利用新型细胞分选策略从鼠骨髓中大量生成髓系祖细胞和树突状细胞前体

摘要

本文提供了一种利用高速细胞分选技术鉴定并分离大量由GM-CSF驱动的髓系细胞的方法。根据Ly6C和CD115的表达情况，可鉴定出五种不同的细胞群体（共同髓系祖细胞、粒细胞/巨噬细胞祖细胞、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞以及单核细胞来源的树突状细胞）。

摘要

近年来，人们认识到利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）从小鼠骨髓诱导生成的单核细胞来源树突状细胞（moDC）培养物比以往所认为的更具异质性。这些培养物通常不仅包含moDC，还含有单核细胞来源的巨噬细胞（moMac），甚至一些发育程度较低的细胞，例如单核细胞。本实验方案的目标是提供一种稳定的方法，用于识别和分离这些培养物在发育过程中存在的多种细胞类型，以便进一步研究它们各自的功能。本文介绍的分选策略首先根据Ly6C和CD115的表达情况将细胞分为四个群体，这两种分子在GM-CSF驱动的培养过程中均呈短暂表达。这四个群体包括：共同髓系前体细胞（CMP，Ly6C⁻, CD115⁻）、粒细胞/巨噬细胞前体细胞（GMP，Ly6C⁺, CD115⁻）、单核细胞（Ly6C⁺, CD115⁺）以及单核细胞来源的巨噬细胞（moMac，Ly6C⁻, CD115⁺）。分选策略中还加入了CD11c的检测，以区分Ly6C⁻, CD115⁻群体中的两个亚群：CMP（CD11c⁻）和moDC（CD11c⁺）。最后，在Ly6C⁻, CD115⁺群体中，可根据MHC II类分子的表达水平进一步区分两个亚群：moMac表达较低水平的MHC II类分子，而单核细胞来源的树突状细胞前体（moDP）则表达较高水平的MHC II类分子。该方法可稳定分离出多个发育阶段不同的细胞群体，且数量足以满足多种功能与发育分析的需求。我们以其中一种功能检测为例，展示了这些细胞类型对病原体相关分子模式（PAMPs）刺激的不同反应特性。

引言

利用细胞因子粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, GM-CSF）培养小鼠骨髓细胞，是一种广泛用于大量生成单核细胞来源的树突状细胞（moDC；也称为炎症性树突状细胞）的方法^1,2,3,4,5。这些细胞在多种树突状细胞（DC）功能研究中具有重要价值^6,7,8。通常情况下，这些小鼠骨髓细胞需培养6–8天，随后用于树突状细胞功能的研究⁵。长期以来，此类培养物被认为具有较高的均一性，主要由已分化的moDC组成。然而，近年来的研究表明，在6–8天培养结束时，培养体系中不仅存在大量moDC，还包含一个显著的单核细胞来源的巨噬细胞（moMacs）亚群^9,10,11。我们先前的研究进一步证实，即使在培养7天后，仍存在少量其他发育阶段较早的细胞亚群，例如moDC前体细胞（moDP）和单核细胞¹⁰。因此，利用该体系生成的细胞进行树突状细胞（DC）功能研究时，其观察到的反应可能反映了比以往认知更为广泛的多种细胞类型的共同作用。

通过对GM-CSF诱导生成的moDC的研究，我们已深入了解这些细胞在终末分化阶段的功能 ^12,13,14。然而，关于这些细胞的发育通路 ^2,15,16，以及它们在何时、以何种方式表现出特定功能（如对病原体相关分子模式（PAMPs）的响应、吞噬作用、抗原加工与呈递 ¹³以及抗菌活性）等方面，我们的认识仍十分有限。已有研究报道了一种用于分离大量传统Flt3L驱动的树突状细胞（DC）祖细胞和前体细胞的方案 ¹⁷。该方法通过使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的骨髓细胞（用于追踪分裂细胞）并在Flt3L中培养3天来实现这些不同细胞群体的分离。随后去除谱系阳性细胞，并根据CD11c的表达水平将细胞分选为祖细胞和前体细胞群体 ¹⁷。Leenen研究组提出的另一种在GM-CSF驱动培养体系中鉴定DC早期祖细胞的方法，是基于CD31和Ly6C的表达进行细胞分选¹⁸。本研究的最初目标是建立一种类似的方法，用于获取GM-CSF驱动的moDC的祖细胞和前体细胞。鉴于GM-CSF所诱导产生的特定细胞类型，我们调整了分选策略，依据发育早期和晚期阶段表达的分子标志物进行细胞分离。最终我们确定，Ly6C、CD115（CSF-1受体）和CD11c是区分这些细胞类型的最佳标志物 ¹⁰。

本文介绍了一种方法，用于分离在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）驱动的分化通路中处于不同发育阶段的细胞：共同髓系祖细胞（CMP）、粒细胞-巨噬细胞祖细胞（GMP）、单核细胞、单核细胞来源的巨噬细胞（MoMac）以及单核细胞来源的树突状细胞（MoDC）。根据MHC II类分子表达水平的不同，可进一步将MoMac群体进行分离，从而鉴定出一种MoDC前体细胞群体（moDP） ¹⁰。我们采用高速荧光激活细胞分选（FACS）策略，依据Ly6C、CD115和CD11c的表达情况，分离上述五种细胞群体。随后，我们通过功能实验检测这些细胞对病原体相关分子模式（PAMP）刺激的反应能力。

方案

所有动物实验均经奥本大学机构动物护理和使用委员会批准，符合美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中所述的建议。

1. 骨髓采集的准备工作

1. 通过将含有10%胎牛血清、2 mM谷氨酰胺和50 µM 2-巯基乙醇的Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基溶液加入至0.22 µm真空过滤装置的顶部，并施加真空，制备250 mL完全培养基。
   注意：完全培养基可在4 °C保存最多2个月。
2. 在500 mL烧瓶中，将350 mL 100%乙醇与150 mL无菌H₂O混合，配制70%乙醇溶液。
3. 将离心机设定为4 °C。
4. 将镊子、手术刀和剪刀在70%乙醇中进行灭菌处理。
5. 使用移液管向三个60 mm培养皿中各加入5 mL完全培养基。
6. 使用移液管向一个50 mL锥形管中加入30 mL完全培养基。

2. 小鼠骨髓细胞的收集

1. 通过 CO₂ 处死一只 C57BL/6 小鼠₂ 根据2013年美国兽医协会（AVMA）《安乐死指南》规定的标准实施麻醉。
2. 去除并剥离后肢。
   1. 用75%乙醇浸透后肢和躯干，用弯头组织剪在髋关节周围皮肤上做浅切口。用镊子从髋部向下牢固地拉扯皮肤至踝部，暴露肌肉。用剪刀移除皮肤瓣。
   2. 通过在股骨/髋关节上方的骨骼处切割，取下整个后腿。
      注意：除了对操作区域进行消毒外，乙醇还有助于实现干净的切割，并防止毛发污染样本。
   3. 若需将腿部转移至新位置以采集骨髓，应将腿部浸入完全培养基中。
3. 在无菌生物安全柜中操作，将腿部组织转移至一个预先准备好的培养皿中。
4. 使用剪刀在踝关节下方剪断，并尽可能仔细地去除大部分肌肉和弹性结缔组织。将清理后的骨骼转移至第二个已准备好的培养皿中。
   注意：虽然无需去除全部肌肉组织，但残留过多组织可能会妨碍骨髓的冲洗。
5. 分离股骨、膝关节和胫骨。
   1. 用镊子夹住腿部膝关节处，找到骨髓。
      注意：骨髓应表现为股骨顶端和胫骨末端骨腔内一条淡红色的细线。
      1. 使用剪刀进行如下三次切割。
         1. 在胫骨骨髓似乎终止的位置上方进行截断。
         2. 在膝关节下方进行切割。
         3. 在膝关节上方进行切割。
         4. 如果髋关节仍与股骨相连，则在髋关节下方进行切割。
      2. 将三个片段放回培养皿中，并在另一条腿上重复此过程。
6. 从股骨和胫骨中冲洗出骨髓。
   1. 从50 mL离心管中吸取完全培养基至10 mL注射器，并接上23 G针头。
   2. 用镊子夹住骨骼置于第三个已准备好的培养皿上方，将针头插入骨髓腔，推注培养基以冲洗出细胞（细胞可能以完整组织团块形式流出） "塞子" 或呈多个簇状）。重复操作，直至透过骨骼看不到更多颜色为止。根据需要，重新向注射器中添加培养基。
7. 压碎骨骺。
   1. 仍在第二个培养皿中时，用镊子牢固夹住膝关节软骨，用注射器尖端压碎膝部。持续操作直至骨骺不再呈红色。
8. 使用移液器将第二和第三个培养皿中的细胞转移至50 mL离心管中。通过轻柔吹打使细胞团块分散，尽量避免产生气泡。在250 x g 4 °C 下孵育 10 分钟
9. 裂解红细胞
   1. 用血清移液管吸除上清液，轻弹管底使沉淀松动，加入1 mL ACK（氯化铵-氯化钾）裂解缓冲液，室温孵育1分钟以裂解红细胞。
   2. 使用血清移液管加入 40 mL HBSS（Hanks 平衡盐溶液）缓冲液。
10. 使用血清移液管将细胞通过70 µm细胞滤网过滤至新的50 mL锥形管中。在250 x g 4 °C 下 10 分钟
11. 使用血清移液管吸除上清液，并用 40 mL 完全培养基洗涤细胞。在 250 x g 4 °C 下 10 分钟
    注意：在此阶段，可通过流式细胞分选（FACS）或磁珠柱分选去除谱系阳性淋巴细胞。然而，淋巴ocytes在体外培养中无法长期维持。尽管在骨髓的Ly6C-CD115-细胞群中存在大量谱系阳性细胞 离体，到第5天时几乎全部消失图2).
12. 使用血清移液管吸除上清液，然后将骨髓细胞接种于完全培养基中，加入10 ng/mL重组小鼠GM-CSF，细胞密度为1 x 10⁶ cells/mL
    注意：通常为 4 x 10⁷ 在红细胞裂解后可收获总细胞。但预计细胞数量可能低至 2 x 10⁷ 适用于初学者，最高可达 5 x 10⁷ 有经验的收获者适用的细胞
13. 使用血清学移液管将细胞转移至组织培养板中，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育₂若使用24孔板，每孔接种2 mL细胞悬液。
14. 每 48 小时，使用血清移液管移除一半培养基，并补充新鲜的完全培养基和 GM-CSF。
    注意：培养物最长可保存9天，但其成分会随时间发生变化。更多信息请参见第3节。

3. 选择分选日期

1. 由于细胞群体组成随时间变化，应选择目标细胞数量最多的培养时间点。
2. 参见表1，了解在GM-CSF中培养3、5和7天后，每1 × 10⁷个细胞分选后各细胞群体的预期细胞得率。

4. 染色策略

1. 使用少量细胞 aliquot 制备对照样本。包括未染色对照、每种荧光抗体单独染色的补偿对照，以及除一种抗体外其余抗体均加入的荧光减一对照（fluorescence-minus-one control），以校正该检测通道的非特异性荧光。若采用间接标记法，需包括仅加一抗、仅加二抗以及一抗和二抗均添加的对照。
   注意：当联合使用时，藻红蛋白（PE）和别藻蓝蛋白（APC）标记的抗体可实现明显分离且串色极少。然而，若荧光染料选择有限，需注意CD115表达水平相对较低，而Ly6C表达水平非常高。因此，抗CD115抗体宜选用较亮的荧光染料，而抗Ly6C抗体的荧光染料则应选择以避免荧光串色。
2. 在50 mL锥形管中，将97 mL预冷的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）与3 mL胎牛血清混合，配制100 mL FACS洗涤缓冲液（FWB），并置于冰浴中。
3. 使用移液器轻柔但彻底地上下吹打细胞，以去除任何松散贴壁的细胞。
4. 使用血清移液管将细胞转移至50 mL锥形管中。在250 x g 4 °C 下 10 分钟
   1. 如果细胞体积超过50 mL，将细胞转移至所需数量的离心管中，并在染色步骤合并。
5. 轻轻倒去上清液，用移液管加入30 mL FWB重悬细胞沉淀进行洗涤。250 x g 4 °C 下离心 10 分钟，重复洗涤一次。
   注意：如果预期细胞死亡率较高，可用含低至0.5%胎牛血清（FCS）的FWB洗涤细胞，以防止细胞聚团。
6. 根据抗体生产商的说明悬浮并染色细胞。
   1. 将5 × 10⁶细胞悬浮于⁷ 1 mL FWB 中的细胞，加入 2 µg 带有荧光染料标记的抗 Ly6C 抗体和 2 µg 带有荧光染料标记的抗 CD115 抗体（荧光染料由研究人员自行选择）。为进一步区分 CMP 与 moDC（两者均为 Ly6C 阴性和 CD115 阴性），加入 2 µg 抗 CD11c 抗体（CMP 为 CD11c 阴性）^-；moDC 为 CD11c⁺）。冰上孵育30分钟。
      注意： 图3 使用 Ly6C-PE 和 CD115-APC 生成。
7. 使用血清移液管加入 10 mL FWB，于 250 x g 4 °C 下孵育 10 分钟。
8. 轻轻倒出上清液，然后用血清移液管加入30 mL FWB重悬沉淀细胞进行洗涤。以250 x g 4 °C 下离心 10 分钟，重复洗涤一次。
9. 在悬浮细胞前，用力轻弹离心管以充分松动沉淀。使用刻度移液管将细胞重悬于 1 x 10⁷ 每毫升FWB中加入细胞，经35-µm细胞滤器过滤。使用血清学移液管将过滤后的细胞转移至聚丙烯管中，置于冰上保存，待分选时使用。
   注意：如果无法获得聚丙烯材料，可使用蛋白质包被（脱脂干奶或FCS）的聚苯乙烯管以减少结合。

5. 根据对照样本设置门控

注意：为防止高速流动液流压力导致细胞破裂，细胞分选时应使用 100–130 µm 的喷嘴。

1. 将未染色对照样本（见步骤 4.1）上样至流式细胞分选仪，并设置门控以排除微小碎片（前向散射光信号低；FSC）和高颗粒性（侧向散射光信号高；SSC）的颗粒。
   1. 若仅分析后期阶段细胞（单核细胞、moMac/MoDP 和 MoDC），则通过门控仅包含体积较大的细胞（FSC 信号高）。
   2. 若使用了活力染料，可利用其排除染色的非活细胞事件（示例见图 1）。
2. 将单荧光对照样本上样至流式细胞分选仪，并根据需要调整补偿参数。
3. 上样多标记样本，观察到四个明显不同的细胞群：Ly6C+CD115-（GMPs）、Ly6C+CD115+（单核细胞）、Ly6C-CD115+（moMacs/moDP）和 Ly6C-CD115-（CMPs/moDCs）。对这四个主要细胞群分别设置门控以进行分离。
   注意：CMPs 与 moDC 具有相同的 Ly6C-CD115- 表型，但可根据 CD11c 的表达水平加以区分：CMP 不表达 CD11c，而 MoDC 表达 CD11c。

6. 分离群体的收集

1. 通过向收集管中加入足量的 FCS，使管子装满时终浓度至少达到 20%。例如，若使用 5 mL 的管子，则分选前先加入 1 mL FCS，并在总体积达到 5 mL 时移走该管。
2. 为防止膜转运和抗体摄取，整个分选过程中所有样品（混合和已分选的）均需保持在 4 °C。
   1. 若无法实现此条件，则尽可能将待分选细胞的管子置于冰上，并根据需要将等分试样转移至分选仪。
   2. 此外，每 20–30 分钟将已分选的样品转移至冰上一次。
3. 收集到目标数量的细胞后，使用血清移液管将细胞转移至新的锥形管中，在 4 °C 下以 250 x g 离心 10 分钟。
   1. 通过分选后对每个收集群体的小量等分试样进行分析，确认纯度。
4. 弃去上清液，加入 10 mL FWB 重悬细胞，在 4 °C 下以 250 x g 离心 10 分钟。共重复洗涤两次。
   注意：在不扰动沉淀的情况下完全去除上清液可能较困难。可将移液管头连接至真空管线以辅助去除。若无此设备，建议将上清液收集至新管中，以防沉淀解离。
5. 第二次洗涤后弃去上清液。
6. 若用户的实验设计要求细胞重新培养，则执行步骤 2.12–2.14；否则，若细胞将用于即时分析，则根据所需方案处理细胞。
   注意：典型的功​​能分析示例见图 4。

结果

为了尽可能保留更多的通道用于分析，通常根据前向散射和侧向散射选择活细胞，排除体积过小和颗粒度过高的事件（典型的设门策略应用于图1A中的所有散点图）。为了确定该设门策略是否能可靠地排除死细胞，我们使用了7-氨基放线菌素D（7-AAD）进行染色（图1B）。由于细胞膜通透性的改变，7-AAD可进入死亡或濒死细胞并与DNA结合，而活细胞则能将其排除。对GM-CSF培养的骨髓细胞的存活率分析分别在收获后立即（PH）以及培养第1、3、5天进行。在收获后立即分析的细胞中，当对从骨髓新鲜分离的细胞应用典型的FSC/SSC设门时，约有10%的细胞呈7-AAD阳性（图1，收获后）。在培养第1天（约12%）和第3天（约11%）也观察到相似比例的死细胞（图1，第1天PH和第3天PH）。到第5天时，设门内死细胞的比例下降至约5%（

讨论

该方案可分离出足够数量的由GM-CSF驱动的祖细胞和前体细胞，适用于多种分析，包括生化检测和细胞功能检测 体外或灌注 体内该方法代表了单核细胞来源的树突状细胞发育领域的一项重大进展，能够可靠地分离和鉴定该发育途径早期阶段的细胞，以及既往研究中更常分离的已分化细胞类型。

既往从骨髓中分离祖细胞和前体细胞的方案 体外 依赖CFSE染色来鉴定增殖性前体细胞 ¹⁷ 或使用 CD31 和 Ly6C 染色标记髓系细胞 ¹⁸Naik 描述的 CFSE 染色方案旨在用于 Flt3L 诱导的树突状细胞前体和祖细胞的生成 ¹⁷当我们尝试在GM-CSF培养体系中采用该方法时，遇到了两个主要问题。CFSE对发育中的细胞具有一定的细胞毒性，且其荧光信号过强（即使在已分裂的细胞中），导致补偿设置困难。该方法被证明不适合我们的研究目标，即从增殖活跃的细胞（如CMPs/GMPs）到高度分化...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640	Corning	15-040-CV
胎牛血清（FCS）	HyClone	SV30014.04	用于补充完全培养基和FWB
GlutaMAX	Gibco	35050	用于补充完全培养基
2-巯基乙醇（2-ME）	MP Biomedical	190242	用于补充完全培养基
75 mM 真空滤器	Thermo Scientific	156-4045	用于完全培养基的灭菌
ACK裂解缓冲液	Lonza	10-548E	用于裂解红细胞
HBSS缓冲液	Corning	21-020-CM	用于红细胞裂解后回收白细胞
磷酸盐缓冲液（PBS），Dulbecco's配方	Lonza	17-512F	必须无内毒素；在4 °C预冷
35 µm细胞滤网	Falcon	352235	在上样流式细胞仪前用于分散细胞团块
GM-CSF	Biosource	PMC2011	使用浓度为10 ng/mL
组织培养处理板	VWR	10062-896	用于收获骨髓细胞后培养
抗-Ly6C，克隆HK1.4	Biolegend	128018
抗-CD115，克隆AFS98	Tonbo Bioscience	20-1152-U100
抗-CD11c，克隆HL3	BD Biosciences	557400	用于区分CMP和MoDCs
MoFlo XPD 流式细胞仪	Beckman Coulter	ML99030
BD Accuri C6	BD Biosciences	660517
100% 乙醇	Pharmco-Aaper	111000200CSPP
60 mm 培养皿	Corning, Inc	353002
50 mL 圆底离心管	VWR	21008-242
C57BL/6 小鼠	The Jackson Laboratory	000664	雌性；10–20周龄
生物安全柜	Thermo Scientific	8354-30-0011
10 mL 注射器	BD Biosciences	301604
23 G 针头	BD Biosciences	305145
Centrifuge 5810 R	eppendorf	22625501
FlowJo 软件 v10	BD Biosciences	Version 10	flowjo.com