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方法文章

可电传导支架用于调控与递送干细胞

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DOI：

10.3791/57367

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2018年4月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology and Neurological Sciences, Stanford University School of Medicine, 2Stanford Stroke Center and Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种细胞培养系统的制备方法，旨在实现将干细胞接种于导电聚合物支架上 体外 电刺激及后续 体内 采用微创技术植入接种干细胞的支架。

摘要

干细胞治疗已成为一种颇具前景的卒中治疗方法，但最佳递送方式仍不明确。尽管显微注射技术已使用数十年来在卒中模型中递送干细胞，但该技术受限于无法在注射前对干细胞进行有效调控。本文详细介绍了一种利用导电聚合物支架递送干细胞的方法。通过导电聚合物支架对干细胞施加电刺激，可改变干细胞中与细胞存活、炎症反应及突触重塑相关的基因表达。经过电预处理后，将支架上的干细胞移植至远端大脑中动脉闭塞大鼠模型的颅内。本方案描述了一种通过导电聚合物支架调控干细胞的有力技术，为推动基于干细胞的治疗策略提供了新工具。

引言

脑卒中是全球第二大死亡原因，也是美国第五大死亡原因。尽管死亡率很高，目前脑卒中的康复治疗仍面临挑战，尚无有效的医疗手段可供使用1。目前约有300项针对缺血性脑卒中的临床试验，其中仅有40项采用干细胞治疗。既往研究表明，干细胞治疗对脑卒中修复具有有益作用2,3。移植的人类神经前体细胞（hNPCs）可释放旁分泌因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）和血栓反应蛋白-1（THBS-1），这些因子通过促进突触形成、血管生成、树突分支及新生轴突投射等机制改善功能恢复，同时还能调节免疫系统4,5,6。然而，干细胞的最佳递送方式仍不明确。

将干细胞成功递送至大脑仍是一项挑战。目前，可注射水凝胶和聚合物支架系统已被用于干细胞递送。这些递送方法不仅能在移植过程中保护干细胞，还能使其免受卒中后恶劣微环境的影响，包括宿主的炎症反应和缺氧条件7,8,9,10然而，最常用的材料是惰性的，这限制了连续调控的使用（即，细胞的电刺激）11电刺激是一种影响干细胞分化、离子通道密度和神经突生长的信号因素12与惰性聚合物相比，导电聚合物能够传导电流，从而实现对干细胞的电刺激和操控2然而，电刺激调控神经营养因子释放的具体机制（即， BDNF 和 THBS-1 的作用机制仍尚未完全阐明。

在本实验方案中，我们描述了构建一种包含导电聚合物支架——聚吡咯（PPy）的细胞培养系统，该系统可实现体外电刺激。由于该细胞培养系统的制备方式，可将接种了干细胞的支架随后植入脑梗死周边皮层区域。在该系统中，我们在植入前对支架上的干细胞进行短暂的电预处理。经过电刺激后，携带细胞的导电聚合物支架可通过微创方法成功植入颅内。

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方案

所有干细胞和动物实验程序均经斯坦福大学干细胞研究监督委员会和斯坦福大学实验动物护理行政小组批准（SCRO-616 和 APLAC-31909）。

1. ITO 玻璃的蚀刻

  1. 通过在玻璃片的导电面覆盖一层遮蔽剂，来准备覆盖有氧化铟锡（ITO）的玻璃片。
    注意：大多数市售透明胶带均可作为遮蔽剂使用。
    1. 使用刀片去除多余的遮蔽层，仅保留玻璃片上最终ITO图形所需区域被覆盖。
  2. 在通风橱内的玻璃烧杯中，将5%（v/v）硝酸与45%（v/v）盐酸混合，配制蚀刻溶液。
    1. 使用加热板和温度计，确保蚀刻溶液的温度维持在70 °C。
  3. 当蚀刻溶液达到70 °C后，将带有遮蔽层的ITO玻璃片放入溶液中2分钟，以去除多余的ITO层。
    注意：胶带遮蔽可保护ITO层不与酸溶液接触。
  4. 将玻璃片从溶液中取出，并用去离子（DI）H2O冲洗。
  5. 小心去除遮蔽层，并使用万用表测量电阻，以确认剩余的ITO层完好无损。目标蚀刻区域的读数应约为0 Ω。

2. 吡咯溶液的制备

  1. 在1000 mL玻璃瓶中，将70 g十二烷基苯磺酸钠（NaDBS）溶解于600 mL去离子H2O中。
  2. 待NaDBS完全溶解后，向溶液中加入14 mL 0.2 M吡咯和386 mL去离子H2O。
  3. 用铝箔覆盖溶液，并于4 °C保存。

3. 在 ITO 玻璃上电镀聚吡咯

  1. 将吡咯溶液加热至室温，直至 NaDBS 完全重新溶解。
    注意：此过程约需 15 至 20 分钟。
  2. 将 25 mL 吡咯溶液倒入烧杯中。
  3. 将刻蚀的 ITO 玻璃连接至万用表，并将玻片浸入吡咯溶液中。
    1. 确保电阻为 0 Ω 的一侧朝向铂网参比电极。
  4. 使用万用表施加电流，在 ITO 表面启动 PPy 的电沉积（电流控制在 3 mA/cm2，持续 4 小时）。
  5. 将 ITO 玻璃从万用表上取下，并用去离子水（DI H2O）清洗电沉积的 PPy，以去除残留的表面活性剂。
  6. 使用剃刀刀片小心地将电沉积的 PPy 薄膜从 ITO 玻璃上剥离。
    1. 将 PPy 薄膜在室温下保存。

4. 聚二甲基硅氧烷（PDMS）的制备

  1. 使用刮刀和称量皿，将18 g基础剂与2 g固化剂混合，并将混合物倒入两个10 cm × 8 cm的玻璃模具中。
  2. 将模具放入真空干燥箱中，抽真空15–20分钟以去除气泡。
  3. 将模具置于70 °C烘箱中加热3小时。
  4. 冷却后，使用平头刮刀将PDMS从模具中取出。

5. 制备 体外 电刺激室

  1. 将金属板（宽×长，2.5 cm × 12.5 cm）和流量阀在120 °C下高压灭菌1小时。
  2. 使用腔室载玻片作为模板，裁剪两块PDMS。
    注意：其中一块PDMS用作细胞腔室的外围，其内部需切出两个相邻的方形孔洞；另一块PDMS则仅保留腔室外围的轮廓。
    1. 将内部细胞腔室裁剪为方形，使其形状与腔室载玻片的细胞腔室相匹配。确保两块PDMS的整体外形均为矩形，并与腔室载玻片的形状一致。
  3. 按从下到上的顺序依次叠加材料：（1）金属板， （2）无切口的PDMS， （3）PPy板（与PDMS垂直放置）， （4）带切口的PDMS，以及（5）细胞腔室。
  4. 装置完全对齐后，使用夹具将其固定。
  5. 剪取两段60 cm长的金属导线，使用银浆将每根导线连接至PPy板的两端，确保导线从腔室外侧伸出。导线长度应足以从装置延伸至培养箱外部。
  6. 待银浆固化后，使用环氧树脂加固并密封导线连接处。
    1. 使用万用表记录电阻，以确保每个腔室所施加的电场一致。
    2. 如需用于植入，应先移除导线，松开夹具，将细胞腔室和PDMS与导电支架分离。植入用支架的尺寸约为1 mm × 3 mm × 0.25 mm。

6. 在 PPy 上接种人神经前体细胞 (hNPCs)

  1. 将组装好的培养室在紫外线下灭菌 2 小时。
    1. 1 小时后，将组装好的培养室旋转 90°。
  2. 灭菌后，在 37 °C、5% CO2 的培养箱中，用 800 µL 涂层基质覆盖培养室底部的 PPy 表面，并使基质在 PPy 板上固化 1 小时。
  3. 1 小时后，从培养室中移除上清液，并用 1 mL 含 Ca 和 Mg 的 DPBS 轻轻冲洗每个孔。
    注意：避免用力冲洗 PPy 表面，否则会导致涂层基质脱落。
  4. 使用新鲜的细胞培养基，通过轻柔吹打，从组织培养板中机械解离培养的细胞以用于培养室。
    注意：解离时细胞应达到 90–100% 汇合度。
  5. 以 8000 × g 离心 5 分钟，收集 hNPC 细胞沉淀。
  6. 使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞重悬至 100,000 个细胞/cm2 的密度。
  7. 将 100,000 个细胞接种至每个培养室孔中（即每毫升培养基中含 100,000 个细胞/cm2）。
  8. 将培养室放回 37 °C、5% CO2 的培养箱中。

7. 人神经前体细胞的电刺激

  1. 细胞接种至培养室后一天，使用波形发生器对细胞施加电刺激。
  2. 刺激前，从每个培养室孔中移除旧培养基，并加入 800 µL 新鲜培养基进行更换。
  3. 更换培养基后，将培养室放回培养箱中，将导线引出培养箱，并连接至波形发生器。
  4. 采用方波信号对细胞进行刺激，参数设置为 ±400 mV、100 Hz，持续 1 小时。
  5. 刺激结束后，移除导线，将培养室继续置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育一天。
  6. 随后进行生物学分析，包括细胞活力检测和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR），操作步骤遵循试剂盒制造商的说明书。

8. 体内 PPy 植入

  1. 在T细胞缺陷型成年雄性裸鼠（NIH-RNU 230 ± 30 g）中进行远端大脑中动脉闭塞（dMCA）卒中模型操作，方法如前所述2在dMCA闭塞术后一周进行移植手术。
  2. 手术前一天，将氨苄青霉素（1 mg/mL）加入大鼠的笼内饮用水中给予。
  3. 在诱导室中通过吸入0.5 - 3% mg/kg的异氟烷对大鼠进行麻醉。
  4. 通过脚趾夹捏反射消失确认大鼠已麻醉。
    1. 在动物处于麻醉状态时，需每隔15分钟持续监测其黏膜颜色、呼吸模式及直肠温度。
  5. 确认麻醉成功后，将人工泪液滴入大鼠眼部以防止干燥。
  6. 在此操作过程中，应使用无菌手套和无菌手术单，以确保维持无菌技术13将无菌外科器械置于无菌区域内。
  7. 在大鼠处于麻醉状态下，于左侧皮层上方钻开颅骨窗。切开硬脑膜。
    1. 使用微细外科针去除脑部的硬脑膜。
  8. 植入导电支架 体外 系统置于大鼠皮层上。
    注意：在我们的实验中，我们植入了来自的支架 体外 hNPC 铺板后第 3 天
    1. 将植入物主要放置在梗死病灶内侧的半暗带皮层。
  9. 支架放置后，在植入物上覆盖Surgicel，以防止皮肤缝合时移位。
  10. 缝合伤口，并皮下注射缓释布托啡诺（buprenorphine SR），剂量为1 mg/kg，以缓解与立体定向手术和远端大脑中动脉闭塞相关的疼痛。
  11. 将大鼠置于恢复笼中，直至其恢复意识。
    1. 动物失去意识期间，切勿使其无人看管。
    2. 在动物完全恢复意识之前，不得将其与其他动物放在一起。
  12. 每天监测动物是否出现疼痛迹象，包括体重下降、食物/饮水摄入减少、理毛行为减少/毛发杂乱、自发活动减少或增加、异常姿势、脱水/皮肤 tenting（皮肤弹性下降）、眼窝凹陷、躲藏、自残行为、呼吸急促、张口呼吸、抽搐、颤抖、震颤以及发声。
    1. 每天监测动物，直至其表现出正常进食、饮水、理毛及体重增加；体重开始增加后，改为每周监测一次。
  13. 通过 CO 早期安乐死2 吸入以及安乐死的二次确认（以确保动物在二氧化碳暴露后不会因恢复正常供氧而复苏）2 吸入）将发生   任何在初始手术后出现不进食、不饮水、体重未增加；表现出疼痛症状；或由于运动皮层缺损超出预期而无法完成行为学测试的动物。 

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结果

图中所示示意图 图1 代表了人神经前体细胞电刺激的整体工作流程及潜在的下游应用。干细胞治疗目前存在的一项局限性在于，干细胞在移植后会暴露于严酷的微环境中，包括炎症和缺血条件。这些不利条件可能限制其治疗效果。14,15使用导电支架保护人神经前体细胞（hNPCs）免受该环境影响，可能通过电预处理增强hNPCs的治疗效果。该干细胞递送技术的第一步是采用电镀方法制备导电支架。2,16我们表征了支架的生物相容性，并利用人神经前体细胞优化了电预处理特性。对照组定义为在组织培养板上培养且未接受刺激的干细胞。

评估了多种电压，以确定电刺激的安全性，并最大化预处理效果。为确保每个...

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讨论

越来越多的证据表明，干细胞作为新型中风治疗手段具有广阔前景。这一前景促使人们大力推动干细胞治疗走向临床应用，目前至少有40项正在进行或已完成的临床试验。中风病理提供了一种独特的神经系统疾病模型，适合采用干细胞治疗，因为在急性损伤后，并不存在阻碍恢复的神经退行性过程。干细胞促进中风后恢复的具体机制仍不明确。已有研究表明，血管生成、突触生成以及突触重塑均发挥重要作用。当去除突触形成相关的重要分子（如BDNF和THBS-1）时，中风后的功能恢复会受到损害6,19。在多种动物模型中，人源神经前体细胞（hNPCs）已被证实可改善中风后的功能恢复20,21。然而，hNPCs的作用机制尚未完全阐明，其最佳递送方式也尚不清楚。通过建立一个能够调控hNPCs释放关键分子的系统，有助于区分出促进恢复的核心机制，并优化干细胞治疗策略。

将细胞成功递送至大脑仍是一项挑战。目...

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披露

作者声明本研究无任何利益冲突。

致谢

感谢 Kati Andreasson 博士（斯坦福大学神经病学与神经科学系）提供 qRT-PCR 仪器的使用。本工作得到美国国立卫生研究院基金 K08NS098876（资助对象：P.M.G.）和斯坦福医学院院长博士后奖学金（资助对象：B.O.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
碱性成纤维细胞生长因子（FGF-Basic）InvitrogenCTP0261工作培养基中使用浓度为 20 ng/mL
MatrigelCorningcb40234a1:200 稀释
LIF 蛋白，重组人源（10 µg/mL）EMD MilliporeLIF1010工作培养基中使用浓度为 10 ng/mL
Sylgard 184 硅胶 3.9 kgFisherbrandNC0162601
盐酸FisherbrandSA56-4
硝酸浓缩液（认证级 ACS，Fisher Chemical）FisherbrandSA95
ITO 玻璃Delta TechnologiesCG-40IN-0115
十二烷基苯磺酸钠Sigma289957-1KG
吡咯Sigma131709-500ML避免吡咯溶液接触光和室温
8 孔玻璃载片培养室Thermo Sci Nuc 125658拆卸细胞培养室并保持无菌状态
平面支架，3"×1"McMaster-Carr 1030A4
双组分银漆 14GElectron Microscopy Sciences 1264214在塑料板上按 1:1 混合两组分
DPBS，1×，含钙镁，无酚红Genesse 25-508C
AB2 ArunA 神经细胞培养基试剂盒Aruna Biomedical ABNS7013.2
hNP1 人神经前体细胞扩增试剂盒Aruna Biomedical  hNP7013.1
非接触式流量调节阀，镍镀黄铜材质，适用于外径 3/32" 至 5/8" 的管路McMaster-Carr 5330K22
万用表Keysight E3641A
波形发生器Keysight33210A-10MHz
铂网Sigma-Aldrich 298107-425MG参比电极，尺寸为 1×1 cm
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（适用于哺乳动物细胞）Thermo Fisher Scientific L3224
BDNFThermo Fisher Scientific Hs02718934_s1
THBS1Thermo Fisher Scientific Hs00962908_m1
GAPDHThermo Fisher Scientific Hs02758991_g1
RNeasy 小量试剂盒（250）Qiagen74106
QIAshredder（250）Qiagen79656
无 RNase DNase 试剂盒（50）QIAGEN79254
iScript cDNA 合成试剂盒，100 次 20 µL 反应BIORAD1708891
TaqMan 基因表达主混合液Thermo Fisher Scientific 4369510
7–8 周龄雄性 RNU 大鼠NCI-Frederick
4-0 Ethicon 丝线缝合线eSutures.com683G
异氟烷Henry Schein29405
V-1 台式实验动物麻醉系统VetEquip901806
Surgicel 原装可吸收止血剂Ethicon1952
标准实验室大鼠立体定位仪Stoelting51600
Kimberly-Clark Professional Safeskin 紫色腈类无菌检查手套Fisherbrand19-063-130
无菌手术单MedlineDYNJSD1092
Thermo Scientific Shandon 不锈钢手术刀片手柄，适配 No. 20–25 刀片Fisherbrand53-34
Walter Stern 300 系列手术刀片Fisherbrand17-654-456
QuantStudio 6 Flex 实时荧光定量 PCR 系统Thermo Fisher Scientific4484642
Frazier 微型解剖钩Harvard Apparatus52-2706

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