一种基于流式细胞术的简易检测方法 体外 利用寨卡病毒恢复期血清增强登革病毒的抗体依赖性感染

摘要

我们介绍一种简单易行的实验方案，利用登革病毒报告病毒颗粒，通过寨卡病毒感染恢复期血清来检测抗体依赖性增强感染效应。

摘要

抗体依赖性感染增强作用已被证实在中国台湾登革病毒感染致病过程中发挥重要作用。传统检测方法通过检测抗体或血清在非许可性细胞系中增强感染的能力，依赖于培养基中病毒释放量的测定，随后采用蚀斑实验对感染进行定量。近年来，这些检测方法已转为使用荧光标记抗体来检测登革病毒（DENV）在细胞系中的感染情况。然而，上述两种方法均存在局限性，限制了这些技术的广泛应用。本文中，我们描述了一种简便的 体外 使用表达绿色荧光蛋白的登革病毒报告病毒颗粒（RVPs）和K562细胞检测抗体依赖性增强（ADE）的实验方法，血清来源于感染寨卡病毒（ZIKV）16周后的恒河猴。该方法可靠，细胞操作步骤少，无需使用具有复制能力的活病毒，可采用高通量形式进行，并通过流式细胞术获得定量结果。此外，当相应RVPs可用时，该方法可轻松扩展用于检测其他黄病毒属感染（如黄热病毒（YFV）、日本马脑炎病毒（JEEV）、西尼罗病毒（WNV）等）的抗体依赖性增强（ADE）效应。由于实验操作简便、数据分析与结果解读容易，该方法适用于大多数实验室条件。

引言

抗体依赖性增强（antibody dependent enhancement, ADE）感染是一种由某一病毒血清型诱导产生的部分交叉反应性抗体应答，促进另一种血清型病毒进入细胞的过程，导致病毒复制增加和病毒血症加重。登革病毒（Dengue virus, DENV）感染中已广泛记录了ADE现象，其中存在四种主要的血清型。在部分患者中，ADE与登革出血热（Dengue hemorrhagic fever, DHF）的发生相关。我们近期研究发现，寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）感染可诱导产生显著高水平的DENV交叉反应性抗体应答，从而引发DENV的ADE现象。 体外 并可能促进了登革病毒血症的增强 体内^1,2抗体依赖性增强作用检测是评估抗体增强相关病毒二次感染能力的重要工具，可为黄病毒科病毒感染的致病机制提供有价值的见解，并为疫苗研发提供参考。

本实验所描述的方法利用登革病毒（DENV）报告病毒颗粒（RVPs）以及通常无法被感染的K562细胞。RVPs是结构完整但不具备复制能力的登革病毒颗粒，其携带一个亚基因组的绿色荧光蛋白（GFP）复制子，在经历一轮复制后表达GFP³。因此，被RVPs感染的细胞会发出绿色荧光，可通过流式细胞术或显微镜轻松检测。本实验中使用的RVPs来自商业来源，但也可针对其他病毒制备，并应用于本文所述的实验方案中。与此同时，K562细胞是一种表达FcγIII受体的白血病细胞系，能够结合抗体的Fc区域，并在亚中和浓度抗体存在的情况下被感染^4,5。

ADE 实验已被广泛用于研究重症登革热的危险因素，并阐明其作用机制 体外 ADE^6,7,8此处描述的 ADE 检测方法可快速、简便地用于测定血清增强病毒感染的能力 体外 使用RVPs和流式细胞术进行感染检测，相较于目前常用的其他检测方法（如在Vero细胞中测定空斑形成单位（pfu）或对感染细胞进行抗体染色）具有优势^{6,7,8,9,10,11}，这两种方法均耗时且劳动强度大。

方案

本方案所用血清样本来自恒河猴，这些动物的饲养和护理均遵循当地、州级和联邦政策，并在国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证的设施中进行。所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会审查并批准，样本通过组织共享方案获得。

1. 第1天

注意：所有下述步骤均须在生物安全二级（BSL-2）实验室中用于组织培养的无菌层流生物安全柜内进行。

1. 将血清样本在室温下解冻，并将每份血清样本各100 µL转移至无菌管中。在56°C水浴或可调温的恒温混匀仪中加热灭活30分钟。使用冷的RPMI-10培养基（含10%胎牛血清的RPMI）对血清样本进行10倍系列稀释，稀释范围从1:1至1:1,000。
2. 将系列稀释后的血清样本各10 µL加入到无菌96孔V型底板的每个孔中。设置两组对照孔：一组为仅含RPMI-10和RVPs但不含血清样本的孔，另一组为仅含RPMI-10、不含RVPs和血清样本的孔。每份血清样本及RPMI-10对照组均设三个复孔。
3. 从-80°C冰箱中取出登革病毒1、2、3和4型RVPs，在37°C水浴中解冻，并立即将解冻后的RVPs置于冰上。每份血清样本需准备约170 µL RVPs（每个血清稀释度（1:1、1:10、1:100、1:1,000）对应3个孔，每孔10 µL RVPs；仅含RPMI-10和RVPs的对照组每个也需3个孔，每孔10 µL RVPs）。
4. 用移液器将10 µL RVPs加入含有血清样本的96孔V型底板各孔以及仅含RPMI-10和RVPs（无血清）的对照孔中。不要向仅含RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的孔中加入RVPs。通过上下吹打5–10次充分混匀。在仅含冷RPMI-10（无血清样本且无RVPs）的对照孔中，每孔加入10 µL冷RPMI-10以代替RVPs。
5. 将96孔V型底板转移至培养箱中，在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时。在96孔V型底板孵育期间，使用70%乙醇清洁生物安全柜表面，并开启紫外灯照射15分钟。
6. 从培养箱中取出一个完全融合的T75培养瓶K562细胞，用无菌5 mL移液管充分混匀细胞，将5 mL细胞悬液转移至无菌15 mL锥形管中。
   注：K562细胞维持在RPMI-10培养基中，传代密度为1 × 10⁶/mL。
7. 从无菌15 mL锥形管中取出10 µL细胞悬液，与10 µL台盼蓝混合，使用血细胞计数板计数，以确定15 mL锥形管中的总细胞数。
8. 将含细胞的15 mL锥形管在约1,200 × g条件下离心10分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于预热的RPMI-10培养基中，调整浓度为80,000个细胞/30 µL培养基（即2.66 × 10⁶ 个细胞/mL）。
9. 从培养箱中取出96孔V型底板（步骤1.6），向每孔加入30 µL K562细胞，通过上下吹打5–10次充分混匀。将96孔V型底板放回培养箱，在37°C、5% CO₂条件下继续孵育1小时。
10. 孵育1小时后，从培养箱中取出96孔V型底板，在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中，弃去各孔中的培养基。
11. 通过向每孔加入125 µL预热的RPMI-10培养基重悬细胞，用移液器充分混匀，然后在约1,200 × g条件下离心5分钟。离心后，将板倒置放入含10%次氯酸钠溶液的容器中弃去培养基。重复此洗涤步骤两次。
12. 洗涤完成后，向每孔加入100 µL预热的RPMI-10培养基，用移液器上下吹打混匀，然后在37°C、5% CO₂条件下孵育48小时。

2. 第3天

1. 从培养箱中取出含有100 µL细胞及培养基/孔的96孔V型底板，转移至生物安全柜中。使用多通道移液器混匀各孔内容物，并将细胞和培养基转移至96孔U型底板或预先标记的5 mL聚丙烯管中。
2. 用100 µL含1%多聚甲醛（PFA）的1×磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗96孔V型底板的每个孔，并将冲洗液转移至步骤2.1中的96孔U型底板对应孔或标记的5 mL聚丙烯管中，使每孔或每管中PFA的终浓度为0.5%。使用多通道移液器充分混匀，用铝箔纸覆盖板面，于培养箱中静置30分钟以固定细胞。
3. 运行未染色的K562细胞，校准流式细胞仪（示例参见材料表）的侧向散射光和前向散射光以及荧光参数设置。仅需使用FL1荧光通道，因为细胞中唯一表达的荧光为GFP。从每个样本中采集约30,000–50,000个细胞。
   注意：由于感染RVP的细胞仅因表达GFP而发出绿色荧光，无需其他荧光通道，因此任何具备单荧光检测能力的流式细胞仪均可用于数据采集。

3. 数据分析

1. 使用任何流式细胞术分析软件（参见材料表）分析流式细胞仪上获得的数据。
   1. 根据FSC-A（前向散射-面积）对FSC-H（前向散射-高度）设置第一个门，以包含单个细胞并从分析中排除自发荧光的双联体¹²。然后，基于SSC-A（侧向散射-面积）对FSC-A对单细胞门控的细胞进行门控，以排除任何自发荧光碎片。
   2. 对经SSC-A与FSC-A门控的细胞，分析其GFP表达情况，方法为SSC-A对GFP-A。通过在GFP+细胞周围设置门，确定各血清稀释度及对照样品中GFP+细胞的百分比。
2. 通过将三个重复孔中GFP+细胞的总百分比除以3，计算每个血清样品稀释度及对照孔的GFP+细胞平均百分比。
3. 通过将各稀释度血清样品中GFP+细胞的平均百分比除以RPMI-10加RVPs（无血清样品）对照孔中GFP+细胞的平均百分比，计算感染增强倍数。
4. 绘制增强倍数（y轴）对稀释度（x轴）的图表，并采用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析，随后进行Tukey多重比较事后检验。

结果

在感染寨卡病毒（ZIKV）后16周，采集了4只恒河猴的血清，并检测其对登革病毒1、2、3和4型在K562细胞中感染的增强潜力。这些动物在感染后第3天达到病毒血症峰值，血浆中ZIKV RNA拷贝数约为1 × 10⁵ 拷贝/mL，随后病毒载量下降，在感染后7天已低于检测限。在感染后16周时，血浆中未检测到病毒血症。随后按照上述方案进行RVP检测并对收集的数据进行分析。

用于鉴定GFP+细胞的设门策略如图1所示。首先根据FSC-A与FSC-H的关系设定初始门，以排除自发荧光双联体，并仅纳入单细胞。下一个图仅显示来自单细胞门的细胞；在此图中，根据SSC-A与FSC-A的关系设定门，以排除任何自发荧光碎片。这些设门后的细胞随后在第三个图中基于SSC-A与FL1-A的关系进行展示，以鉴定GFP+细胞。被RVP感染的细胞表达GFP，通过围绕这些细胞设定门来确定GFP+细胞的百分比。在寨...

讨论

登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）在结构蛋白和非结构蛋白方面均存在显著的同源性证据，这些蛋白可诱导产生相互交叉反应的抗体^13,14。研究表明，这些交叉反应性抗体可在体内（in vivo）和体外（in vitro）增强异源血清型或其他相关黄病毒的感染^1,2。这种交叉增强感染的可能性对疾病防控以及疫苗研发具有重要意义。

传统的基于培养的检测方法采用非许可性细胞，在血清存在的情况下用具有感染性的活体登革病毒（DENV）进行感染。通过标准蚀斑检测法定量上清液中的病毒量，以测量感染增强程度¹¹。该检测需要在两种细胞系中培养病毒，且操作耗时较长。此外，并非所有DENV血清型的蚀斑形成方式都相同，这进一步增加了此类检测的复杂性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DENV 1-4 RVP	Integral Molecular	RVP-501
K562 细胞	ATCC	CCL-243
RPMI	Corning	10-040-CV
FBS	GE lifesceinces	SH 30910.03	RPMI-10 中含 10% FBS
青霉素-链霉素	MP biomedicals	1670049	RPMI-10 中含 100 IU 青霉素/mL，100 µg 链霉素/mL
HEPES	Cellegro	25-060-Cl	RPMI-10 中含 0.025 M
MEM 非必需氨基酸溶液（100×）	Sigma	M7145	RPMI-10 中使用 1×
丙酮酸钠	Cellegro	25-000-Cl	RPMI-10 中含 1 mM
L-谷氨酰胺	Fisher Scientific	MT25005CI
无菌 V 型底板	Thomas Scientific	333-8001-01V
BD Falcon 聚丙烯 5 mL FACS 管	VWR	60819-728
非无菌 U 型底板	Falcon	Ref 353910	FACS 管的高通量替代方案
5 mL 无菌刻度移液管	Denville	P7127
200 µL 无菌移液器吸头	Denville	P3020 CPS
20 µL 无菌移液器吸头	Denville	P1121
50–200 µL 多通道移液器	Denville	P3975-8-B
5–50 µL 多通道移液器	Denville	P3975-9-B
20% 甲醛	Tousimis	#1008B
水浴锅	ThermoFisher	TSCOL35
恒温混匀仪	Eppendorf	2231000387	用于热灭活的水浴锅替代设备
CO₂ 培养箱	ThermoFisher	13-998-213
乙醇	Sigma Aldrich	E7023
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348
Flowjo 9.8	TreeStar, Inc.		流式细胞术分析软件
BD FACSDiva 6.1.2	Becton Dikinson
BD LSR II 流式细胞仪	Becton Dikinson
液体漂白剂	Fisher Scientific	NC9724348