我们介绍一种利用光诱导的硫醇-烯/硫醇-炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽的实验方案。
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方法文章
通过光诱导硫醇-烯/炔加硫醇化反应构建含硫醚/乙烯基硫醚连接的螺旋肽
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
在此，我们描述了一种利用树脂上分子内/分子间硫醇-烯烃加硫醇化反应制备硫醚连接肽的详细方案。此外，本方案还介绍了通过溶液中分子内硫醇-炔烃加硫醇化反应制备乙烯基硫醚连接肽的方法，该反应发生在侧链含烯烃/炔烃的氨基酸与位于i, i+4位置的半胱氨酸残基之间。线性肽采用标准的Fmoc基固相肽合成法（SPPS）进行合成。硫醇-烯烃加硫醇化反应根据肽链长度的不同，可选择分子内或分子间硫醇-烯反应方式进行。在本研究中，对于较短的肽链，在完成线性肽的全合成后，首先在树脂上脱除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基，随后进行分子内硫醇-烯反应。然后加入光引发剂4-甲氧基苯乙酮（MAP）和2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮（MMP），对树脂进行紫外光照射。分子间硫醇-烯反应则通过将Fmoc-Cys-OH溶于 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶剂。随后，利用树脂上带有烯烃的残基与肽进行反应。接着，在树脂上使用苯并三氮唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBop）、1-羟基苯并三氮唑（HoBt）和4-甲基吗啉（NMM）作为活化试剂进行大环内酰胺化反应。完成大环内酰胺化后，继续采用标准固相肽合成法（SPPS）进行肽链的延伸。在硫-炔氢硫化反应的情况下，将线性肽从树脂上裂解下来，干燥后溶于脱气的DMF中。然后在光引发剂2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（DMPA）存在下用紫外光照射。反应完成后，蒸发除去DMF，粗产物经沉淀并采用高效液相色谱法（HPLC）纯化。这些方法有望简化含硫醚键环肽的制备，得益于硫-烯/炔点击化学反应具有优异的官能团耐受性和较高的产率。将硫醚键引入肽分子中，可利用半胱氨酸残基的亲核性，且相较于二硫键，硫醚键具有氧化还原惰性。
引言
开发用于调控蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）的配体，为现代药物发现提供了一种极具吸引力的策略。因此，大量研究致力于探索能够有效调控PPIs的新型化学模态1,2,3。PPIs通常涉及浅表、大面积和/或不连续的相互作用界面，因此小分子通常被认为不适合用于调控PPIs4,5。当存在合适的暴露相互作用表面积时，能够模拟蛋白质界面结构特征的短肽是解决这一问题的理想候选分子6,7。然而，短肽在水溶液中通常缺乏明确的结构，这是因为水分子会与肽骨架的分子内氢键网络发生竞争，导致在水中形成明确构象在熵上不利8。此外，肽类固有的低稳定性和细胞通透性在很大程度上限制了其在生物应用中的使用9,10。根据蛋白质数据库（PDB）的分析，>50%的PPIs涉及短α-螺旋相互作用11。因此，已发展出多种化学方法用于螺旋结构的稳....
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方案
1. 仪器设备准备
- 对于手动多肽合成装置，将真空多联管（材料表）置于通风良好的通风橱中。随后，将三通旋塞安装到真空多联管上，并将其连接至氮气或氩气管线。使用橡胶隔垫封闭所有未使用的入口。
- 通过三通旋塞将装有树脂的柱子（0.8 × 4 cm，10 mL 储液端，参见 材料表）连接至多联管（图1）。使用连接至真空系统的泵进行抽滤，或通过挤压橡胶洗耳球去除柱中的溶剂。
- 使用配备十个350 nm 灯管的光反应器（图2）进行紫外照射（材料表）。通过光反应器的进气口将灯管连接至氩气瓶，以确保在光反应开始前及进行过程中，光反应器内部充满氩气。
- 在开启光反应器的紫外灯之前，务必确认光反应器门已关闭，以防紫外光辐射外泄。
2. 树脂准备
注意：通常，多肽底物的构建采用基于Fmoc的固相多肽合成方法。该方法使用Rink酰胺树脂，使多肽裂解后保留C端酰胺。本文中均采用此方案。
警告：N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二氯甲烷（DCM）、4-甲基吗啉（NMM）和<....
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结果
采用树脂上分子内硫醇-烯烃光反应生成的肽 Ac-YmS5AAAC-NH2 及其环化产物 Ac-Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC]-NH2 的 HPLC 和 MS 谱图如图6B所示。环状肽的分子量与其线性前体相同，但在相同的分离条件下，其 HPLC 保留时间比前体肽约提前 2 分钟。不同序列的短肽均表现出良好的转化率，如图6C所示。
硫代炔光反应条件的筛选过程如图7B所示，异构体转化率及比例通过反相高效液相色谱（HPLC）积分测定。在紫外光照射后仅观察到微量的肽2c。这可能是由于在形成20元大环的缩合步骤中，硫醇自由基在N端被捕获的构象偏好所致。肽1a和1b均生成了两种具有8元.......
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讨论
在图3所述的树脂上分子内硫-烯环化反应中，发现去除半胱氨酸残基的三苯甲基保护基是后续光反应的关键步骤。此外，反应前后肽的分子量相同，如图6B所示。因此，必须使用高效液相色谱（HPLC）鉴定或DTNB测定法来监测反应进程。对于图4所述的分子间硫-烯反应，需通过质谱（MS）进行监测。尽管构建硫醚交联结构还需额外的内酰胺偶联步骤，但我们建议将该方案用于较长肽段，以实现更高的整体反应效率。
硫代炔光化学反应生成的乙烯基硫醚键在用于树脂裂解的强酸性三氟乙酸（TFA）溶液中不稳定。因此，采用在溶液相中进行硫代炔光化学反应。该反应被稀释至较低浓度（0.5 mM），以避免潜在的分子间副反应。同样重要的是，需对溶剂进行脱气处理，以防止光化学反应过程中产物被氧化。反应完成后，应小心进行有机溶剂DMF的真空蒸发，以避免肽的氧化或降解，以及设备的腐蚀损耗。图5所示的硫代.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢国家自然科学基金（项目编号：21372023、21778009 和 81701818）；中华人民共和国科学技术部（项目编号：2015DFA31590）；深圳市科技创新委员会（项目编号：JCYJ20170412150719814、JCYJ20170412150609690、JCYJ20150403101146313、JCYJ20160301111338144、JCYJ20160331115853521、JSGG20160301095829250 和 GJHS20170310093122365）；以及中国博士后科学基金（项目编号：2017M610704）提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Rink Amide MBHA 树脂（0.53 mmol/g） | HECHENG | GRM50407 | |
| 标准 Fmoc 保护氨基酸 | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | ||
| N-甲基-2-吡咯烷酮 | 深圳恩迪生物科技有限公司 | 3230 | 对皮肤有害 |
| N,N-二甲基甲酰胺 | Energy | B020051 | 对皮肤有害 |
| 二氯甲烷 | Energy | W330229 | 对皮肤有害 |
| N,N-二异丙基乙胺 | Aldrich | 9578 | 刺激性 |
| 三氟乙酸 | J&K | 101398 | 腐蚀性 |
| 三异丙基硅烷 | J&K | 973821 | |
| 1,2-乙二硫醇 | J&K | 248897 | 恶臭 |
| 2-(6-氯-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基六氟磷酸铵 | GL Biochem (Shanghai) Ltd. | 851012 | |
| 吗啉 | Aldrich | M109062 | 刺激性 |
| 乙醚 | Aldrich | 673811 | 易燃 |
| 乙腈 | Aldrich | 9758 | 有毒 |
| 甲醇 | Aldrich | 9758 | 有毒 |
| 2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮 | Energy | A050035 | |
| 4-甲氧基苯乙酮 | Energy | A050098 | |
| 2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮 | Energy | D070132 | |
| 5,5'-二硫双(2-硝基苯甲酸) | J&K | 281281 | |
| 苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐 | Energy | E020172 | |
| 1-羟基苯并三唑 | Energy | D050256 | |
| 4-甲基吗啉 | Energy | W320038 | |
| 高效液相色谱 | SHIMADZU | LC-30AD | |
| 电喷雾电离质谱 | SHIMADZU | LCMS-8030 | |
| 冷冻干燥机 | Labconco | FreeZone | |
| SpeedVac 浓缩系统 | Thermo | Savant | |
| 真空 manifold | promega | A7231 | |
| 三通旋塞阀 | Bio-Rad | 7328107 | |
| 聚丙烯层析柱 | Bio-Rad | 7311550 |
参考文献
- Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
- Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H.
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