高通量siRNA筛选氯化苦和氟化氢诱导的角膜上皮细胞损伤

摘要

高通量小干扰RNA筛选是一种重要工具，有助于更快速地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。本文介绍了用于氢氟酸和氯化苦诱导角膜上皮损伤的高通量筛选暴露模型与方法的建立及验证。

摘要

毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质有可能迅速造成严重的组织损伤。目前对毒物引起的角膜损伤的治疗通常为支持性治疗，尚无针对此类损伤的特异性治疗药物。为了开发有效的治疗方法和治疗手段，了解这些损伤的分子和细胞机制至关重要。我们提出，利用高通量小干扰RNA（siRNA）筛选可能是一种重要工具，有助于更快地阐明化学性角膜上皮损伤的分子机制。siRNA是长度为19-25个核苷酸的双链RNA分子，通过转录后基因沉默途径降解与siRNA具有同源性的mRNA。随后可在暴露于毒物的细胞中研究特定基因表达降低的影响，以确定该基因在细胞对毒物反应中的功能。本文介绍了用于氢氟酸（HF）和氯化苦（CP）引起ocular损伤的体外（in vitro）暴露模型及高通量筛选（HTS）方法的建立与验证。尽管我们选择了这两种毒物作为研究对象，但经过对毒物暴露方案进行少量修改后，我们的方法同样适用于其他毒物的研究。本研究选用SV40大T抗原永生化的人角膜上皮细胞系SV40-HCEC。细胞活力和IL-8的产生被选为筛选方案的终点指标。本文还阐述了在建立适用于HTS研究的毒物暴露和细胞培养方法过程中所面临的若干挑战。建立这些毒物的高通量筛选模型，有助于进一步深入理解损伤机制，并可用于筛选潜在的化学性ocular损伤治疗药物。

引言

毒物引起的ocular损伤是一种真正的紧急情况，因为化学物质可能迅速造成严重的组织损伤。遗憾的是，目前对毒物所致角膜损伤的治疗仅限于一般性支持措施，尚无针对此类损伤的特异性治疗方法。当前的治疗策略缺乏特异性，主要采用局部治疗，如使用润滑剂、抗生素和睫状肌麻痹剂，待角膜重新上皮化后，再使用抗炎药物（例如，类固醇）^1,2。尽管现有的治疗手段已是最优选择，但由于角膜进行性混浊和新生血管形成，患者的长期预后通常较差^2,3。

动物模型传统上被用于研究化学物质的毒性并阐明损伤机制。然而，动物实验耗时且成本高昂，同时目前也存在减少动物实验的努力。例如，欧盟的REACH法规（EC 1907/2006）包含旨在减少动物实验的条款，这些条款要求企业共享已有数据，以避免重复开展动物实验，并在实施拟议的动物实验前须获得欧洲化学品管理局的批准。根据REACH法规的规定，动物实验应作为最后手段。此外，欧盟《化妆品法规》（EC 1223/2009）已逐步禁止在动物身上进行化妆品测试。当必须开展动物实验时，应遵循“3R原则”（优化、减少和替代），该原则为实施更人道的动物研究、减少使用动物数量以及在可能的情况下采用非动物替代方法提供了框架。基于上述原因，毒理学领域一直在寻求采用体外（in vitro）检测方法，以深入理解毒性的分子机制，并实现高通量分析⁴。这是一种功能毒理学方法，通过毒性物质的功能而非仅其化学结构来定义其特性。进一步地，功能毒理基因组学旨在揭示特定基因在毒性物质效应中所起的作用⁵。随着siRNA技术的应用，现已能够以高通量方式筛选研究基因在毒性物质引起的分子与细胞应答中的功能。siRNA是长度为19–25个核苷酸的双链RNA分子，可利用所有哺乳动物细胞中存在的转录后基因沉默通路⁶。这类分子为人工合成，设计用于靶向特定基因。当siRNA被导入细胞后，其会被加工处理，其中一条链（即引导链）被装载至RNA诱导的沉默复合体（RISC）中。siRNA引导RISC结合到mRNA分子上的互补区域，进而导致该mRNA被降解，从而降低特定基因的表达水平。随后可在暴露于毒性物质的细胞中研究该基因表达水平降低所产生的影响，以确定该基因在细胞对毒性物质应答过程中的功能。该方法已被用于进一步阐明蓖麻毒素敏感性的机制以及AHR依赖性诱导CYP1A1的机制^7,8。

化学恐怖主义风险评估（CTRA）清单和有毒工业化学品（TIC）目录根据化学品的毒性及其在恐怖袭击、战争或工业事故中可能被释放的风险，列出了特定的化学品⁹。我们正在采用siRNA高通量筛选（HTS）毒物基因组学方法，研究已被认定在恐怖袭击事件中具有高使用风险的CTRA清单中的有毒物质。传统毒理学旨在阐明化学物质对生物体产生的有害效应；然而，我们进一步希望了解其损伤机制，以指导治疗药物和治疗策略的开发，并可能发现可用于药物研发的分子靶点。从某些方面来看，这一研究工作可类比于在药物发现过程中应用高通量siRNA筛选和基于细胞的检测方法¹⁰。一个主要区别在于，药物发现通常致力于寻找单一的治疗靶点，而在我们的研究方法中，对于有毒物质暴露的治疗，极不可能存在一个具有高度治疗价值的单一靶点。我们预计，针对有毒物质暴露的有效治疗方案需要采取多方面的综合策略才能实现较高的治疗价值，而毒物基因组学数据可能对构建有效的治疗方案起到关键性的指导作用。

台式自动化将高通量方法引入制药和生物技术行业以外的实验室。 体外 我们研究所的历史研究一直采用传统的低通量检测方法^11,12,13近年来，我们实验室已逐步采用台式机器人技术进行高通量siRNA筛选。本文介绍了眼细胞模型的优化以及相关技术的开发。 体外 适用于高通量siRNA筛选的氟化氢（HF）和氯opicrin（CP）暴露方法。我们的目标是鉴定在这些毒物作用下调控细胞损伤的分子。我们所选用的siRNA文库靶点包括G蛋白偶联受体、蛋白激酶、蛋白酶、磷酸酶、离子通道以及其他潜在可成药靶点。HF和CP是通过交叉比对CTRA清单中的试剂与ToxNet工业事故报告，筛选出的在蒸气暴露条件下导致眼部损伤风险最高的物质。^9,14. CP（化学式 Cl₃CNO₂，CAS号76-06-2）最初在第一次世界大战中被用作催泪瓦斯¹⁵目前被用作农业熏蒸剂，具有杀线虫、杀菌和杀虫功能¹⁶氢氟酸（HF）被用于包括炼油厂中的烷基化反应以及有机化合物的电化学氟化等工艺过程。¹⁷. HF（化学式 HF，CAS 编号 62778-11-4）为气体，其水溶液形式为氢氟酸（HFA，CAS 编号 7664-39-3）。因此，我们在细胞暴露模型中选择使用 HFA。研究选用 SV40 大 T 抗原永生化的人角膜上皮细胞系 SV40-HCEC。细胞活力和炎症标志物 IL-8 被选为检测终点，因为参与细胞损伤的靶点应体现在细胞死亡和炎症反应中。具体而言，若某靶点在毒物暴露中发挥保护作用，则当该靶点表达被 siRNA 抑制时，细胞死亡和/或炎性细胞因子的产生应增加；反之，若靶点起负向作用，则结果相反。此外，慢性炎症在暴露后角膜病理过程中似乎发挥作用，干预细胞死亡通路可能改善临床结局^2,18.

方案

1. 细胞培养的维持

1. 在 DMEM F-12 培养基中培养 SV40-HCEC 细胞系，培养条件为 37 °C、5% CO₂ 和 90% 湿度，培养基中添加 15% 胎牛血清（FBS）、1% L-谷氨酰胺、10 µg/L 表皮生长因子（EGF）和 5 mg/L 胰岛素。
2. 每 3 至 4 天传代一次细胞系（根据接种密度而定），以确保在培养过程中细胞融合度从不超过 80%。
3. 使用消化液（每 150 cm² 培养瓶使用 14 mL 消化液）在 37 °C 下孵育不超过 8 分钟，使细胞从培养瓶壁脱离。
4. 用等体积的细胞培养基中和消化液，并将细胞转移至 50 mL 圆底离心管中，在 160 × g 条件下离心 7 分钟以收集细胞沉淀。
5. 用培养基重悬细胞沉淀（每 150 cm² 培养瓶使用 20 mL 培养基）。
6. 使用自动手持式细胞计数仪计数细胞，并以适当的密度接种至新培养瓶中，确保细胞可在 3 至 4 天内生长而不超过 80% 融合度。

2. 为实验接种细胞

1. 使用相差显微镜检查SV40-HCEC培养瓶，确保细胞融合度低于80%，并评估细胞整体健康状况。
2. 按照细胞培养维护步骤1.3至1.6所述方法，消化、离心、重悬并计数来自培养瓶的SV40-HCEC。使用含有0.5 µg/mL氢化可的松（HCORT培养基）的SV40-HCEC培养基重悬细胞。
3. 在一次性培养基瓶中，将SV40-HCEC以17,857个细胞/mL的浓度悬浮于预热的HCORT培养基中。
   1. 根据待接种培养板的数量，准备足量的细胞悬液。
   2. 每研究一块siRNA文库板，至少接种14块96孔板。
4. 轻轻摇动瓶子使细胞均匀悬浮，将适量细胞悬液倒入自动液体处理仪的轨道摇床孵育槽中的储液槽内，并在接种过程中将装有细胞悬液的瓶子置于37 °C加热板上保存。
5. 使用自动液体处理仪向96孔板每孔加入70 µL培养基，使细胞密度为每孔1000个细胞（5000个细胞/cm²）。所有操作步骤中均使用50 µL/s的移液速度。
   1. 在接种过程中，持续以100 rpm转速运行轨道摇床。
   2. 使用自动液体处理仪对细胞悬液进行三次混合（混合体积为140 µL）。
   3. 吸取140 µL细胞悬液，向两个细胞培养板的每孔中各分配70 µL。
   4. 重复步骤2.5.3和2.5.4，直至所有培养板均完成细胞接种。
   5. 在接种过程中根据需要及时补充细胞悬液储液槽中的液体。
6. 接种完成后，将培养板从自动液体处理仪中取出，在室温下静置30分钟后转移至细胞培养箱中孵育。
7. 次日早晨，使用置于细胞培养箱内的自动成像系统评估每块板每个孔的细胞密度，并排除任何内部孔细胞融合度不在15%至22%范围内的培养板。

3. 使用 siRNA 转染细胞

1. 从供应商处获取已预配置的siRNA文库板，每板包含80个siRNA靶点（参见 图4），第1列和第12列留空。
2. 根据制造商说明书，使用siRNA缓冲液重悬siRNA文库板，使每孔siRNA的终浓度为2 pmol/µL¹⁹.
3. 转染细胞：接种后24 h，每孔加入4 pmol siRNA和0.3 µL转染试剂进行转染。所有操作步骤均按照转染试剂生产商的说明书进行（参见 图4 用于平板布局）²⁰.
   1. 使用自动化液体处理仪进行所有转染操作，所有步骤的移液速度均为 25 µL/s。使用预配置的吸头盒，仅对需要转染的孔进行操作。
   2. 使用文库板的上半部分转染六块重复培养板，称为 "顶板组件" （每种siRNA六个重复，n=6）
   3. 使用文库板的下半部分转染另一组六个重复板，称为 "底部板组件" （每种siRNA六个重复，n=6）
   4. 使用该术语 "整板套装" 描述已转染文库siRNA的12个细胞培养板。
   5. 在所有全板组的顶部和底部板组均用文库siRNA转染后，用阴性对照池siRNA转染全板组中所有B2-B6孔。
   6. 另取两块培养板，将其中的B2-B6孔转染阴性对照siRNA池，这两块板不加入文库siRNA，作为未暴露对照组（一块用于上层板组，另一块用于下层板组）。
4. 在加入所有转染混合物后，将所有细胞培养板置于细胞培养箱中孵育4小时，每隔1小时轻轻敲击混匀。
5. 使用自动化液体处理仪，用预热的HCORT培养基以1:5比例稀释于PBS中，对所有孔板进行两次洗涤。所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。
   1. 从每个孔中吸出 100 µL 液体，并弃入废液容器中。
   2. 向每个孔中加入 100 µL/孔预热的 HCORT 培养基，该培养基用 PBS 按 1:5 比例稀释，置于另一储液器中，体积需足以满足所需板数的用量。
   3. 对每块板重复步骤 3.5.1 和 3.5.2。
      1. 根据需要清空废液储槽。
      2. 根据需要，用 PBS 按 1:5 比例稀释 HCORT 培养基后补充至储液槽中。
   4. 从每个孔中吸出 100 µL 并弃入废液槽中。
6. 用预热的HCORT培养基以每孔100 µL重新加样至所有孔中，该培养基应盛装于另一储液器中，并确保培养基体积足以满足所需板数的用量。
   1. 根据需要向储液槽中补充培养基。
7. 将所有培养板的C2-C6孔用作未转染对照。
8. 将所有培养板的 B7-B11 和 C7-C11 孔保持未转染状态，用作毒性物质暴露实验中的药物和溶剂对照。

4. 次日重新为细胞提供培养基

1. 使用自动化液体处理仪为所有孔板的孔重新加液。所有步骤均采用 50 µL/s 的移液速度。
   1. 从每个孔中吸取 100 µL 液体，并弃入废液槽中。
   2. 向每个孔中加入 100 µL/孔预热的 HCORT 培养基，培养基应来自另一个储液槽，并确保储液槽中含有足够体积的培养基以完成所有板的换液。
   3. 根据需要重复步骤 4.1.1 和 4.1.2，以完成所有细胞板的换液。
      1. 根据需要清空废液槽。
      2. 根据需要向储液槽中补充培养基。

5. 阳性对照添加

1. 转染后两天，暴露前两小时，用HCORT培养基配制62.5 µM的阳性对照物豆蔻素（cardamonin）溶液，用于HFA暴露实验，并加入8排稀释储液槽的B排。
   1. 对于CP暴露实验，配制并使用25 µM的SKF 86002溶液。
   2. 根据待测板的数量，配制足量的阳性对照溶液。
2. 用HCORT培养基配制0.625%的DMSO溶液（溶剂对照），并加入同一储液槽的C排。
   1. 对于CP暴露实验，配制并使用0.5%的DMSO溶液。
   2. 根据待测板的数量，配制足量的溶剂对照溶液。
3. 使用自动化液体处理仪，将阳性对照和溶剂对照分别加入每块细胞板的B7–B11和C7–C11孔中，所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。使用预配置的吸头盒，仅对将要加入阳性对照和溶剂对照的孔进行操作。
   1. 从每块细胞板的B7–B11和C7–C11孔中移除10 µL培养基，并弃入8排稀释储液槽的G排和H排。
   2. 向这些孔中转移10 µL的阳性对照和溶剂对照，并混合3次。
4. 将这些细胞板放回培养箱中。
5. 重复步骤5.3至5.4，直至所有细胞板均加入阳性对照和溶剂对照。

6. 培养细胞的高频暴露

警告：HFA 具有腐蚀性且急性毒性。

1. 所有化学暴露操作均须在化学通风橱内进行，并佩戴双层丁腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。
   1. 获取浓度为48%的氢氟酸（HFA）溶液。
   2. 用超纯水将HFA稀释至1%，并分装为5 mL等份，储存于10 mL厚壁聚乙烯小瓶中以提高安全性。
   3. 在将接触过HFA的移液枪头、储液槽以及剩余液态HFA丢弃至危险废物处理系统之前，须先用2.5%葡萄糖酸钙进行去污处理。
2. 针对每一块待研究的siRNA文库板，取80 mL预热的HCORT培养基置于150 mL瓶中，加入288 µL的1% HFA，配制0.0036%的HFA培养液。
   1. 轻轻旋转瓶子混匀，并将稀释后的HFA溶液置于化学通风橱内的37 °C培养箱中孵育10分钟。
3. 再次通过旋转瓶子充分混匀HFA培养液，然后将其加入置于板加热器上的试剂储液槽中。
4. 由两名技术人员协同完成暴露操作。
   1. 右侧技术人员使用12通道移液器从细胞板的内部孔中吸取100 µL液体，随后将板传递给左侧技术人员。
   2. 左侧技术人员向每孔加入100 µL HFA培养液。
   3. 对所有需暴露于毒物的细胞板重复步骤6.4.1和6.4.2。
   4. 对未暴露的对照板也重复步骤6.4.1和6.4.2，但使用新鲜的HCORT培养基代替HFA培养液。
5. 将处理后的板置于化学通风橱内的培养箱中孵育20分钟，随后转移回细胞培养箱中。
6. 在所有板完成暴露并返回细胞培养箱后，重复阳性对照添加步骤（步骤5.1至5.5），操作方法如前所述。

7. 培养细胞的CP暴露

警告：CP 具有急性毒性且为刺激物。

1. 所有化学暴露操作均须在化学通风橱内进行，并佩戴双层丁腈手套、实验服、一次性聚乙烯袖套和护目镜。
   1. 获取 CP。
   2. 将 CP 用 DMSO 稀释至 5%，并分装为 10 mL 等份，置于 10 mL 闪烁瓶中，以提高安全性。
   3. 在将接触过 CP 的移液器吸头和储液槽以及剩余液体 CP 丢弃至危险废物处理系统之前，先用 2.5% 亚硫酸氢钠进行去污处理。
2. 根据待暴露培养板的数量，准备足量的预热 HCORT 培养基（含 1× 青霉素/链霉素）和预热 PBS。
3. 对于每一套上层培养板或下层培养板，向 50 mL 预热的 HCORT 培养基中加入 8.04 µL 的 5% CP（溶于 DMSO），充分混匀，使 CP 的终浓度为 0.0008%。盖紧管盖，并将溶液置于化学通风橱内的 37 °C 培养箱中孵育 1 小时。
   1. 控制 CP 加入 50 mL 培养基等份的时间，确保每一套待暴露的上层培养板和下层培养板在 CP 加入培养基后恰好 1 小时接受毒物暴露。
4. 在孵育接近结束时，从细胞培养箱中取出一套上层培养板和 1 块未暴露的对照板，放置于化学通风橱内。
5. 在 1 小时孵育结束时，通过倒置混匀 CP 溶液，然后将其倾倒至试剂储液槽中。
6. 由两名技术人员协同完成暴露操作。
   1. 右侧技术人员使用 12 通道移液器从细胞培养板的内侧孔中吸出 100 µL 培养基，随后将培养板传递给左侧技术人员。
   2. 左侧技术人员向每孔加入 100 µL CP 培养基溶液。
   3. 对所有待暴露的上层培养板重复步骤 7.6.1 和 7.6.2。
   4. 对未暴露的对照板也重复步骤 7.6.1 和 7.6.2，但使用新鲜的 HCORT 培养基代替 CP 培养基溶液。
7. 将培养板置于化学通风橱内的 37 °C 培养箱中孵育 10 分钟。
8. 在 10 分钟孵育接近结束时，向试剂储液槽中加入足量的 PBS 和含 1× 青霉素/链霉素的预热 HCORT 培养基。
9. 在 10 分钟孵育结束时，使用 12 通道移液器从细胞培养板中移除 CP 溶液，并向每孔加入 100 µL PBS。
10. 立即从细胞培养板中移除 PBS，并向每孔加入 100 µL 含 1× 青霉素/链霉素的 HCORT 培养基。
11. 对未暴露的对照板同样重复步骤 7.9 和 7.10。
12. 将细胞培养板放回标准细胞培养箱中。
13. 对下层培养板重复步骤 7.3 至 7.12。
14. 在所有培养板完成暴露并放回细胞培养箱后，重复阳性对照添加步骤（步骤 5.1 至 5.5），方法同前。

8. 样品采集与细胞活力检测

1. 暴露后 24 小时，配制含有 10 g/L 葡萄糖的 PBS 溶液，其中 MTT 底物浓度为 0.5 mg/mL，并预热至 37 °C²¹。每块待检测的培养板准备 10 mL 底物溶液。
2. 根据待检测的培养板数量，向自动液体处理系统的储液槽中加入足量的 MTT 底物溶液。
3. 使用自动液体处理系统进行取样，并以 50 µL/s 的移液速度加入 MTT 底物，所有步骤均采用该速度。预先配置吸头盒，仅针对需要检测的孔位进行操作。
   1. 从细胞培养板的内侧 60 个孔中各吸取 95 µL 培养基，并将 42.5 µL 分别转移至两个 384 孔储存板中。
   2. 立即向细胞培养板的每个孔中加入 100 µL MTT 底物溶液，在细胞培养箱中 37 °C 孵育 1.5 小时。
   3. 根据需要，向储液槽中补充 MTT 底物溶液。
4. 将细胞培养板置于细胞培养箱中 37 °C 孵育 1 小时。
5. 密封 384 孔储存板，并于 -80 °C 保存，以备后续分析。
6. 对所有顶部和底部培养板组及其相应的未暴露对照组重复步骤 8.3 至 8.5。
   1. 如需在重复样本间重复使用吸头，应在添加 MTT 底物溶液时以及在不同板组之间切换时清洗吸头。
7. 孵育 1 小时后，向自动液体处理系统的储液槽中加入足量的 DMSO。
8. 使用自动液体处理系统加入 DMSO，所有步骤均采用 50 µL/s 的移液速度。
   1. 从细胞培养板的每个内孔中吸取 100 µL 液体，将 MTT 底物溶液弃入废液槽。
      1. 根据需要清空废液槽。
   2. 向每个孔中覆盖 100 µL DMSO。
      1. 根据需要补充 DMSO 储液槽中的液体。
9. 将培养板置于板式振荡器上振荡 3 分钟。
10. 使用板式分光光度计在 570 nm 和 690 nm 波长下测定吸光度。
11. 扣除背景值，通过将暴露组的吸光度值除以未暴露对照组的吸光度值来计算细胞活力百分比。所有靶标均使用平均未暴露阴性池 siRNA 对照计算细胞活力百分比。

9. 测定细胞培养上清液中IL-8的浓度

1. 根据制造商的说明²²，使用无需洗涤的基于微珠的检测方法测定细胞培养上清液中IL-8的浓度。设计检测板布局以容纳样本和标准曲线。
2. 从-80 °C冰箱中取出384孔储存板，在室温下解冻，并短暂离心以使孔底的样本完全沉降。
3. 根据待运行的检测板数量，在试剂盒提供的检测缓冲液中配制足量的抗IL-8受体微珠和生物素化抗IL-8抗体。按每9.9 mL检测缓冲液加入50 µL抗IL-8受体微珠和50 µL生物素化抗IL-8抗体的比例进行配制。
   1. 使用多通道移液器，将微珠/抗体混合液加入黑色384孔储存板中。
      1. 根据检测板布局，将受体微珠/抗体加入指定用于样本和标准曲线的孔中。
      2. 每孔加入足量液体，以满足待运行检测板的数量需求。
4. 使用含354 µM NaCl的细胞培养基将IL-8标准品重悬至1000 pg/mL。根据待运行检测板的数量配制足量标准品溶液。
5. 对标准品进行八次两倍系列稀释。
6. 根据检测板布局，将标准曲线样品以每孔足量体积加入黑色384孔储存板的相应孔中，每组设三个复孔。
   1. 同样地，加入不含IL-8但含354 µM NaCl的细胞培养基作为背景对照。
7. 使用自动化液体处理系统进行检测。使用预配置的吸头盒，仅处理检测板布局中指定的孔。所有步骤均采用50 µL/s的移液速度。
   1. 将8 µL受体微珠-抗体混合液转移至白色384孔浅孔检测板的各孔中。
      1. 仅加入检测板布局中指定用于样本和标准曲线的孔。
   2. 根据检测板布局，将2 µL标准曲线溶液转移至浅孔检测板的相应孔中。
   3. 配制3.54 M NaCl溶液，并根据待检测板数量，向自动化液体处理系统的浅层储液槽中加入足量该溶液。
   4. 通过向黑色384孔储存板中的样本孔加入4.5 µL NaCl溶液，调整样本的盐浓度，使其与标准曲线一致。
   5. 使用30 µL混匀体积将样本混匀三次，然后根据检测板布局，将2 µL样本转移至白色浅孔检测板中。
      1. 在不同样本板之间更换吸头。
   6. 在室温避光条件下孵育1小时。
   7. 根据待运行的检测板数量，在检测缓冲液中配制足量的二级受体微珠。按每12.3 mL检测缓冲液加入200 µL二级受体微珠的比例进行配制。
   8. 使用多通道移液器，将二级微珠加入黑色384孔储存板中。
      1. 根据检测板布局，将二级微珠加入指定用于样本和标准曲线的孔中。
      2. 每孔加入足量液体，以满足待运行检测板的数量需求。
   9. 使用自动化液体处理系统，将10 µL二级微珠转移至白色384孔浅孔检测板的各孔中。
      1. 仅加入根据检测板布局已接收样本和标准曲线的孔，并在每块板之间清洗吸头。
   10. 继续在室温避光条件下孵育1小时。
8. 用透明封板膜密封检测板，并使用与检测兼容的酶标仪进行扫描。扫描时设置板与检测器之间的距离为0.2 mm，激发时间为180 ms，检测时间为550 ms。
9. 将IL-8检测的原始数据导入电子表格。
10. 对IL-8检测的标准曲线进行自动拟合，然后将每个样本的原始数据转换为pg/mL单位。

结果

暴露方法的开发

我们优化并评估了SV40-HCEC人角膜上皮细胞系在高通量筛选（HTS）研究中的适用性。SV40-HCEC细胞系通过SV-40大T抗原永生化获得，由Dhanajay Pal²³惠赠。在暴露方法学开发过程中涉及的变量过多，无法在此简洁呈现，因此仅展示部分我们认为可能对多种毒物具有广泛适用性的研究结果。

通过加样或培养基更换进行毒物暴露

我们最初尝试通过将5 µL用蒸馏水、生理盐水或培养基稀释后的毒性物质工作液加入到96孔板每个孔内已有的95 µL培养基中，使细胞暴露于目标终浓度。SV40-HCEC细胞...

讨论

本文介绍了我们为研究氢氟酸（HF）和氯化磷（CP）损伤而建立的高通量角膜上皮细胞筛选模型的方法与结果。同时，我们还展示了针对HF损伤的初次siRNA筛选结果。在建立用于研究化学性眼损伤（TIC）的高通量筛选（HTS）模型过程中，存在诸多挑战。文献中可查到的关于在细胞培养模型中研究HF、氢氟酸（HFA）或CP的方法，对我们的帮助十分有限。大多数 体外 关于氟离子的研究涉及口腔细胞，并使用氟化钠而非HF或HFA（部分示例如下所示，参见^28,29）。一些关于该 体外 佩索尼已发表关于支气管上皮细胞暴露于CP的研究 等³⁰最终，我们发现文献中尚无与HF、HFA或CP的高通量筛选（HTS）研究相关的特定方法，与这些有毒物质在HTS中研究相关的绝大多数挑战和变量均需自行开发解决。为确保HTS研究的成功，特别关注实现在时间和大量筛选板之间高度一致的暴露条件。

在细胞培养系统中毒性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Bravo液体处理平台	Agilent或同等产品	G5409A
Bravo平板振荡器	Agilent或同等产品	Option 159
Bravo 96LT一次性吸头头	Agilent或同等产品	Option 178	96通道大吸头移液头单元
Bravo 96ST一次性吸头头	Agilent或同等产品	Option 177	96通道小吸头移液头单元
Bravo 384ST一次性吸头头	Agilent或同等产品	Option 179	384通道小吸头移液头单元
Bravo 96 250 μL无菌屏障吸头	Agilent或同等产品	19477-022
Bravo 384 30 μL无菌屏障吸头	Agilent或同等产品	19133-212
Bravo 384 70 μL无菌屏障吸头	Agilent或同等产品	19133-212
EnSpire多功能酶标仪	Perkin Elmer或同等产品	2300-0000	配备高功率激光激发的AlphaLISA检测仪
IL-8（人）AlphaLISA检测试剂盒	Perkin Elmer或同等产品	AL224F	免洗涤珠基检测法
ProxiPlate-384 Plus白色384浅孔微孔板	Perkin Elmer或同等产品	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen或同等产品	13778500	转染试剂
Opti-MEM 1减血清培养基	Invitrogen或同等产品	31985070
TrypLE Express	Gibco或同等产品	12605010	细胞解离溶液
IncuCyte Zoom	Essen Instruments或同等产品	ESSEN BIOSCI 4473	置于培养箱内的全自动显微镜
氯化苦	Trinity Manufacturing或同等产品	N/A	具有急性毒性和刺激性
DMEM-F12细胞培养基	Invitrogen或同等产品	11330-057	含HEPES
胎牛血清	Invitrogen或同等产品	1891471
人表皮生长因子（细胞培养级）	Invitrogen或同等产品	E9644-.2MG
重组人胰岛素（细胞培养级）	Invitrogen或同等产品	12585-014
青霉素-链霉素溶液（细胞培养级）	Invitrogen或同等产品	15140122
氢化可的松（细胞培养级）	Sigma或同等产品	H0888-10G
葡萄糖 （细胞培养级）	Sigma或同等产品	G7021
PBS （细胞培养级）	Sigma或同等产品	P5493
siRNA	Dharmacon或同等产品	各种
噻唑蓝四氮唑溴盐	Sigma或同等产品	M5655	MTT检测底物
siRNA缓冲液	Thermo或同等产品	B002000
96孔细胞培养板	Corning或同等产品	CLS3595
T150细胞培养瓶	Corning或同等产品	CLS430825
BSL-2级细胞培养生物安全柜	Nuaire或同等产品	NU-540
300 mL机器人用储液槽	Thermo或同等产品	12-565-572
96孔带挡板自动化储液槽	Thermo或同等产品	1064-15-8
500 mL无菌一次性储存瓶	Corning或同等产品	CLS430282
微孔板热封仪	Thermo或同等产品	AB-1443A
微孔板热封膜	Thermo或同等产品	AB-0475
豆蔻素	Tocris或同等产品	2509	抗炎剂，用作阳性对照
SKF 86002	Tocris或同等产品	2008	抗炎剂，用作阳性对照
DMSO	Sigma或同等产品	D8418
48%氢氟酸	Sigma或同等产品	339261	具有腐蚀性和急性毒性
1000 μL单通道移液器	Rainin或同等产品	17014382
200 μL单通道移液器	Rainin或同等产品	17014391
20 μL单通道移液器	Rainin或同等产品	17014392
1000 μL 12通道移液器	Rainin或同等产品	17014497
200 μL 12通道移液器	Rainin或同等产品	17013810
20 μL 12通道移液器	Rainin或同等产品	17013808
移液器吸头 1000 μL	Rainin或同等产品	17002920
移液器吸头 200 μL	Rainin或同等产品	17014294
移液器吸头 20 μL	Rainin或同等产品	17002928
化学通风橱	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384孔样品储存板	Thermo或同等产品	262261
氯化钠	Sigma或同等产品	S6191
50 mL锥形管	Thermo或同等产品	14-959-49A
50 mL血清移液管	Corning或同等产品	07-200-576
25 mL血清移液管	Corning或同等产品	07-200-575
10 mL血清移液管	Corning或同等产品	07-200-574
5 mL血清移液管	Corning或同等产品	07-200-573
SV40-HCEC永生化人角膜上皮细胞	N/A	N/A	这些细胞不对外销售，但可从本文引用的研究人员处获得
Sceptor手持式自动细胞计数仪	Millipore或同等产品	PHCC20060
GeneTitan多通道（MC）仪器	Affymetrix或同等产品	00-0372
Affymetrix 24孔和96孔阵列板	Affymetrix或同等产品	901257; 901434
Draegger HF管	Draeger或同等产品	8103251
Draegger CP管	Draeger或同等产品	8103421
Draegger泵	Draeger或同等产品	6400000
透明板密封膜	Resesarch Products International或同等产品	202502
试剂储液槽	VistaLab Technologies或同等产品	3054-1000
Xlfit	IDBS或同等产品	N/A	用于自动曲线拟合的Excel插件