利用新的细胞分选策略, 从小鼠骨髓中生成大量的髓样祖细胞和树突状体细胞前体

细胞因子-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 培养小鼠骨髓细胞的方法广泛应用于大数1的单核细胞衍生树突状细胞 (moDC; 也称为炎症 DC) ^{, 2,3,4,5}。这些细胞在树突状细胞 (DC) 功能^6,7,8的各种研究中非常有用。通常, 这些小鼠骨髓细胞培养6-8 天, 然后用于研究树突状细胞功能⁵。这些文化长期被认为主要是同源的, 包括多数被区分的 moDC。最近, 很明显, 在这个6–8的天文化时期结束时, 确实有许多 moDC, 以及分化的单核细胞衍生巨噬细胞 (moMacs) ^9,10,11的大子集。我们自己的研究进一步扩展了这些发现, 证明其他不发达细胞的子集, 如 moDC 前体 (moDP) 和单核, 在7天¹⁰的时间内仍然保持在低频率的文化中。因此, 利用这个系统产生的细胞来研究树突状细胞 (DC) 功能, 可以反映出比以前更广泛的细胞类型的反应。

我们从研究 GM-CSF 生成的 moDC 与这些细胞在分化的最后阶段^12,13,14的功能上学到了很多。然而, 我们对这些细胞^2、15、16的发展途径以及它们如何和何时表现出特定功能, 如: 对病原体相关分子的反应能力的了解明显较少。模式 (PAMPs), 吞噬功能, 抗原处理和表现¹³, 和抗菌活性。¹⁷报告了一项隔离大量常规 Flt3L-driven DC 祖和前体的议定书。利用羧基琥珀酰亚胺酯 (CFSE) 染色的骨髓细胞 (在 Flt3L 中跟踪分裂细胞) 和培养3天, 实现了这些不同种群的分离。细胞被耗尽的宗族阳性细胞, 并排序为祖和前体群体的基础上 CD11c 表达¹⁷。Leenen 组在 GM-脑脊液驱动培养中识别 DC 早期祖细胞的另一种方法是根据 CD31 和 Ly6C ¹⁸对单元进行分类。最初的目标是建立一个类似的方法来获得 GM-脑脊液驱动 moDC 的祖和前体。由于由 GM-CSF 产生的特定细胞类型, 我们根据在早期和后期的发展阶段所表达的分子表达方式, 调整了方法和排序策略。我们最终确定 Ly6C、CD115 (CSF-1 受体) 和 CD11c 是区分这些细胞类型¹⁰的最佳标记。

在这里, 我们提出了一个方法, 在几个不同的发展阶段的细胞分离的途径, 由 GM-脑脊液: 普通髓样祖 (CMP), 粒细胞巨噬祖 (GMP), 单核细胞源性巨噬细胞(MoMac) 和单核细胞衍生 DC (MoDC)。moMac 种群可以根据 MHC II 类表达的水平进一步隔离, 揭示了 moDC 前体种群 (moDP) ¹⁰。我们利用一种高速荧光活化细胞分选 (Ly6C) 策略来隔离这5种群, 并以表达 CD115 和 CD11c 为基础。然后, 我们展示了这些细胞在功能检测中的检查, 揭示了它们对玉兰刺激的反应。

所有动物工作都是由奥本大学机构动物保育和使用委员会根据《国家卫生研究院实验室动物护理和使用指南》中概述的建议批准的。

1. 骨髓收集的准备工作

1. 准备250毫升完整的媒体, 通过添加一个解决方案的罗斯威尔公园纪念研究所 (RPMI) 1640 培养基补充10% 胎小牛血清, 2 毫米谷氨酰胺, 50 µM 2 巯基乙醇到0.22 µM 真空过滤瓶单元顶部, 并应用真空。
   注: 完全培养基可储存在4摄氏度, 长达2月。
2. 在2毫升瓶中混合350毫升100% 乙醇与150毫升不育 H₅₀₀O, 制备70% 乙醇溶液。
3. 将离心机设置为4摄氏度。
4. 用70% 乙醇消毒镊子、手术刀和剪刀。
5. 使用血清学吸管, 添加5毫升完整的培养基到三60毫米培养皿。
6. 使用血清学吸管, 添加30毫升完整的介质到50毫升圆锥管。

2. 小鼠骨髓细胞的收集

1. 根据2013美国兽医协会 (AVMA) 《安乐死准则》制定的规则, 弄死一只 C57BL/6 老鼠, 共₂麻醉。
2. 取下并剥下后腿。
   1. 用75% 乙醇将后腿和躯干饱和, 用弯曲的组织剪刀在髋部周围的皮肤上进行浅切口。使用镊子, 牢牢地将皮肤从臀部向下拉向脚踝, 露出肌肉。使用剪刀去除皮瓣。
   2. 通过穿过股骨/髋关节上方的骨骼来切除整条后腿。
      注: 除消毒区域外, 乙醇还有助于提供清洁的切口, 防止毛发污染样品。
   3. 如果腿部将被转移到一个新的位置, 骨髓采集, 淹没的腿在完全的媒体。
3. 在无菌生物安全柜中工作, 将腿部转移到以前准备好的培养皿中。
4. 用剪刀剪下脚踝, 小心地取出尽可能多的肌肉和弹性结缔组织。把被清洗的骨头转移到第二个准备好的培养皿上。
   注: 虽然没有必要去除所有的肌肉, 过多的剩余组织可能会使它难以冲洗出骨髓。
5. 把股骨、膝盖和胫骨分开。
   1. 用镊子, 把腿放在膝盖上, 找到骨髓。
      注: 骨髓应可见, 在股骨顶部和胫骨末端的骨腔内有一条微弱的红线。
      1. 使用剪刀, 使三削减如下。
         1. 在骨髓似乎结束的地方切开胫骨。
         2. 就在膝关节下面切。
         3. 就在膝关节上方切开。
         4. 如果髋关节仍与股骨相连, 请在髋关节下方切开。
      2. 将三片段返回到培养皿, 并在另一条腿上重复此过程。
6. 从股骨和胫骨中冲洗骨髓。
   1. 填充一个10毫升注射器与完整的媒体从50毫升圆锥管, 并帽与23克针。
   2. 在第三个已准备好的培养皿上方用镊子将骨夹住, 将针头插入骨管中, 并将其推进, 冲洗出细胞 (可能出现为完整的 "插头" 或多个簇)。重复, 直到没有更多的颜色可以看到通过骨头。必要时用介质填充注射器。
7. 粉碎骨骺。
   1. 当仍在第二培养皿中, 用镊子牢牢地握住膝盖帽, 并用注射器的尖端将膝盖捣碎。继续, 直到骨骺不再是红色的。
8. 使用注射器, 将第二和第三培养皿中的细胞转移到50毫升管。通过轻轻吹打的向上和向下分裂成团簇。尽量不要产生气泡。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟。
9. 溶解红细胞
   1. 用血清吸管去除上清液, 通过弹球和溶解红细胞, 在室温下通过1毫升的 ACK (氯化铵-氯化钾) 裂解缓冲剂孵化出1分钟。
   2. 使用血清学吸管, 加入40毫升的 HBSS (汉克斯平衡盐溶液) 缓冲。
10. 使用血清学吸管, 过滤细胞, 虽然70µm 细胞过滤器进入一个新的50毫升锥管。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟。
11. 使用血清吸管, 去除上清和洗涤细胞与40毫升完整的培养基。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟。
    注意: 在这个阶段, 血统阳性淋巴细胞可以通过外地或磁柱纯化去除。然而, 淋巴细胞在培养中不长期保持。虽然在骨髓 Ly6C-CD115 中有大量的谱系阳性细胞存在, 但几乎所有5天都缺席 (图 2)。
12. 使用血清吸管, 去除上清, 并培养完整的培养基中的骨髓细胞与 10 ng/毫升的重组小鼠脑脊液在密度为 1 x 10⁶细胞/毫升。
    注: 一般情况下, 红细胞裂解后可收获 4 x 10⁷的总细胞。但是, 对于初学者和多达 5 x 10⁷个单元的经验丰富的收割机来说, 只需要 2 x 10⁷ 。
13. 使用血清学吸管, 将细胞转移到组织培养板上, 在 5% CO₂中孵育37摄氏度。如果使用24井板, 种子每井与2毫升细胞悬浮。
14. 每48小时, 使用一个血清学吸管删除一半的媒体和替代新鲜完整的媒体和转基因脑脊液。
    注: 文化可以保持9天。然而, 作文随着时间的推移而改变。有关详细信息, 请参阅第3节。

3. 选择日排序

1. 随着时间的推移, 细胞数量的变化, 选择一个产生最高数量的期望细胞的一天。
2. 请参见表 1 , 以预测每 1 x 10⁷个细胞在3、5和7天内培养的每一个种群的预期细胞产量。

4. 染色策略

1. 使用小整除数的细胞来准备控制样品。包括一个无瑕控制, 只有一个荧光抗体染色的补偿控制样本, 和荧光-减号-一个控制, 其中所有的抗体添加除了一个, 以控制在该通道的非特异荧光。如果使用间接标记, 则仅包括初级、次要和初级和次要。
   注: 藻红蛋白 (PE) 和复方阿司匹林 (APC) 标记的抗体提供了独特的分离与最小出血时一起使用。但是, 如果 fluorochrome 选项是有限的, CD115 是在相对较低的水平, 而 Ly6C 是在非常高的水平表达。因此, 更明亮的荧光是可取的 anti-CD115, 并选择 anti-Ly6C 荧光, 以防止出血。
2. 在50毫升锥形管中混合97毫升的冷冻 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 和3毫升的胎儿小牛血清, 并将其放置在冰浴中, 准备100毫升的 FWB 洗涤缓冲液。
3. 使用吸管轻轻, 但彻底, 吸管细胞向上和向下, 以去除任何松散黏附的细胞。
4. 使用血清吸管, 转移细胞到50毫升圆锥管。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟。
   1. 如果细胞体积超过50毫升, 转移细胞到必要数量的管, 并结合在染色步骤。
5. 轻轻地倒上清液, 用血清吸管加入30毫升的 FWB 来洗涤颗粒细胞。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟, 并且重复洗涤。
   注: 如果预期高细胞死亡, 细胞可以用 FWB 的低至0.5% 胎小牛血清 (FCS) 进行冲洗。这将防止细胞结块。
6. 根据抗体制造商的说明暂停和染色细胞。
   1. 悬浮 5 x 10⁷细胞在1毫升 FWB 并且增加2µg 每个 anti-Ly6C 和 anti-CD115 标记与显影 (研究员的选择)。为了进一步区分 CMP 与 moDC (两者都是 Ly6C 和 CD115), 添加2µg anti-CD11c 抗体 (CMP 是 CD11c^-; moDC 是 CD11c⁺)。在冰上孵化30分钟。
      注:图 3是使用 Ly6C-PE 和 CD115-APC 生成的。
7. 使用血清学吸管, 添加10毫升的 FWB, 离心机在 250 x克4 摄氏度, 10 分钟。
8. 轻轻地倒上清液, 用血清吸管加入30毫升的 FWB 来洗涤颗粒细胞。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟, 并且重复洗涤。
9. 在悬浮细胞之前, 要彻底地将球管取出。使用血清吸管悬浮细胞在 1 x 10⁷细胞/毫升 FWB, 并筛选通过35µm 细胞过滤器。使用血清学吸管将过滤过的细胞转移到聚丙烯管中, 放在冰上, 直到准备好排序。
   注: 如果聚丙烯不可用, 蛋白质涂层 (脱脂干牛奶或 FCS) 聚苯乙烯管可用于减少粘结。

5. 根据控制样本设置闸门

注意: 为了防止由于高速流流的压力而导致细胞中断, 请使用100–130µm 喷嘴进行细胞分类。

1. 运行无瑕控件 (参见步骤 4.1) 通过单元格分拣器, 并应用一个门排除小碎片 (低正向散射;FSC) 和高度粒状 (高边分散;SSC) 粒子。
   1. 要只分析最新的阶段 (单核细胞, moMac/MoDP 和 MoDC), 应用门控仅包括较大的细胞 (高 FSC)。
   2. 如果使用了生存能力污点, 请使用这些污渍排除染色的、不可生存的事件 (如图 1所示)。
2. 通过单元分拣器运行单个荧光控制样本, 并根据需要调整补偿。
3. 运行多标签示例的示例。观察四种不同的种群: Ly6C+CD115 (GMPs)、Ly6C+CD115+ (单核细胞)、Ly6C-CD115+ (moMacs/moDP) 和 Ly6C-CD115-(中医/moDCs)。应用一个门来隔离四个主要种群。
   注: 中医与 moDC 共 Ly6C-CD115 表型。但是, 它们可以根据 CD11c 表达式进行区分: CMP 缺乏 CD11c, 而 MoDCs 表达 CD11c。

6. 孤立人口的收集

1. 通过添加足够的 FCS, 以达到至少20% 最终浓度时, 充分的准备收集管。例如, 如果使用5毫升管, 在分拣前添加1毫升的 FCS, 并在达到5毫升总容积时取出管。
2. 为了防止膜的更替和抗体摄取, 保持所有样品 (混合和排序) 在4°c 在整个排序。
   1. 如果这是不可能的, 保留包含细胞的管子在冰尽可能被排序并且转移整除数到分拣机根据需要。
   2. 另外, 将排序的样品转移到冰每20–30分钟。
3. 在收集了所需的细胞数之后, 使用血清学吸管将细胞转移到新的锥形管上。离心机在 250 x g在4°c 为10分钟。
   1. 确认纯度与后排序分析的小整除数从每个收集的人口。
4. 除去上清, 在10毫升的 FWB 和离心机悬浮在 250 x g在4°c 为10分钟. 重复两次洗涤。
   注: 去除所有上清液可能很难, 不逐出颗粒。将吸管尖端连接到真空线可以帮助去除。如果没有这种情况, 建议将上清液在新鲜的试管中收集, 以防颗粒分离。
5. 第二次冲洗后取出上清液。
6. 如果用户的实验设计要求重新培养细胞, 请按照步骤2.12–2.14。否则, 如果单元格用于立即分析, 则根据所需的协议准备单元格。
   注: 典型功能分析示例包括在图 4中。

为了尽可能多地进行分析, 可以根据前向和侧向散射来常规地选择可行的细胞, 不包括非常小和非常粒状的事件 (在图 1A中的所有点地块上都应用一个典型的门)。为了确定这种门控策略是否可靠地排除了死细胞, 我们染色了7氨基放线菌 D (7) (图 1B)。7AAD. 由于细胞膜通透性, 在死亡和死亡细胞中染色 DNA, 并被存活细胞排除。分析了转基因-脑脊液培养骨髓细胞的生存能力, 立即进行了收获后 (ph 值) 和1、3和 5 ph 值细胞分析, 当一个典型的 FSC/SSC 门被应用到从骨骼中分离出来的新鲜细胞时, ph 值有大约 10% 7 反正细胞。骨髓 (图 1, 收获后)。同样比例的死亡细胞也出现在1天 (~ 12%) 和3天 (~ 11%) 的文化 (图 1, 1 天 ph 值和3天 ph 值)。到了5天, 门内死细胞的数量减少到了 5% (图 1, 5 天的 PH 值)。因此, 使用这样的生存能力门通常适合在5天和之后排序。因此, 如果用户的可用参数有限, FSC/SSC 门通常是适当的。然而, 对于更敏感的化验 (特别是如果他们依赖于精确的细胞数), 纳入一个生存能力染色 (建议)。

许多树突状细胞的传播协议建议在培养11、17之前从骨髓中耗尽血统阳性细胞, 特别是淋巴细胞。这一过程被认为是提高细胞纯度的恢复后, 由 GM-脑脊液介导的分化。通常, 用磁性珠子或细胞分选11,17,18来表示 T 细胞 (CD3)、B 细胞 (CD45R 或 CD19) 和 NK 细胞 (NK1.1) 的标记物可能耗尽。然而, 根据培养系统, 淋巴细胞很少恢复或检测到这些化验。因此, 我们试图评估在 Ly6C-CD115-脑脊液驱动细胞中维持的淋巴细胞的寿命 (图 2A)。GM-脑脊液培养的骨髓细胞 (没有血统耗尽) 被染色的抗体 CD3, CD45R 和 NK1.1 (在同一荧光) 和每日测量流式细胞术 (图 2B)。在 Ly6C-CD115 人群中, CD3/CD45R 阳性细胞持续0–3天 (图 2B)。在4天, 只有少数 CD3/CD45R 阳性细胞保持, 并在5天和 6, 没有 CD3/CD45R 表达细胞存在。因此, 在 GM-CSF 的4天的文化中, 血统阳性细胞基本上是缺席的, 并没有发现在所有的天5和6的文化。

随着细胞的发育和分化 (表 1 , 基因型脑脊液驱动细胞培养的组成在这个系统中每天变化;图 3)。在早期的时间点, 最丰富的细胞是祖和前体, 并在晚些时候大多数细胞被区分10。为了确定不同文化天的排序如何影响后续的发展路径或动力学, 排序执行3、5和7天的 PH 值 (图 3A)。MoMac 人口 (Ly6C-CD115+) 的发展然后被追踪了在2–3进一步天在文化 (图 3B-3D)。

当3天的 PH 值排序时, 只有40% 的 Ly6C-CD115+ 细胞在 24 h 后排序 (PS) 中减少 CD115 表达 (图 3B)。由 48 h PS, 下调节 CD115 的分数为 66%, 72 h, 70% 的细胞有这种表型。这个表型构成被维护了 (~ 70-72% Ly6C-CD115-) 甚而在进一步天以后文化 (数据没有显示)。当5天的 PH 值, 75% 的细胞被 Ly6C-CD115-, 在24小时内迅速下调 CD115, 80% 是 CD115-仅次于48小时。这个发行在 72 h 以后被维护了 (图 3C)。最后, 当7天的 PH 值排序时, CD115 的下调节也相当迅速。在24小时内, ~ 75% 的细胞有下调 CD115 表达, 这一趋势保持在 48 h (图 3D)。有趣的是, 在7天排序时, CD115 表达的整体水平在 CD115+ 人群中的细胞中较低。

因此, 这些发现表明, 在早期排序时, 发育的动力学速度有些慢, 如3天排序的细胞相比, 在5或7天排序后观察到的更快的发展和差异。根据这些结果, 寻求更大数量 moDC 的用户在5或7天可能会排序。

DC 的成熟响应建立在6、7、12、14之间。当处理与各种病原体相关的分子模式 (PAMPs), 未成熟的 DC 上调的表达 MHC, 刺激分子和促炎性细胞因子, 提高其 T 细胞活化能力6。然而, 当发育中的细胞获得对玉兰刺激反应的能力以及它们可能呈现的 DC 成熟的特征时, 就不那么清楚了。为了确定哪些排序的人口将响应成熟刺激, 每一个人口在排序后不久, PAMPs 的鸡尾酒, 包括聚 I: C, 脂多糖 (LPS), 和 CpG DNA, 以触发类似收费受体 (TLR) 3 (TLR3),TLR4 和 TLR9 分别。用流式细胞仪 (图 4A-4B) 对细胞进行24小时的治疗 (或未治疗), CD86 和 MHCII 的表达。此外, 上清液细胞因子阵列 ELISA 法测定了 IL-12p40/70 和 IL-6 的产量 (图 4C-4D)。

中医和 GMPs 在静态状态下表达了很低的 MHC II 类和 CD86 的水平, 这些表达模式在接触 PAMPs 的鸡尾酒时没有显著改变 (图 4A和4B)。同样, 由单核细胞的 MHC II 类的表达也很低, 在玉兰暴露后变化不大 (图 4A)。然而, CD86 在单核细胞中的表达在24小时后, 在24小时的刺激下进一步增加。观察 MoMacs 和 MoDCs 中 MHC II. 类和 CD86 的较高基底表达, 两个种群在玉兰刺激时均表现出强烈的诱导作用。从 MHC II. 类表达后的刺激, 没有统计学差异的中医, GMPs 和单核细胞, 而 MoMacs 和 MoDCs 形成了一个不同的组。然而, 在 CD86 表达方面, 中医和 GMPs 细胞在统计学上不同于 MoMacs 和 MoDCs。然而, 单核细胞与 MoMacs 或 MoDCs 不同。

我们接下来想评估五人口中每一个人的相对能力, 以产生细胞因子的反应 TLR 刺激。因此, 我们在 TLR 激动剂鸡尾酒的存在或缺乏的情况下, 对已排序的人群进行了细胞因子检测。细胞的培养与刺激24小时, 然后上清液收集。我们观察到很少 IL-12p40/70 或 IL-6 生产的中医在 TLR 刺激 (图 4C-4D)。第二个人口 GMPs 无法生产 IL-12p40/70 (图 4C), 但这些细胞在 PAMPs 刺激下产生了少量的 IL-6 (图 4D)。在后三个人群中观察到细胞因子的最高水平。单核细胞和 MoMacs 有非常相似的模式和大小的细胞因子的生产。两者都大大增加了 IL-12p40/70 和适度增加 IL-6 增产刺激 (图 4C-4D)。有趣的是, 在存在 PAMPs MoDCs 没有增加 IL-12p40/70 分泌;然而, 这一人口大大增加了 IL-6 产量 (图 4C-4D)。这些发现表明, 被排序的人群在隔离后维持其免疫功能。

图 1: 前方与侧散射门之间可行的细胞.在转基因脑脊液中培养小鼠骨髓, 利用 7-7-氨基-放线菌 D) 染色后采收后 (PH 值) 和1、3和5天的采收后测定其生存能力。(A) 通过应用门 (可行的) 来选择可行的细胞, 省略了基于 FSC 和 SSC 的小型和高粒度事件。(B) 在可行的 (FSC/SSC) 门内发生的事件产生的 7-反色直方图。阳性的 7-反的事件表明细胞正在凋亡。箭头表示可行的细胞门控。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: Ly6C-CD115 人群中的淋巴细胞.采用流式细胞仪对小鼠骨髓进行了 CD3 和淋巴细胞标记 (CD145R、NK1.1) 的培养。(A) 细胞被 Ly6C-PE 和 CD115-APC 染色, 以识别 Ly6C-CD115 细胞。基于单色控制的象限门应用。假彩色0天 (B) CD3、CD45R 和 NK1.1 Ly6C-CD115 细胞的表达, 在收获日 (0 天) 上分析, 直到6天。用流式细胞仪分析软件将细胞计数规范化为模式。箭头指示 Ly6C-CD115 门。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 不同日分选后 Ly6C-CD115+ 细胞的发育动力学.(A) 小鼠骨髓在转基因脑脊液中收获和培养。整除数 1 x 107细胞被收获 (B) 3, (C) 5, 或 (D) 收获后7天 (PH 值)。在指示的天 PH 值, Ly6C-CD115+ 细胞排序从混合的培养 (预先排序) 并且立刻分析后排序 (PS)。用流式细胞仪对细胞进行重组, 对 Ly6C/CD115 表达的变化进行了分析。框和箭头表示排序门。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: TLR 刺激后的成熟和细胞因子表达.在 GM-CSF 的3天, 细胞被分类为5个种群。然后他们用 PAMPs 的鸡尾酒治疗 (LPS, 聚 I: C, 和 CpG DNA) 为 24 h. (a) MHC II. 类和 (B) CD86 的平均荧光强度 (), 用流式细胞仪对 PAMPs 进行了后排序 (PS) 和 24 h 的分析。误差条表示3-5 复制实验的标准偏差。(C) IL-12p40/70 和 (D) 从3个共用样品中 IL-6, 用细胞因子阵列斑点印迹酶联免疫吸附法测定了24小时后的上清液和无 PAMPs。RLU相对光单位;++ 表示指定人口的细胞表面标记的存在。请单击此处查看此图的较大版本.

表 1: 每 1 x 107个单元格中恢复的最小和最大单元数.CMP (普通髓样祖);GMP (粒细胞/巨噬细胞祖) 单核细胞;MoMac (单核细胞衍生巨噬细胞);MoDC (单核细胞衍生树突状细胞);N/a (不可用);Min (最小细胞产率为 1 x 107细胞);最大 (最大细胞产量从 1 x 107细胞)。

作者没有冲突要公开。