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方法文章

利用少量组织测量果蝇透化肌纤维的线粒体耗氧量

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DOI：

10.3791/57376

⸱

2018年4月7日

 ,  ,  ,  , 
1Département de chimie et biochimie, Université de Moncton, 2Département de biologie, Université de Moncton

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用高分辨率呼吸测定法测量果蝇透化胸段耗氧量的方法。与传统的线粒体分离技术相比，该技术所需组织量极少，且获得的结果更具生理相关性。

摘要

果蝇Drosophila melanogaster是代谢研究中一种新兴的模式生物。事实上，果蝇具有与人类器官同源的结构，拥有高度保守的代谢通路，并且寿命相对较短，可在较短时间内研究多种基本的生命机制。然而，令人惊讶的是，细胞代谢所必需的关键机制之一——线粒体呼吸作用——在该模型中尚未得到充分研究。这可能是因为通常测量果蝇线粒体呼吸需要大量个体，且实验结果的可重复性较低。本文介绍了一种利用极少果蝇组织精确测定线粒体耗氧量的方法。该方法中，分离果蝇胸部组织，并通过锋利的镊子进行机械穿孔，同时使用皂苷进行化学透化处理，从而使不同化合物能够穿过细胞膜并调节线粒体呼吸。透化处理后，采用一套实验流程评估电子传递系统（ETS）中各复合物氧化不同底物的能力，以及其对解偶联剂和多种抑制剂的反应。与传统的线粒体分离方法相比，该方法具有诸多优势：由于线粒体仍与其他细胞组分相互作用，且线粒体形态得以保持，因此更接近生理状态；此外，样品制备更快速，实验结果具有高度可重复性。将果蝇作为代谢研究模型的优势与线粒体呼吸功能评估相结合，可揭示重要的新见解，尤其是在果蝇处于不同环境或病理生理条件下时。

引言

果蝇Drosophila melanogaster作为遗传学研究的模式生物已有超过一个世纪的历史1。对这种生物的研究不仅推动了关于伴性遗传2、突变率3、神经系统发育以及细胞命运决定等基础科学知识的重大进展4，而且近年来还成为研究阿尔茨海默病和帕金森病等疾病机制的重要工具5,6。此外，果蝇也是研究衰老过程的常用模型，因其可在短时间内大量繁殖且寿命较短。果蝇还具有与人类器官同源的结构，例如心脏、卵细胞（类似肝细胞）、脂肪体（功能类似于肝脏和白色脂肪组织）、胰岛素分泌细胞（相当于胰腺β细胞），以及运输代谢物的血淋巴（类似于脊椎动物的血液）7。此外，中间代谢的核心通路（包括胰岛素/类胰岛素生长因子信号通路和雷帕霉素靶蛋白-TOR通路）在进化上也高度保守7。基于上述原因，近年来果蝇被广泛用于揭示调控代谢的基本机制，尤其是在糖尿病等人类代谢性疾病的病理条件下8。代谢的一个重要组成部分是线粒体，它整合多种代谢通路，并通过氧化磷酸化过程（OXPHOS）执行生命中最关键的生物学功能之一——ATP的生成。鉴于线粒体在机体代谢中的核心作用，其功能障碍参与多种疾病的发生并不令人意外，例如帕金森病9和阿尔茨海默病10，以及肌萎缩侧索硬化症11,12。线粒体也是衰老过程的基本决定因素。事实上，它们是细胞内活性氧（ROS）的主要来源，高浓度的ROS可通过氧化损伤对细胞造成危害11。衰老还与受损或突变的线粒体DNA积累13、线粒体自噬功能障碍14,15以及线粒体生物合成受损16密切相关。线粒体还是细胞稳态的关键调节者，能够利用不同的底物，根据宏量营养素的丰度或缺乏来调节多种细胞功能17,18。

事实上，饮食中的各种营养物质（碳水化合物、脂质和蛋白质）被消化、吸收并转运至细胞内，在细胞质中进行转化，所产生的底物被转运至线粒体基质中，生成还原当量，例如 NADH 和 FADH219。这些还原当量随后由电子传递系统（ETS）中的不同酶复合体氧化。这些复合体嵌入在线粒体内膜中，如复合体 I 和复合体 II。此外，其他酶复合体，如线粒体甘油-3-磷酸脱氢酶和脯氨酸脱氢酶，也构成了电子进入 ETS 的替代途径20,21。这些“替代性”复合体在昆虫中尤为重要，因为根据物种的不同，它们可积极参与并增强呼吸作用20,22,23,21。来自这些 ETS 供电子系统的电子被传递至泛醌，随后传递至复合体 III，再至复合体 IV，最终传递给分子氧这一终末受体。该电子传递过程在线粒体内膜上产生质子驱动力，驱动复合体 V 将 ADP 磷酸化为 ATP（图 1）。鉴于线粒体在细胞稳态中的核心作用，利用合适的模式生物 D. melanogaster 研究线粒体代谢，是揭示各种病理生理条件或细胞与环境应激下潜在机制的有力工具。然而令人惊讶的是，实际测量果蝇线粒体呼吸作用的研究仅有少数几项24,25,26。事实上，旨在评估线粒体耗氧量的实验通常需要分离线粒体。尽管线粒体分离有利于测量多种线粒体功能（如活性氧产生或 P/O 比值作为线粒体效率的指标27,28），但这些分离通常需要来自多个个体的较大量组织24,29。对大量组织和个体的需求是一个重要的限制因素，尤其考虑到所有个体应具有相同年龄且最好为同一性别，这使得在不同时间点测量呼吸作用变得极为繁琐。此外，尽管线粒体分离可为调控线粒体代谢的基本机制提供重要见解，但用于分离线粒体的方法存在若干缺点，例如难以获得可重复的结果、线粒体网络的破坏，以及线粒体结构和功能的改变29,30,31。

本研究旨在介绍一种可靠的实验方案，仅需使用极少量果蝇个体的组织即可测量黑腹果蝇（Drosophila）的线粒体耗氧量。该方案结合果蝇胸节中经透化处理的肌纤维29与高分辨率呼吸测定法32,33,34,35，实现对线粒体耗氧量的原位（in situ）测定。与传统的线粒体分离方法相比，该方法还具有额外优势，因为在透化肌纤维中，线粒体与其他细胞组分之间的相互作用以及线粒体的结构和功能均得到更完整的保留29,31,36，从而使该方法在生理相关性方面更具优势。利用本方案，仅需三只黑腹果蝇的胸节组织，即可通过高分辨率呼吸测定法精确评估线粒体功能，并结合不同底物测定电子传递系统（ETS）多个步骤中的耗氧量。因此，该方案可借助果蝇模型，帮助回答在多种环境或病理生理条件下调控代谢的基本机制中的关键科学问题。

为了在电子传递系统（ETS）的多个不同步骤中测量氧气消耗，并评估不同底物对呼吸的贡献，在组织透化后使用不同的底物（图1）、解偶联剂和抑制剂30。具体而言，通过依次添加不同的底物，以刺激电子经由ETS的不同复合物进入。随后加入解偶联剂羰基氰化物-4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP），在最佳浓度下测定非偶联呼吸，即非磷酸化呼吸，使其达到最大氧气消耗。接着依次抑制复合物I、II和III，以监测由非ETS氧化反应引起的残余氧气消耗。最后，通过加入人工电子供体N,N,N',N-四甲基对苯二胺（TMPD）和抗坏血酸，可评估复合物IV的最大呼吸能力。需要注意的是，实验在24 °C下进行，因为这是果蝇培养的温度。

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方案

1. 试剂准备

  1. 准备以下溶液用于组织的解剖和透化。
    1. 配制保存液：2.77 mM CaK2EGTA、7.23 mM K2EGTA、5.77 mM Na2ATP、6.56 mM MgCl2、20 mM 牛磺酸、15 mM Na2磷酸肌酸、20 mM 咪唑、0.5 mM 二硫苏糖醇，以及 50 mM K-MES，pH 7.1（可于 -20 °C 保存）。
    2. 配制皂苷溶液：将 5 mg 皂苷溶于 1 mL 保存液中（每日新鲜配制）。
  2. 准备以下溶液用于呼吸作用的测定。
    1. 配制呼吸介质：120 mM KCl、5 mM KH2PO4、3 mM HEPES、1 mM EGTA、1 mM MgCl2 和 0.2% BSA（w/v），pH 7.2。
    2. 配制底物、解偶联剂和抑制剂。将所有底物溶于 H2O 中，将解偶联剂 FCCP 及除丙二酸盐（溶于 H2O）外的所有抑制剂溶于无水乙醇中。大多数底物及丙二酸盐需进行中和处理（见材料表）。本方案中所列所有浓度均为 2 mL 测定腔内的终浓度。

2. 高分辨率呼吸测定仪的准备与校准。

  1. 用70%乙醇将呼吸测定仪的检测室、盖子和塞子清洗三遍，再用蒸馏水清洗三遍。
  2. 在零氧浓度下进行校准：向检测室中加入2.3 mL呼吸介质，并加入10 mg连二亚硫酸钠。尽管检测室的最大容积为2 mL，但需加入2.3 mL以确保关闭检测室时塞子下方无气泡残留。用塞子封闭检测室，测量10–20分钟的氧浓度。根据测得的耗氧速率，将电极在零氧浓度下进行校准。
  3. 用蒸馏水清洗检测室，再在无水乙醇中孵育10分钟，然后用蒸馏水冲洗。
  4. 在空气饱和条件下进行校准：向检测室中加入2.3 mL呼吸介质，插入塞子，吸去塞子上方多余的介质，然后用垫片将塞子略微抬起。随后向检测室中补加呼吸介质（总体积为2 mL），以避免关闭检测室后出现气泡。
  5. 监测耗氧量45分钟至1小时，直至在24 °C时氧浓度（蓝色曲线）稳定在约250 nM。

3. 果蝇解剖与组织透化

  1. 确保所有步骤均在冰上进行。
  2. 将六只同品系、同龄且饲喂相同饮食的雄性果蝇（野生型 w1118，15 日龄，饲喂玉米粉培养基）置于冰上麻醉，以方便后续解剖操作。
  3. 使用解剖刀和尖头镊子解剖果蝇（去除头部和腹部），仅保留含有飞行肌的胸部组织。此步骤可直接用肉眼完成。操作所得的胸部组织需用尖头镊子小心夹取。
  4. 用镊子将三只已解剖的果蝇胸部转移至含有 2 mL 冰冷保存液的 25 mm 培养皿中。
  5. 用尖头镊子将胸部组织机械性穿孔：将镊子尖端插入胸部组织中，反复撕扯，使组织形成松散连接的网状结构。
  6. 在 24 孔板中，向两个孔内各加入 12.5 µL 皂苷溶液和 1 mL 保存液，使皂苷终浓度为 62.5 µg/mL；相邻的两个孔则各加入 1 mL 呼吸介质。
  7. 用尖头镊子将三只已机械穿孔的胸部组织转移至稀释后的皂苷溶液中，在冰上置于旋转摇床上轻微振荡孵育 20 分钟。
  8. 上述孵育结束后，用尖头镊子将组织转移至相邻含有呼吸介质的孔中，在冰上轻微振荡清洗 5 分钟，以去除残留皂苷。

4. 干重的测定

  1. 将已透化的胸部分置于吸水材料表面，用尖头镊子翻动3-4次，确保去除所有水分。
  2. 将三个胸部组织一起在微量天平上称重。记录所得重量，用于后续标准化线粒体耗氧速率。
  3. 立即将组织转移至冰上的一滴呼吸介质液滴中。

5. 氧消耗速率的测定

  1. 打开呼吸测定仪的腔室（取下塞子），向每个腔室中加入 10 mM 丙酮酸和 2 mM 苹果酸。
  2. 将已透化的组织直接加入含有呼吸介质的反应 chamber 中。
  3. 使用间隔器更换塞子。
  4. 使用60 mL注射器直接从氧气罐中抽取氧气，并通过每个腔室的密封毛细管注入2–5 mL氧气，以确保组织中的氧气扩散不会限制氧气消耗。
  5. 将 Hamilton 注射器插入每个塞子的毛细管中，以确保胸段保持在反应室内。
  6. 当氧浓度约为400 nM时完全关闭腔室，使腔室内的氧水平高于空气饱和度（约为空气饱和度的160%）。
  7. 停止并重新启动搅拌器，以检查检测室中是否存在气泡。
  8. 输入先前称量的组织质量，以根据组织质量（mg）标准化呼吸速率，显示质量特异性的氧气消耗（pmol O2 消耗的。-1毫克-1 组织量）。
  9. 待氧消耗量稳定后（红色轨迹），用 Hamilton 注射器加入 5 mM ADP。
  10. 每次注射后，用蒸馏水、70%乙醇和蒸馏水依次冲洗注射器。
  11. 待测氧气消耗量再次稳定后，注入 5 µ4 mM 细胞色素 c 溶液的 L
  12. 依次注入以下底物，以评估电子传递系统（ETS）不同阶段的线粒体氧消耗：
    1. 加入 5 µ2 M 脯氨酸溶液的升数。
    2. 加入10 µ1 M 琥珀酸的 L
    3. 加入30 µ1 M 甘油-3-磷酸溶液的升数
  13. 以 0.5–1 为梯度，分步滴加解偶联剂 FCCP µM (2 µ1 mM 溶液）直至达到最佳浓度， 即， 达到最大氧气消耗且无抑制作用的浓度（注意事项：参见 材料表).
  14. 依次加入以下抑制剂，以完全抑制电子传递系统（ETS）中的电子流，从而测量残余氧消耗（ROX），即除呼吸作用外的非呼吸性反应，如加氧酶反应等：
    1. 加入1 µ1 mM 鱼藤酮（注意：参见 材料清单).
    2. 加入 5 µ2 M 丙二酸溶液的 L（注意：参见 材料清单).
    3. 加入1 µ5 mM 抗霉素 A 的 L（注意：参见 材料表).
  15. 依次向反应室中加入0.2 mM抗坏血酸和0.5 mM TMPD，先加入抗坏血酸以测定复合物IV的氧消耗。
  16. 加入20 mM叠氮化钠以抑制复合体IV（注意：参见 材料表).
  17. 信号稳定后，打开装有间隔器的检测室，注入2 mL纯氧以重新充氧，当氧浓度达到约250–300 nmol·mL时关闭检测室。-1.
  18. 测量信号10-15分钟，并计算化学背景值， 即， 由TMPD自氧化引起的氧气消耗。

6. 呼吸仪的清洗

  1. 测量结束后，先用蒸馏水冲洗一次反应室，再用70%乙醇冲洗三次。
  2. 在无水乙醇中孵育10分钟，以灭活抑制剂。
  3. 用蒸馏水冲洗三次，将反应室中充满70%乙醇，并重新装上塞子和盖子，直至下次使用。

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结果

使用上述方案测定线粒体耗氧量的代表性轨迹图如下所示 图2. 注入孵育 chamber 中并与透化的肌肉纤维一同孵育的丙酮酸和苹果酸，用于测定复合体 I 泄漏呼吸（CI-LEAK respiration）， 即，当电子传递链中的复合体 I（CI）被丙酮酸和苹果酸经三羧酸循环氧化产生的 NADH 激活时。在此呼吸速率下，线粒体耗氧主要用于补偿质子漏 即，当ATP合酶不活跃时，质子从膜间隙跨膜进入线粒体基质（LEAK）30当加入ADP后，ATP合酶被激活，电子从复合物I（complex I）传递至复合物IV（complex IV），同时将ADP磷酸化为ATP（CI-OXPHOS），导致线粒体耗氧量增加。OXPHOS偶联比率计算为CI-OXPHOS与CI-LEAK的比值，通常被视为评估线粒体质量及线粒体偶联状态的良好指标。30. 在果蝇中，该比值应至少超过 6.0（

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讨论

本研究描述了一种在测量黑腹果蝇线粒体耗氧量之前进行样品制备的方法。该方法的建立旨在克服使用线粒体分离方案所涉及的多种问题，特别是在实验耗时和所需个体数量方面的局限。本实验不采用通常需要从多个个体获取大量组织的线粒体分离方法，而是以少量黑腹果蝇胸段的透化肌纤维为材料进行。在本方案中，仅需三个个体即可获得理想结果。因此，可以在不同时间点进行线粒体耗氧量的测量，因为同步化少量同龄且同性别果蝇的实验操作更为可行。

首先，为了获得较低的实验结果变异性，应使用相同年龄、性别、品系且在相同条件下培养的黑腹果蝇（图6），因为呼吸作用会随着果蝇的年龄、性别、基因型和饮食而发生变化。执行本实验方案中最关键的步骤是胸节的透化处理。操作必须迅速，以避免组织降解；同时必须确保胸节充分透化，以获得最大化的氧气消耗速率。为验证透化操作是否正确完成，并确认线粒体在透化后仍保持结构和功能的完整性，需采用OXPHOS偶联比（CI-OXPHOS/CI-LEAK，图3）以及对细胞色素c的响应（图4）作为质量控制指标。在操...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC，发现基金）和蒙克顿大学向 NP 提供的资助支持。LHB 感谢加拿大卫生研究院（CIHR）、新不伦瑞克创新基金会（NBIF）和蒙克顿大学提供的经费支持。EHC 的工作得到了加拿大阿尔茨海默病协会、脑加拿大、加拿大自然科学与工程研究委员会、加拿大乳腺癌基金会、新不伦瑞克创新基金会、新不伦瑞克健康研究基金会以及蒙克顿大学的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高分辨率呼吸测量仪 Oxygraph O2KOroboros Instruments, Innsbruck, Austria10022-02启动 O2K 呼吸测量仪套件
 
O2K-滴定套装 Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20820-03不同体积的 Hamilton 注射器
 
Datlab 软件Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria20700用于数据采集和分析的软件
 
细尖无磁镊子VWR82027-400
 
Secura225D-1S-DQESartorius AG, Goettingen, Germany半微量天平（由多家公司分销） 
 
Drosophila melanogaster 野生型 w1118Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA
储存条件：24 °C
乙二醇双(2-氨基乙基醚)-N,N,N′,N′-四乙酸Sigma-AldrichE4378EGTA
储存条件：室温
KOHSigma-AldrichP1767注意：对金属具有腐蚀性，急性毒性，皮肤腐蚀，严重眼损伤，急性水生毒性。
储存条件：室温
CaCO3Sigma-AldrichC4830
储存条件：室温
Na2ATPSigma-AldrichA2383
储存条件：-20 °C
MgCl2·6H2OSigma-AldrichM9272
储存条件：室温
牛磺酸Sigma-AldrichT0625
储存条件：室温
Na2磷酸肌酸Sigma-AldrichP7936
储存条件：-20 °C
咪唑Sigma-AldrichI5513
储存条件：室温
二硫苏糖醇Sigma-AldrichD0632
储存条件：2–8 °C
MES 水合物Sigma-AldrichM8250
储存条件：室温
来自皂荚树皮的皂苷Sigma-AldrichS7900皂苷
储存条件：室温
溶液配制：5 mg 溶于 1 mL 保存液中。每日新鲜配制。
KClSigma-AldrichP9541
储存条件：室温
KH2PO4Sigma-AldrichP9791
储存条件：室温
HEPESSigma-AldrichH3375
储存条件：室温
BSASigma-Aldrich05470
储存条件：2–8 °C
Na2S2O4Sigma-Aldrich157953连二亚硫酸钠。注意：自热性物质和混合物，急性毒性，急性水生毒性，慢性水生毒性。
储存条件：室温
丙酮酸钠Sigma-AldrichP2256丙酮酸盐
储存条件：2–8 °C
溶液配制：溶于 MilliQ 水中。每日新鲜配制。
L-(-)-苹果酸Sigma-AldrichM1000苹果酸盐
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和后于 -20 °C 保存。
腺苷-5'-二磷酸单钾盐水合物Sigma-AldrichA5285ADP
储存条件：-20 °C
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和后于 -80 °C 保存。
马心细胞色素 cSigma-AldrichC7752细胞色素 c
储存条件：-20 °C
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。
L-脯氨酸Sigma-AldrichP0380脯氨酸
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。
琥珀酸钠二碱六水合物Sigma-AldrichS2378琥珀酸盐
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 HCl 中和后于 -20 °C 保存。
sn-甘油-3-磷酸双(环己胺)盐Sigma-AldrichG7886甘油-3-磷酸盐
储存条件：-20 °C
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 HCl 中和后于 -80 °C 保存。
羰基氰-4-(三氟甲氧基)苯腙Sigma-AldrichC2920FCCP。注意：急性毒性，皮肤致敏，慢性水生毒性。
储存条件：室温
溶液配制：溶于无水乙醇中。置于玻璃瓶中于 -20 °C 保存。
鱼藤酮Sigma-AldrichR8875注意：急性毒性，皮肤刺激，眼刺激，特定靶器官毒性（呼吸系统），急性水生毒性，慢性水生毒性。
溶液配制：溶于无水乙醇中。置于避光瓶中于 -20 °C 保存。
丙二酸Sigma-AldrichM1296丙二酸盐。注意：急性毒性，严重眼损伤。
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，用 KOH 中和。每日新鲜配制。
来自Streptomyces sp的抗霉素 ASigma-AldrichA8674抗霉素 A。注意：急性毒性，急性水生毒性，慢性水生毒性。
储存条件：-20 °C
溶液配制：溶于无水乙醇中，于 -20 °C 保存。
N,N,N′,N′-四甲基-p-苯二胺Sigma-AldrichT7394TMPD
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，置于避光瓶中于  -20 °C 保存。
(+)-L-抗坏血酸钠Sigma-AldrichA4034抗坏血酸盐
储存条件：室温
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，置于避光瓶中于  -20 °C 保存。
NaN3Sigma-AldrichS2002叠氮化钠。注意：急性毒性（经口和经皮），特定靶器官毒性（脑），水生毒性，慢性水生毒性。 
溶液配制：溶于 MilliQ 水中，于 -20 °C 保存。

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