸发去除TFA混合液₂ 在通风橱中的气流条件下，加入冷的乙醚（1 mL）沉淀残余物，持续30秒，随后在12,000 × g离心2分钟以分离沉淀。离心后，小心倾去乙醚相。重复沉淀和离心步骤两次。将残余物完全蒸发至干燥。
   12. 最后，将残余物溶于1 mL H₂O/乙腈（2:1）混合溶剂，采用C18分析柱（4.6 × 250 mm，流速1.0 mL/min）进行HPLC纯化。使用H₂O（含0.1%三氟乙酸）和纯乙腈作为流动相，在25分钟内以每分钟2%的线性梯度从20%乙腈升至70%乙腈。使用280 nm和220 nm紫外波长监测HPLC图谱（表2）。
2. 通过分子间硫醇-烯反应构建硫醚连接子，然后通过大环内酰胺化反应使肽环化图4).
   1. 合成带有线性肽 H 的亚烷基残基₂N-A-A-A-mS₅(2-R'')-R'-树脂（50 mg），采用标准的Fmoc固相多肽合成法（SPPS），具体步骤如2–4所述。随后，按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。
   2. 将树脂悬浮于一个10 mL圆底烧瓶中，烧瓶内含2 mL按步骤5.1.4所述脱气的DMF。
   3. 加入光引发剂MMP和MAP（MMP：1当量，5.6 mg；MAP：1当量，3.8 mg）、Fmoc-Cys-OH（3当量，25.7 mg）以及搅拌子（0.3 cm）至烧瓶中。用合适的橡胶塞密封烧瓶，随后使用油泵将烧瓶中的空气置换为氮气。
   4. 将反应瓶放入光反应器中，在室温下避光搅拌1 - 2小时（图2).
   5. 通过液相色谱-质谱（LC-MS）分析监测反应：使用裂解缓冲液裂解 2 - 3 mg 树脂。随后用冷的乙醚（300 µL）沉淀残余物，通过离心分离残余物，并按照步骤 5.1.11 所述将残余物蒸发至干燥。之后，将残余物溶解于 100 µL 的 H₂O/乙腈（2:1）。使用0.22 µm微孔滤膜过滤肽溶液，并采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行分析，化合物通过电喷雾离子化（ESI）并在正离子模式下检测。
   6. 如有必要，重复步骤 5.2.2 - 5.2.4，以确保反应完全进行。
   7. 光反应完成后，将树脂从烧瓶转移至层析柱中，并通过减压过滤除去溶剂。按照步骤5.1.3所述方法洗涤并干燥树脂。
   8. 将苯并三唑-1-基-氧-三(吡咯烷基)磷六氟磷酸盐（PyBob；2.4 当量，31.2 mg）、1-羟基苯并三唑（HoBt；2.4 当量，8.1 mg）和 N-甲基吗啉（NMM；4 当量，11 µL）的 DMF 溶液加入柱中树脂，用于大环内酰胺化反应。用 N₂ 鼓泡处理该溶液₂ 2小时。
      1. 此外，使用液相色谱-质谱法（LC-MS）监测此偶联反应，方法见步骤5.2.3。如有必要，重复此步骤以确保反应完全进行。
   9. 使用标准的Fmoc固相肽合成法（SPPS）按照步骤3和4所述延长肽链。
   10. 在所有氨基酸残基组装完成后，按照步骤5.1.10和5.1.11所述将肽从树脂上切割下来，并按照步骤5.1.12所述进行纯化。
3. 在溶液相中构建乙烯基硫醚连接子图5).
   1. 使用标准的Fmoc固相肽合成法（SPPS）按照步骤2-4所述合成带有炔基残基的线性肽。根据先前研究中描述的成熟方案合成含炔基的氨基酸。²⁰.
   2. 将多肽从树脂上裂解并使用冷的乙醚沉淀，具体步骤如5.1.9 - 5.1.11所述。裂解并沉淀树脂后，于12,000 × g离心2分钟以收集多肽。
   3. 在真空条件下干燥所得残余物。将残余物溶于已脱气的DMF（50 mL）中，置于100 mL圆底烧瓶内，使最终浓度达到0.5 mM（根据树脂载量计算：0.025 mmol ×（1000 mL/L / 0.5 mmol/L）= 50 mL）。
      1. 加入光引发剂 DMPA（0.5 当量，3.2 mg），然后用 N₂ 对反应溶液脱气 10 分钟₂ 通过一根伸入溶液的长针通入。随后，在室温下将样品置于紫外光中照射0.5–1小时，期间不进行搅拌。
   4. 在高真空下除去DMF，并加入乙醚沉淀粗产物，以溶解其有机副产物。随后，在12,000 × g离心2分钟以分离沉淀物。离心后，小心倾去乙醚相。将残留物蒸发至干燥。最后，将残留物溶于1 mL H₂O/乙腈（2:1）混合溶剂，并按照步骤5.1.7所述方法通过高效液相色谱（HPLC）进行纯化。

结果

采用树脂上分子内硫醇-烯烃光反应生成的肽 Ac-YmS₅AAAC-NH₂ 及其环化产物 Ac-Y-(cyclo-1,5)-[mS₅AAAC]-NH₂ 的高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）图谱如图6B所示。环状肽的分子量与其线性前体相同，但在相同的分离条件下，其HPLC保留时间比前体肽约提前2分钟。不同序列的短肽均表现出良好的转化率，如图6C所示。

硫代炔光反应条件的筛选过程如图7B所示，异构体转化率及比例通过反相HPLC积分测定。在紫外光照射后仅观察到微量的肽2c。这可能是由于在形成20元大环的缩合步骤中，硫醇自由基在N端被捕获的构象偏好所致。肽1a和1b均生成了两种具有8元乙烯基硫醚...

讨论

在图3所述的树脂上分子内硫-烯环化反应中，发现去除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基是后续光反应的关键步骤。此外，反应前后肽的分子量相同，如图6B所示。因此，必须使用高效液相色谱（HPLC）鉴定或DTNB测定法来监测反应进程。对于图4所述的分子间硫-烯反应，需通过质谱（MS）进行监测。尽管构建硫醚交联结构还需额外的内酰胺偶联步骤，但我们建议将该方案用于较长肽段，以实现更高的整体反应效率。

硫代炔光化学反应生成的乙烯基硫醚键在用于树脂裂解的强酸性三氟乙酸（TFA）溶液中不稳定。因此，采用在溶液相中进行硫代炔光化学反应。该反应被稀释至较低浓度（0.5 mM），以避免潜在的分子间副反应。同样重要的是，需对溶剂进行脱气处理，以防止光化学反应过程中产物被氧化。反应完成后，应小心进行有机溶剂DMF的真空蒸发，以避免肽的氧化或降解，以及设备的腐蚀损耗。图5所示的硫代...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Rink Amide MBHA 树脂（0.53 mmol/g）	HECHENG	GRM50407
标准 Fmoc 保护氨基酸	GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-甲基-2-吡咯烷酮	深圳恩迪生物科技有限公司	3230	对皮肤有害
N,N-二甲基甲酰胺	Energy	B020051	对皮肤有害
二氯甲烷	Energy	W330229	对皮肤有害
N,N-二异丙基乙胺	Aldrich	9578	刺激性
三氟乙酸	J&K	101398	腐蚀性
三异丙基硅烷	J&K	973821
1,2-乙二硫醇	J&K	248897	恶臭
2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵	GL Biochem (Shanghai) Ltd.	851012
吗啉	Aldrich	M109062	刺激性
乙醚	Aldrich	673811	易燃
乙腈	Aldrich	9758	有毒
甲醇	Aldrich	9758	有毒
2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮	Energy	A050035
4-甲氧基苯乙酮	Energy	A050098
2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮	Energy	D070132
5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)	J&K	281281
苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐	Energy	E020172
1-羟基苯并三唑	Energy	D050256
4-甲基吗啉	Energy	W320038
高效液相色谱	SHIMADZU	LC-30AD
电喷雾电离质谱	SHIMADZU	LCMS-8030
冷冻干燥机	Labconco	FreeZone
SpeedVac 浓缩系统	Thermo	Savant
真空 manifold	promega	A7231
三通旋塞阀	Bio-Rad	7328107
聚丙烯层析柱	Bio-Rad	7311550