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方法文章

从成人及胎儿心脏标本中分离与培养原代心外膜细胞

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DOI：

10.3791/57370

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2018年4月24日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology, Leiden University Medical Center

本文内容

摘要

心外膜通过向心肌壁提供细胞和生长因子，在心脏的发育和修复过程中发挥着关键作用。本文介绍了一种培养人原代心外膜细胞的方法，可用于研究和比较这些细胞在发育期与成体期的特征。

摘要

心外膜是覆盖心肌的一层上皮细胞，在心脏发育过程中以及缺血性损伤后心脏的修复反应中均发挥关键作用。当被激活时，心外膜细胞会经历一种称为上皮-间质转化（EMT）的过程，为再生的心肌提供细胞。此外，心外膜还通过分泌重要的旁分泌因子发挥作用。为了充分认识心外膜的再生潜能，需要建立一种人类细胞模型。本文介绍了一种新型的细胞培养模型，用于从成人及胎儿的人类心脏组织中分离原代心外膜来源细胞（EPDCs）。为分离EPDCs，需从心脏标本外表面解剖获取心外膜，并将其处理成单细胞悬液。随后将EPDCs接种并在含有ALK 5-激酶抑制剂SB431542的EPDC培养基中进行培养，以维持其上皮表型。通过TGFβ刺激可诱导EMT。该方法首次实现了在可控条件下研究人类心外膜EMT过程，有助于深入理解可能促进心脏再生的EPDCs分泌组。此外，这种统一的方法使得成人与胎儿人类心外膜行为之间的直接比较成为可能。

引言

心外膜是一层包裹心脏的单细胞上皮层，在心脏发育与修复过程中具有至关重要的作用（详见 Smits et al.1 的综述）。在发育过程中，心外膜起源于位于发育中心脏基底部的一个微小结构——生心外膜器官。在小鼠胚胎发育约第 E9.5 天，以及人类受孕后约 4 周时，细胞开始从这一花椰菜状结构迁移，并覆盖正在发育的心肌层2。当单层上皮细胞结构形成后，部分心外膜细胞会经历 上皮-间质转化（EMT）。在 EMT 过程中，细胞失去其上皮特性（如细胞间黏附），并获得间质表型，从而具备迁入发育中心肌层的能力。所形成的心外膜来源细胞（EPDCs）可分化为多种心脏细胞类型，包括成纤维细胞、平滑肌细胞，以及潜在的心肌细胞和内皮细胞3，尽管后两类细胞群体的分化能力仍存在争议（详见 Smits et al.4 的综述）。此外，心外膜向心肌层提供具有指导作用的旁分泌信号，以调控其生长和血管化过程5,6,7,8。多项研究表明，心外膜形成受损会导致心肌9,10、血管系统11以及传导系统12的发育缺陷，进一步凸显了心外膜在心脏形成过程中的关键作用。

尽管在成年心脏中，心外膜表现为一层静息状态的结构，但在缺血情况下会被重新激活13损伤后心外膜的再激活重现了心脏发育过程中的多个现象，包括细胞增殖和上皮-间质转化（EMT）14，尽管效率较低。有趣的是，尽管其确切机制尚未完全阐明，但通过使用某些处理可改善心外膜对修复的贡献， 例如，胸腺素 β415 或修饰的 VEGF-A mRNA16，从而改善心肌梗死后的心脏功能。因此，心外膜被认为是一种有前景的细胞来源，可用于增强受损心脏的内源性修复。

心脏发育的机制在损伤过程中常常会以效率较低的方式重现。为了寻找心外膜激活因子，关键在于我们能够确定并比较胎儿和成人心外膜的全部潜能。此外，从治疗学的角度来看，除了动物实验外，扩展关于人心外膜反应的知识也十分重要。本文介绍了一种分离和培养具有上皮样细胞形态的人成年及胎儿心外膜来源细胞（EPDCs）并诱导其发生上皮-间质转化（EMT）的方法。通过该模型，我们旨在探索并比较成年与胎儿心外膜细胞的行为特征。

本方案的主要优势在于使用了尚未被充分研究的人类心外膜组织。重要的是，所描述的分离与细胞培养方案提供了一种统一的方法，可同时获得胎儿和成体的鹅卵石样EPDCs，从而能够直接比较这两种细胞来源。此外，由于心外膜是根据其解剖位置进行分离的，因此可确保所获细胞确实来源于心外膜17。

尽管此前已建立过人EPDC的分离方法，但这些方法主要依赖于组织块贴壁法，即将心脏或心外膜组织碎片接种于细胞培养皿中18,19该方法因而能够特异性筛选出为迁移而部分丧失上皮表型且更易发生自发性上皮-间质转化的细胞。在本方案中，首先将心外膜处理为单细胞悬液，从而使分离的心外膜源性细胞保持其上皮状态。因此，该方法提供了一种可靠的 体外 研究心外膜上皮-间质转化的模型。

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方案

涉及人体组织样本的所有实验均经莱顿大学医学中心伦理委员会批准，并符合《赫尔辛基宣言》的规定。所有步骤均在细胞培养超净台内使用无菌设备进行。

1. 准备工作

  1. 通过将 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM 低糖）与 Medium 199（M199）按 1:1 比例混合，配制 EPDC 培养基。加入 10% 经热灭活的胎牛血清（FBS，于 56 °C 加热灭活 25 分钟），并补充 100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素。将 EPDC 培养基在 37 °C 水浴中预热。
  2. 将 0.25% 胰蛋白酶/EDTA（1:1）在 37 °C 水浴中预热。
  3. 用明胶包被培养孔。向每个孔中加入 0.1% 明胶/PBS，于 37 °C 孵育至少 15 分钟。表 1 总结了所需细胞培养板的指导原则。接种细胞前，小心吸除所有液体。
  4. 用 DMSO 配制 10 mM SB431542（SB）储存液（注意：DMSO 具有潜在危险性）。将 50 µL 分装至锥底聚丙烯离心管（如 Eppendorf 管）中，于 -20 °C 保存。请注意，SB 分装液仅可解冻一次。

2. 成人与胎儿心脏标本的获取与保存

  1. 手术中切除的人类成人耳廓应立即放入含有15 mL高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素）的50 mL离心管中，于4 °C保存。样本通常大小为3 - 5 cm，解剖后最多可保存48小时。
  2. 从选择性流产组织中获取的胎儿心脏应在EPDC培养基中于4 °C保存，分离后最多保存24小时。本实验方案建议使用孕龄为12 - 22周的样本。请注意，整个心脏可用于心外膜的分离。

3. 心外膜层的分离

  1. 在超净工作台中，用 PBS 准备一个 100 毫米的细胞培养皿，并在皿盖内单独放置一滴 PBS（约 200 µL）。向一个 15 毫升离心管中加入 5 毫升预热的 EPDC 培养基。
  2. 将组织放入盛有 PBS 的细胞培养皿中。操作过程中应频繁润湿组织，确保其保持湿润。
  3. 在体视显微镜下，使用镊子尽可能剥离并去除组织样本上的心外膜层。
    注意：心外膜可识别为紧贴心脏外表面的一层极薄且透明的结构（图 1A）。应尽量避免混入心外膜脂肪组织和血管，因为这些污染物会干扰细胞的分离。
  4. 将剥离下来的心外膜组织碎片收集至皿盖中的 PBS 液滴内。
  5. 使用手术刀（图 1B）或将小镊子的尖端作为切割工具，将心外膜组织切成小块（0.5 mm3）。注意组织块应能通过 P1,000 移液器吸头（见步骤 3.6）。
  6. 向心外膜组织中加入 1 毫升胰蛋白酶，用 P1,000 移液器吸头吸取组织碎片和胰蛋白酶，转移至一个 1.5 毫升锥形离心管中（图 1C）。
  7. 将离心管置于 37 °C 水浴中孵育 10 分钟，同时以约 60 rpm 的速度轻轻振荡。
  8. 从水浴中取出离心管，用 70% 乙醇擦拭管外壁进行消毒。
  9. 静置使组织沉降至管底（图 1D），然后小心地将含有心外膜细胞的上清液转移至含有 5 毫升 EPDC 培养基的 15 毫升离心管中，以中和胰蛋白酶活性。
  10. 向锥形离心管中残留的组织补充 1 毫升胰蛋白酶，并用移液器轻轻吹打混匀。
  11. 重复步骤 3.7 至 3.10 两次。最后一次操作时，在总共 30 分钟的胰蛋白酶孵育后，将上清液和残留的心外膜组织一并转移至含 EPDC 培养基的离心管中。
  12. 当所有细胞均收集至 EPDC 培养基后，用 10 毫升注射器连接 19 号针头，将细胞悬液缓慢推入新的 15 毫升离心管中，以机械方式进一步解离细胞（图 1E）。
    注意：在将悬液通过针头前，务必先用移液器反复吹打混匀，确保悬液均质，防止针头堵塞。
  13. 为更充分地解离细胞，重复步骤 3.12，改用 21 号针头操作。
  14. 将 100 µm 细胞滤网置于 50 毫升离心管上，用 10 毫升移液器将含心外膜细胞的培养基转移至滤网上，以去除所有残留的细胞团块（图 1F）。
  15. 用移液器将 5 毫升 EPDC 培养基加至滤网上，冲洗滤网以收集残留细胞。
  16. 将 50 毫升离心管中的细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。由于细胞易沉降至管底，移液前应轻轻振荡混匀。
    注意：此步骤并非必需，但使用较小体积的离心管有助于离心后更清晰地观察细胞沉淀。
  17. 在室温下以 200 × g 离心 5 分钟（图 1G）。
  18. 弃去上清液，并将细胞沉淀（图 1H）重悬于所需体积的 EPDC 培养基中（表 1）。
    注意：对于胎儿来源的 EPDCs，应直接使用含有 10 µM ALK5 激酶抑制剂 的 EPDC 培养基（EPDC+SB）。成年动物来源的细胞在第一代培养时可不添加 SB。
  19. 将细胞悬液接种至明胶包被的培养板中（图 1I）。培养孔的规格取决于心外膜组织样本的大小（表 1）。注意：过低的细胞密度会诱导上皮-间质转化（EMT）的发生。
  20. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育至少 48 小时，以使细胞充分贴附于培养板表面。

4. EPDCs 的培养

  1. 每隔至少3天更换一次EPDC+SB培养基。
  2. 每隔至少3天使用显微镜观察细胞。当细胞达到汇合状态时， 即当培养板中的细胞完全覆盖时，按1:2的表面积比例传代细胞。注意，达到完全汇合可能需要约5 - 10天。
    1. 使用移液管或抽吸系统吸取培养基， 例如，玻璃移液管。
    2. 小心地向细胞中加入 PBS 进行洗涤。轻轻晃动培养板，然后吸去 PBS。
    3. 向培养板中加入胰蛋白酶。轻轻旋转培养板，使胰蛋白酶覆盖所有细胞，于37 °C孵育1分钟。
      注意：使用尽可能少的胰蛋白酶（参考用量：每200 µL） 6孔板中的孔
    4. 轻敲培养板，使细胞从板底机械脱落。使用显微镜观察细胞是否已脱落。若未脱落，则将细胞培养板再孵育一分钟。
    5. 加入适量体积的EPDC+SB培养基至细胞中，用移液器吹打混匀，将细胞悬液转移至新的明胶包被的培养板中。
      注意：通常情况下，细胞可保持铺路石样形态至第8代。

5. EPDCs 中 EMT 的诱导

  1. 为诱导EMT，用胰蛋白酶消化细胞，并将细胞以1:2的表面积比例转移至新的明胶包被孔板中，使用EPDC+SB培养基，具体操作如步骤4所述，在37 °C、5% CO2条件下培养至少24小时。
  2. 检查细胞融合度是否达到50 - 70%，以及EPDC是否呈现铺路石样形态。
    注意：细胞融合度会影响EPDC发生EMT的能力。
  3. 吸除细胞培养基，并用PBS小心洗涤细胞（参见步骤4.2.1 - 4.2.2）。
  4. 在EPDC培养基中加入1 ng/mL TGFβ3刺激细胞，并将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养5天。注意，在刺激期间，含TGFβ3的EPDC培养基无需更换。
  5. 每日观察细胞状态。5天后，发生EMT的细胞可通过其纺锤形形态进行识别（图2A）。
  6. 按照步骤4所述方法培养纺锤形EPDC，EPDC培养基中不再添加SB或TGFβ。一般情况下，纺锤形EPDC可传代培养至第20代。
  7. 通过免疫荧光染色检测间充质标志物αSMA或波形蛋白（Vimentin），或使用鬼笔环肽（phalloidin）染色检测F-actin应力纤维的形成，以验证EMT的发生（图2B）；也可通过qRT-PCR检测EMT相关基因（例如，WT1、Periostin、Col1A1、αSMA、N-Cadherin、MMP3、Snail、Slug）的表达进行验证（图2C和表2）。

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结果

本文概述了一种从成人及胎儿人类心脏组织中分离心外膜来源细胞（EPDCs）的简便方案（图1）。该方案利用了心外膜位于心脏外表面且易于接触的解剖位置（图1A）。解剖后对心脏耳状突进行染色显示，WT1+ 的心外膜已被去除，而其下方的心外膜下细胞外基质和心肌组织保持完整（图1J）。此前已进行了 extensive 表征，结果表明 EPDCs 表达心外膜标志物， 例如，ALDH1A2、TBX18、KRT8、KRT19，且不表达其他心脏常驻细胞类型的标志物， 例如PECAM1、ISL1、CD34 和 TNNT2。17

在存在 ALK5 激酶抑制剂 SB431542 的条件下培养时，成体（

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讨论

本文介绍了一种从成人及胎儿人类心脏中分离和培养原代心外膜细胞的详细方案。这些细胞的广泛表征此前已有发表17我们已证明，当使用ALK5激酶抑制剂SB431542进行培养时，这两种细胞类型均可维持为上皮样铺路石状细胞。上皮-间质转化是心外膜激活过程中的一个基本组成部分。 体内 在发育过程和损伤后反应中均存在上皮-间质转化（EMT）。通过添加TGFβ，可利用该方法研究EMT。重要的是，我们先前观察到，当去除SB时，胎儿EPDCs会迅速自发地发生EMT，而成人EPDCs仅在受到刺激时才发生EMT17研究胎儿EPDCs中的这些过程可能有助于理解如何在损伤后最佳地激活成年心外膜。

本方法依赖于手术过程中获取的患者组织样本。因此，所分离组织样本的状态可能存在多种变异，这些变异可能源于个体患者之间的差异，或与手术室内组织采集速度有关。此类变异可能导致以下操作步骤中的差异：1）心外膜从心肌层分离的难易程度；2）分离细胞在培养板上的贴壁情况；3）细胞抑制或发生上皮-间质转化（EMT）的能力...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由荷兰科学研究组织（NWO）（VENI 016.146.079）和莱顿大学医学中心研究奖学金共同资助（AMS），以及莱顿大学医学中心Bontius基金会（MJG）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基 + GlutaMAXGibco21885-025
Medium 199 Gibco31150-022
胎牛血清 Gibco10270-106
0.25% 胰蛋白酶Invitrogen25200-056
青霉素G钠盐RothHP48
硫酸链霉素RothHP66
牛胰蛋白酶 1:250Serva37289
EDTASigmaE4884
猪皮明胶Sigma-AldrichG1890
6 孔培养板Greiner bio-one657160
12 孔培养板康宁3512
24孔培养板Greiner bio-one662160
SB 431542Tocris1614
二甲基亚砜（DMSO）默克102931
100-1000µL型滤芯吸头Corning4809
10 ml 移液管Greiner Bio-One607180
5 ml 吸管Greiner bio-one606180
细胞培养皿 100/20 mmGreiner bio-one664160
PBSGibco10010056或自制并灭菌的
1.5 mL 离心管Eppendorf0030120086
15 毫升离心管Greiner bio-one188271
50 ml 离心管Greiner bio-one227261
10 mL 注射器Becton Dickinson305959
19号针头Becton Dickinson301700
21 号针头Becton Dickinson304432
EASYstrainer 细胞筛，100 µmGreiner bio-one542000
TGFβ3 R&D系统243-B3
单克隆抗肌动蛋白抗体， α-平滑肌SigmaA2547 
抗小鼠 Alexa Fluor 555InvitrogenA31570
Alexa Fluor 488 PhalloidinInvitrogenA12379
<强>仪器设备
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
使用 P1,000 移液器GilsonF123602
移液器控制器Integra155 015
体视显微镜LeicaM80
倒置光学显微镜OlympusCK2
离心Eppendorf5702
水浴锅GFL1083

参考文献

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