利用光致硫醇-烯/yne Hydrothiolation 构造硫醚类/乙烯基硫化物栓系螺旋肽

配体对蛋白质-蛋白质相互作用的调节 (PPIs) 的发展为现代药物发现提供了一种有吸引力的方法。因此, 我们投入了大量的精力研究新的化学模式, 可以有效地调节 PPIs^1,2,3。PPIs 一般由浅, 大, 和/或停止相互作用的表面组成, 小分子通常被认为是不合适的配体为 PPIs^4,5的调制。利用合适的暴露交互表面积, 模拟蛋白质界面结构特征的短肽代表了解决这个问题^6,7的理想候选者。然而, 短肽通常是非结构化的水溶液。这是由于水分子与肽骨干和定义构象的分子内氢键网络竞争, 在水⁸中由熵不利。此外, 肽的固有低稳定性和细胞渗透性的特性在很大程度上限制了它们在生物应用中的应用^9,10。根据蛋白质数据库 (PDB) 分析, > 50% 的 PPIs 涉及短α螺旋相互作用¹¹。因此, 在螺旋稳定方面发展了不同的化学方法。这些包括二硫化物或硫醚类债券形成^12,13,14, 圆环闭合置换¹⁵, 内酰胺圆环形成¹⁶, "点击" 化学¹⁷, 加法perfluoroarenes^18,19, 和乙烯基硫化物形成²⁰。

稳定的螺旋肽广泛用于各种细胞内靶, 包括 p53, 雌激素受体, Ras, BCL-2 家族蛋白, 其他^21,22,23,24。ALRN-6924 是 MDM2 和 MDMX 的全烃类钉式双肽抑制剂, 目前正被用于临床研究²⁵。在过去的几年中, 我们的小组重点研究了使用硫醇烯和硫醇-yne 反应^26,27,28的新的肽稳定方法的发展。总的来说, 我们已经证明, 这些照片引发的反应是有效的温和条件下, 自然丰富的半胱氨酸使用。此外, 我们已经表明, 这些反应具有良好的功能组耐受性, 是生物正交, 并已被证明适用于肽和蛋白质的修改²⁹。由此产生的硫醚类/乙烯基硫化物栓肽在很大程度上改善了约束肽的化学空间, 提供了一种不稳定的系绳修饰中心, 并被证明适用于许多生物应用^{30 ,31,32}。迄今为止, 只有有限的报告被描述的硫醇烯/硫醇-yne 肽环合。在2009年发表的一项研究中, Anseth 了活性烯烃与半胱氨酸之间的肽环合的树脂内分子硫醇烯反应.在 2015年, 秋等。描述了一个双组分基启动的硫醇烯反应的肽吻合³⁴和随后的, 顺序硫醇-yne/烯偶联反应³⁵。最近, 我们描述了一系列的工作基于硫醚类/乙烯基硫化物栓肽^20,26,27。本议定书描述了上述硫醚类/乙烯基硫化物栓肽的详细合成, 希望这将有助于更广泛的研究社区。

1. 设备准备

1. 对于手动多肽合成装置, 放置一个真空流形 (材料表) 在一个有效的油烟机罩。接下来, 将三路 stopcocks 到真空流形上, 并将其连接到氮气或氩气线。使用橡胶隔膜盖所有未使用的入口。
2. 使用三路 stopcocks 连接树脂填充柱 (0.8 x 4 厘米, 10 毫升储层, 见材料表) 到歧管 (图 1)。使用与真空系统连接的泵作为真空过滤器或橡胶吸管灯泡, 通过挤出来去除列中的溶剂。
3. 使用 photoreactor (图 2), 配有十 350 nm 灯 (材料表) 用于紫外线照射。通过 photoreactor 进气口将这些连接到氩气罐, 以确保 photoreactor 在 photoreactions 之前和期间充满氩气。
4. 在打开 photoreactor 的 uv 灯之前, 确保 photoreactor 门关闭, 以防紫外线照射。

2. 树脂制备

注: 一般情况下, 采用 n-芴甲氧羰基基固相肽合成协议进行多肽基质的构建。这些是使用溜冰场酰胺树脂, 它留下一个 C 末端酰胺剩余的肽分裂。此协议在整个文件中使用。

注意: n, n-甲基酰胺 (DMF), 二氯甲烷 (DCM), 4-甲基啉) (NMM), 和n, n-diisoproylethylamine (DIPEA) 是有毒和有害的吸入, 摄取, 或皮肤接触。乙醚是高度易燃的。三氟乙酸酸 (TFA) 具有腐蚀性。12-ethanedithiol (EDT) 是高度恶臭。因此, 所有有机溶剂和化学品应使用适当的个人防护设备 (腈手套, 实验室大衣和防护眼镜) 处理, 并在化学油烟机内处理。

1. 使用以下公式计算所需的树脂量:
   鳞片 (毫摩尔)/(树脂负载能力 (毫摩尔/克) 1000 (毫克/克)) = 树脂质量 (毫克)
   例如, 溜冰场酰胺 MBHA 树脂的数量 (0.5 毫摩尔/克) 为25µmol = 0.025 毫摩尔/(0.5 毫摩尔/克1000毫克/克) = 50 毫克。接下来, 在一列中重50毫克树脂, 用三路 stopcocks 在真空歧管上设置。
2. 在柱体 (0.8 x 4 厘米, 10 毫升储层) 中加入 1-2 毫升的 DCM。要膨胀树脂, 用氮气或氩气流轻轻搅动10分钟。接下来, 用真空过滤法去除溶剂。

3. n-末端 n-芴甲氧羰基脱和洗涤

1. 准备 n-末端 n-甲基芴甲氧羰基 deprotecting 溶液: 在玻璃瓶中准备一个适当体积 (200 毫升) 的 50% (v/v) 啉在 DMF 中。
2. 在树脂上加入 1-2 毫升的脱溶液, 轻轻搅动10分钟, 然后用真空排出溶液。按该顺序使用 DMF (1-2 毫升) 和 DCM (1-2 毫升), 彻底清洗树脂和反应容器, 共3x。接下来, 重复脱和洗涤程序1x。

4. n-芴甲氧羰基保护氨基酸偶联

1. 以丙氨酸渣的偶联为例, 在25µmol 的人工合成情况下, 称 n-芴甲氧羰基-5 equiv, 41.4 毫克, 2-(6-氯-1 h 苯三唑-1-基)-11, 33-tetramethylaminium 六氟磷酸盐 (HCTU; 4.9 equiv, 50.5 毫克) 在聚丙烯容器并将其溶解于 DMF (0.5 毫升)。
2. 添加 DIPEA (10 equiv, 43.5 µl), 以产生0.25 米活化氨基酸溶液 (表 1)。经过大约1分钟的预活化, 加入溶液的树脂, 然后气泡与 N₂约 1-2 小时。
3. 从这一步开始, 将肽链中的每一种氨基酸作为一系列步骤进行整合: 首先是 n-端芴甲氧羰基基团的脱, 然后是洗涤, 然后用 HCTU 活化氨基酸的偶联。
   注: 较长的耦合时间 (e.2 h) 建议, 如果耦合后, sterically 受阻氨基酸残留 [e., n-芴甲氧羰基-胱氨酸 (trt)-哦, n-芴甲氧羰基-他 (trt)-哦, n-芴甲氧羰基-Arg (Pbf)-哦]。含非天然氨基酸的烯烃/炔烃用于3当量而不是 5, 剩下的反应为 3 h。
4. 用阿罗拉等四氯苯醌的方法, 监测肽合成的进展情况。³⁶这些测试提供了对游离初级和次级胺的存在或缺失的定性评估。或者, 大约 2-3 毫克的肽可以从树脂中, 并通过 LC-MS 分析。

5. 硫醇烯 Hydrothiolation 和硫醇-yne 环合

1. 通过树脂环合来构造硫醚类链接器 (图 3)。
   1. 准备大约50毫升的 Trt 脱解决方案 (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0)。将胱氨酸-和 mS₅轴承树脂 [NH₂-r-ms₅a a a a 胱氨酸 (Trt) r ' 树脂, 50 毫克] 与 1-2 毫升的 Trt 脱溶液在10毫升的专栏。用 N₂轻轻搅动溶液10分钟。最后, 用 DCM (1-2 毫升) 清洗, 共3x。
      注: MS₅代表亚烷基构造块 (参见图 6中描述的结构), 用于肽偶联和硫原子环合³⁸。
   2. 重复上述过程总共约 6x, 以删除半胱氨酸的三苯甲胺保护组, 直到解决方案颜色不再是黄色。
   3. 冒泡与 N₂, 洗涤的 r-mS₅a a-胱氨酸 (sh) r ' 树脂 [半胱氨酸与游离硫 (SH)] 与 DMF (1-2 毫升) 和 DCM (1-2 毫升) 按此顺序。用甲醇 (1-2 毫升) 收缩树脂2分钟, 然后用过滤法去除溶剂。接下来, 在₂气体的蒸汽下依次干燥树脂, 在柱中约5分钟。
   4. 在嘴瓶内预先准备脱气 DMF, 通过将氮气泡在一个长针上, 并将其拉伸到溶剂中, 使其在大约1小时内起泡。
   5. 通过称重纸将树脂转化为10毫升的圆底烧瓶。将树脂悬浮在脱气 DMF 的2毫升内, 然后加入光 2-羟基 1-[4-(2-hydroxyethoxy)-苯基]-2-甲基 1-丙酮 (基质金属蛋白酶; 1 equiv, 5.6 毫克), 4-methoxyacetophenone (地图; 1 equiv, 3.8 毫克)。
   6. 在烧瓶中加入搅拌杆 (0.3 厘米), 用合适的橡皮塞将烧瓶盖上, 然后用油泵将瓶中的空气置换成氮气。
      注: 在固相中, 有效的硫-烯 photoreaction 不需要严格的惰性气氛。然而, 在图 5中, 在溶液阶段的硫 yne photoreaction 是非常必要的。否则, 在紫外线照射时硫磺会氧化。
   7. 将反应瓶设置成 photoreactor, 在室温下紫外线照射下将树脂搅拌1小时 (图 2)。
      注意: 在切换 photoreactor 紫外线灯之前, 确保 photoreactor 门关闭, 以防紫外线照射有害辐射。
      注: 在 photoreactions 中经常取样反应混合物, 建议新的序列, 因为线性肽前驱体具有相同的分子量的产品。一般情况下, 线性和循环多肽的亲水性明显不同。这可以很容易地区分使用 HPLC。另外, 55 '-dithiobis (2 硝基苯甲酸) (DTNB) 试剂也可以用来研究游离硫醇³⁷的存在。
   8. 将树脂从烧瓶中转移到柱上, 用真空过滤去除溶剂。按照步骤5.1.3 中所述, 清洗和烘干树脂。
   9. 准备大约 10 毫升的鸡尾酒 ( TFA / 小贴士 / EDT / H₂O 94 / 1 / 2 . 5 / 2 . 5 ) 在通风罩。
   10. 将树脂转移到2毫升的聚丙烯容器中, 加入1毫升的裂解鸡尾酒 (TFA/小贴士/EDT/H₂O 94/1/2.5/2.5) 到容器中, 并用螺钉盖紧密封容器。然后, 用 60 rpm 的速度在一个轨道振动筛上轻轻搅动 1.5-2 h 的容器。
       注意: TFA 具有很强的腐蚀性。穿着防护服, 在有效的油烟机中工作。EDT 是一种高度恶臭的物质, 必须处理在一个有效的油烟机。
   11. 在通风罩中的 N₂气体流下蒸发, 除去 TFA 鸡尾酒。接下来, 用冷二乙基醚 (1 毫升) 在三十年代沉淀残余物, 并通过离心 1.2万 x g 将其分离2分钟。离心后, 轻轻地将乙醚组件倒出来。重复2x 的沉淀和离心步骤。把残渣蒸发乾燥。
   12. 最后, 用 C18 分析柱 (4.6 x 250 毫米, 流速1.0 毫升/分) 溶解1毫升 H₂/乙腈 (2:1) 中的残留物, 并用 HPLC 纯化。使用 H₂O (含 0.1% TFA) 和纯乙腈作为溶剂在 2%/分钟线性梯度从20% 到70% 乙腈超过25分钟. 用紫外 280 nm 和 220 nm 波长 (表 2) 监测 HPLC 谱。
2. 通过分子间硫-烯反应建立硫醚类链接器, 然后通过 macrolactamization cyclize 肽 (图 4)。
   1. 采用标准的 n-芴甲氧羰基基固相肽合成 (许可证), 在步骤 2-4 中所述, 合成了含线性肽 H₂n-a a a-a-a-₅(2 r ") R ' 树脂 (50 毫克) 的亚烷基残留物。接下来, 洗涤和干燥的树脂, 如步骤5.1.3 所述。
   2. 将树脂悬浮在含有2毫升脱气 DMF 的10毫升圆底烧瓶中, 如步骤5.1.4 所述。
   3. 添加光基质金属蛋白酶和地图 (基质金属蛋白酶: 1 equiv, 5.6 毫克;图: 1 equiv, 3.8 毫克), n-芴甲氧羰基-胱氨酸-OH (3 equiv, 25.7 毫克), 和搅拌棒 (0.3 厘米) 进入烧瓶。用合适的橡皮塞盖住烧瓶, 然后用油泵用氮气代替瓶子里的空气。
   4. 把反应瓶放进 photoreactor。在室温下, 在紫外线照射下搅拌 1-2 小时 (图 2)。
   5. 在 LC-MS 分析下监测反应: 使用裂解鸡尾酒对树脂进行 2-3 毫克的劈裂。然后用冷二乙基醚 (300 µL) 沉淀渣, 通过离心分离残渣, 并将残留物蒸发至干燥, 如步骤5.1.11 所述。然后, 在100µL₂/乙腈 (2:1) 中溶解残渣。用 0.22-µm 微孔膜滤过多肽溶液, 并用 LC-MS 与电喷雾电离 (ESI) 中的复合电离进行分析, 并以正向模式进行操作。
   6. 如有必要, 重复步骤 5.2.2 5.2.4 以确保反应完成。
   7. 光反应完成后, 将树脂从烧瓶中转移到柱体中, 用真空过滤去除溶剂。按照步骤5.1.3 中所述, 清洗和烘干树脂。
   8. 添加 benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium 六氟磷酸盐的 DMF 溶液 (PyBob; 2.4 equiv, 31.2 毫克), 1-hydroxybenzotriazole (对 hobt; 2.4 equiv, 8.1 毫克), NMM (4 equiv, 11 µL) 的树脂在列为 macrolactamization。用 N₂来泡这个溶液2小时。
      1. 此外, 按照步骤5.2.3 中的描述, 使用 LC MS 来监测这种耦合反应。如有必要, 重复此步骤以确保反应完成。
   9. 用标准的 n-芴甲氧羰基基许可证延长肽, 如步骤3和4所述。
   10. 在组装所有氨基酸残留物时, 将肽从树脂中分离出来, 如步骤5.1.10 和5.1.11 中所述, 并在步骤5.1.12 中加以纯化。
3. 在溶液阶段构造乙烯基硫化物链接器 (图 5)。
   1. 用标准的 n-芴甲氧羰基基许可证合成炔烃残留量的线性肽, 如步骤 2-4 所述。根据前一项研究²⁰中所述的一项完善的协议, 合成炔烃轴承氨基酸。
   2. 将肽从树脂中劈开, 用冷二乙基醚沉淀, 如步骤 5.1.9-5.1.11 中所述。在树脂的裂解和沉淀之后, 用离心法收集 1.2万 x g 的肽以2分钟。
   3. 在真空中干燥所产生的残余物。将脱气 DMF (50 毫升) 中的残渣溶解在100毫升圆底烧瓶中, 以达到最终浓度0.5 毫米 (根据树脂的负载, 0.025 毫摩尔 (1000 毫升/升/0.5 毫摩尔/升) = 50 毫升)。
      1. 添加光 DMPA (0.5 equiv, 3.2 毫克), 然后德加的反应解决方案10分钟使用 N₂通过长针延伸到溶液中。接下来, 在室温下将样品照射到紫外线下 0.5-1 小时, 无需搅拌。
   4. 在高真空下去除 DMF, 加入二乙醚沉淀粗渣, 以溶解其有机副产品。然后, 用离心法将残渣分离 1.2万 x 克, 2 分钟。离心后, 轻轻地将乙醚组件倒出来。把残渣蒸发乾燥。最后, 在1毫升的 H₂/乙腈 (2:1) 中溶解残留物, 并使用液相色谱法对其进行纯化, 如步骤5.1.7 所述。

用树脂内分子内硫醇-烯 photoreaction YmS5AAAC-nh2及其环化烯产品 ac Y (环-15)-[MS5AAAC]-nh2的 HPLC 和 MS 谱, 在图中描述6B. 循环肽与其线性前体相比具有相同的分子量。然而, 在相同的分离条件下, 其液相色谱保留时间比其前体早约2分钟。有不同序列的短肽都被观察到有一个良好的转换, 如图 6C所示。

在图 7B中描述了硫 yne photoreaction 条件的筛选过程, 并利用反相 HPLC 积分法确定了异构体的转化率和比。紫外线照射后, 仅观察到肽2c 的微量含量。这很可能是由于构象倾向于在 N 终点的 thiyl 基的陷印, 在收缩步骤到 20-元环。两个肽1a 和1b 被发现产生两个异构体与8成员的乙烯基硫化物交联。肽 2 a a 和 2 a B, 这是由肽1a 生成, 表现出不同的保留时间以及不同的比率为不同的紫外线照射时间 (0-30 分钟) (图 7C)。这些被分配了作为 E/Z 异构体由于双重键质子信号在1h-核磁共振光谱学 (图 7D)。在肽 2 d-2 f 的情况下, Z 异构体被发现是主导产品。这很可能是由于在构建一个紧凑结构相对于8成员的乙烯基硫化物交联的构象偏好。如图 7E所示, 根据圆形二色谱 (CD) 谱, 2 a a/b 和 2 b a/b 的多肽, 拥有8成员的乙烯基硫化物交联显示一个随机线圈, 而肽2d 拥有7成员的乙烯基硫化物交联展示了螺旋构象。总之, 乙烯基硫化物粘结的 Z 异构体被发现是优先形成的, 表现出更好的螺旋诱导。

图 1: 用于固相肽合成的手动肽合成装置.柱被放置在真空流形上通过三路 stopcocks 和仪器连接到氮气或氩气线为冒泡。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 用于 photoreactions 的 photoreactor 设备.该装置配备了十350纳米灯 (材料表), 用于紫外线照射和氩气罐, 以确保 photoreactor 在 photoreactions 之前和期间充满氩气。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 在短肽的情况下, 树脂内分子内硫醇烯反应.这一反应是使用脱的三苯甲酯的树脂, 在完全合成的线性肽后, 然后设置树脂的紫外线照射使用光引发剂地图和基质金属蛋白酶。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: 在树脂分子间的硫-烯反应.这种反应是通过溶解 n-芴甲氧羰基胱氨酸-OH 在 DMF 溶剂, 然后辐照与烯烃含肽残留在树脂, 其次是 macrolactamization 使用 PyBop, 对 hobt, NMM 作为活化试剂。然后使用标准许可证继续进行肽的合成。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 溶液相中的分子内硫醇-yne 反应.这一反应是在溶液阶段进行的, 在完全合成的线性肽, 之后, 线性肽被溶解在脱气 DMF 和辐照使用紫外光与光 DMPA。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 用树脂内分子硫醇烯反应产生的硫醚类栓循环肽.这个面板显示了树脂内分子内硫-烯反应的方案。mS5: "m" 代表单取代 olenic 氨基酸, "s" 代表 S 配置的氨基酸, "5" 指的是侧链原子的数量38。这个面板显示了肽交流-YmS5AAAC-NH2在其环化之前和之后的 HPLC 和 MS 谱。这个面板显示了不同序列的循环肽的转换。这一数字已从赵, B等28 修改. 请点击这里查看这个数字的大版本.

图 7: 通过照片诱导的硫醇-yne hydrothiolation 肽装订.这是分子内硫醇-yne hydrothiolation 的示意图。这个小组显示了在本研究中评价的肽序列。启动器: (I) 0.5 eq DMPA, 1 h;(二) 没有发起者, 1 h;(III) 0.5 情商 DMPA, 0.5 情商图, 1 小时;(IV) 0.5 eq, 0.5 小时. 此面板显示了不同紫外照射时间的肽1a 反应混合物的 HPLC 示迹, 并监测了 220 nm。D. 这个小组显示了1的 H 核磁共振光谱 1a, 2 a a 和 2 a B (测量在 DMSO-d6 在400兆赫)。星号表示紫外辐照后乙烯基硫化物双键的形成。E. 此面板显示了含乙烯基硫化物交联的多肽的循环二色谱谱。这一数字已由天, Y等人修改。44请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 耦合条件的数量。

表 2: 高效液相色谱条件。

作者没有什么可透露的。