方法文章

可电传导支架用于调控与递送干细胞

DOI：

10.3791/57367

⸱

2018年4月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Stanford Stroke Center and Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案描述了一种细胞培养系统的制备方法，旨在实现将干细胞接种于导电聚合物支架上 体外 电刺激及后续 体内 采用微创技术植入接种干细胞的支架。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

干细胞治疗已成为一种颇具前景的卒中治疗方法，但最佳递送方式仍不明确。尽管显微注射技术已使用数十年来在卒中模型中递送干细胞，但该技术受限于无法在注射前对干细胞进行有效调控。本文详细介绍了一种利用导电聚合物支架递送干细胞的方法。通过导电聚合物支架对干细胞施加电刺激，可改变干细胞中与细胞存活、炎症反应及突触重塑相关的基因表达。经过电预处理后，将支架上的干细胞移植至远端大脑中动脉闭塞大鼠模型的颅内。本方案描述了一种通过导电聚合物支架调控干细胞的有力技术，为推动基于干细胞的治疗策略提供了新工具。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是美国第五大死亡原因。尽管死亡率很高，目前脑卒中的康复治疗仍面临挑战，尚无有效的医疗手段可供使用1。目前约有300项针对缺血性脑卒中的临床试验，其中仅有40项采用干细胞治疗。既往研究表明，干细胞治疗对脑卒中修复具有有益作用2,3。移植的人类神经前体细胞（hNPCs）可释放旁分泌因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）和血栓反应蛋白-1（THBS-1），这些因子通过促进突触形成、血管生成、树突分支及新生轴突投射等机制改善功能恢复，同时还能调节免疫系统4,5,6。然而，干细胞的最佳递送方式仍不明确。

将干细胞成功递送至大脑仍是一项挑战。目前，可注射水凝胶和聚合物支架系统已被用于干细胞递送。这些递送方法不仅能在移植过程中保护干细胞，还能使其免受卒中后恶劣微环境的影响，包括宿主的炎症反应和缺氧条件7,8,9,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有干细胞和动物实验程序均经斯坦福大学干细胞研究监督委员会和斯坦福大学实验动物护理行政小组批准（SCRO-616 和 APLAC-31909）。

1. ITO 玻璃的蚀刻

  1. 通过在玻璃片的导电面覆盖一层遮蔽剂，来准备覆盖有氧化铟锡（ITO）的玻璃片。
    注意：大多数市售透明胶带均可作为遮蔽剂使用。
    1. 使用刀片去除多余的遮蔽层，仅保留玻璃片上最终ITO图形所需区域被覆盖。
  2. 在通风橱内的玻璃烧杯中，将5%（v/v）硝酸与45%（v/v）盐酸混合，配制蚀刻溶液。
    1. 使用加热板和温度计，确保蚀刻溶液的温度维持在70 °C。
  3. 当蚀刻溶液达到70 °C后，将带有遮蔽层的ITO玻璃片放入溶液中2分钟，以去除多余的ITO层。
    注意：胶带遮蔽可保护ITO层不与酸溶液接触。
  4. 将玻璃片从溶液中取出，并用去离子（DI）H2O冲洗。
  5. 小心去除遮蔽层，并使用万用表测量电阻，以确认剩余的ITO层完好无损。目标蚀刻区域的读数应约为0 Ω。

2. 吡咯溶液的制备

  1. 在1000 mL玻璃瓶中，将70 g十二烷基苯磺酸钠（NaDBS）溶解于600 mL去离子H2

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

图中所示示意图 图1 代表了人神经前体细胞电刺激的整体工作流程及潜在的下游应用。干细胞治疗目前存在的一项局限性在于，干细胞在移植后会暴露于严酷的微环境中，包括炎症和缺血条件。这些不利条件可能限制其治疗效果。14,15使用导电支架保护人神经前体细胞（hNPCs）免受该环境影响，可能通过电预处理增强hNPCs的治疗益处。该干细胞递送技术的第一步是采用电镀方法制备导电支架。2,16我们表征了支架的生物相容性，并利用人神经前体细胞（hNPCs）优化了电预处理参数。对照组定义为在组织培养板上培养且未接受刺激的干细胞。

评估了多种电压，以确定电刺激的安全性，并最大化预处理效.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

越来越多的证据表明，干细胞作为新型中风治疗手段具有广阔前景。这一前景促使人们大力推动干细胞治疗走向临床应用，目前至少有40项正在进行或已完成的临床试验。中风病理提供了一种独特的神经系统疾病模型，适合采用干细胞治疗，因为在急性损伤后，并不存在阻碍恢复的神经退行性过程。干细胞促进中风后恢复的具体机制仍不明确。已有研究表明，血管生成、突触生成以及突触重塑均发挥重要作用。当去除突触形成相关的重要分子（如BDNF和THBS-1）时，中风后的功能恢复会受到损害6,19。在多种动物模型中，人源神经前体细胞（hNPCs）已被证实可改善中风后的功能恢复20,21。然而，hNPCs的作用机制尚未完全阐明，其最佳递送方式也尚不清楚。通过建立一个能够调控hNPCs释放关键分子的系统，有助于区分出促进恢复的核心机制，并优化干细胞治疗策略。

将细胞成功递送至大脑仍是一项挑战。目.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明本研究无任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Kati Andreasson 博士（斯坦福大学神经病学与神经科学系）提供 qRT-PCR 仪器的使用。本工作得到美国国立卫生研究院基金 K08NS098876（资助对象：P.M.G.）和斯坦福医学院院长博士后奖学金（资助对象：B.O.）的支持。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic）InvitrogenCTP0261工作培养基中使用浓度为 20 ng/mL
MatrigelCorningcb40234a1:200 稀释
LIF 蛋白，重组人源（10 µg/mL）EMD MilliporeLIF1010工作培养基中使用浓度为 10 ng/mL
Sylgard 184 硅胶 3.9 kgFisherbrandNC0162601
盐酸FisherbrandSA56-4
硝酸浓缩液（认证级 ACS，Fisher Chemical）FisherbrandSA95
ITO 玻璃Delta TechnologiesCG-40IN-0115
十二烷基苯磺酸钠Sigma289957-1KG
吡咯Sigma131709-500ML避免吡咯溶液接触光和室温
8 孔玻璃载片培养室Thermo Sci Nuc 125658拆卸细胞培养室并保持无菌状态
平面支架，3"×1"McMaster-Carr 1030A4
双组分银漆 14GElectron Microscopy Sciences 1264214在塑料板上按 1:1 混合两组分
DPBS，1×，含钙镁，无酚红Genesse 25-508C
AB2 ArunA 神经细胞培养基试剂盒Aruna Biomedical ABNS7013.2
hNP1 人神经前体细胞扩增试剂盒Aruna Biomedical  hNP7013.1
非接触式流量调节阀，镍镀黄铜材质，适用于外径 3/32" 至 5/8" 的管路McMaster-Carr 5330K22
万用表Keysight E3641A
波形发生器Keysight33210A-10MHz
铂网Sigma-Aldrich 298107-425MG参比电极，尺寸为 1×1 cm
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）Thermo Fisher Scientific L3224
BDNFThermo Fisher Scientific Hs02718934_s1
THBS1Thermo Fisher Scientific Hs00962908_m1
GAPDHThermo Fisher Scientific Hs02758991_g1
RNeasy 小量试剂盒（250）Qiagen74106
QIAshredder（250）Qiagen79656
无 RNase DNase 试剂盒（50）QIAGEN79254
iScript cDNA 合成试剂盒，100 次 20 µL 反应BIORAD1708891
TaqMan 基因表达主混合液Thermo Fisher Scientific 4369510
7–8 周龄雄性 RNU 大鼠NCI-Frederick
4-0 Ethicon 丝线缝合线eSutures.com683G
异氟烷Henry Schein29405
V-1 台式实验动物麻醉系统VetEquip901806
Surgicel 原装可吸收止血剂Ethicon1952
标准实验室大鼠立体定位仪Stoelting51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin 紫色腈类无菌检查手套Fisherbrand19-063-130
无菌手术单MedlineDYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon 不锈钢手术刀片手柄，适配 No. 20–25 刀片Fisherbrand53-34
Walter Stern 300 系列手术刀片Fisherbrand17-654-456
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific4484642
Frazier 微型解剖钩Harvard Apparatus52-2706

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  2. George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

RT PCR BDNF

相关文章