一种改进的多电子四极超光速引擎在行为大鼠大尺度神经记录中的构建

Summary

我们提出了一个3维可打印的超空间引擎的建设与十八独立调整 tetrodes。超光速引擎的目的是记录在数周内自由行为的老鼠的大脑活动。

Abstract

在清醒的动物中监测大量神经元的活动模式, 是系统神经科学领域的一项宝贵技术。该技术的一个关键组成部分是将多个电极精确放置到所需的脑区, 并维持其稳定性。在这里, 我们描述了一个构建3维可打印超空间引擎的协议, 其中包括十八个独立调整的 tetrodes, 专门针对在自由行为的大鼠体内的活体细胞外神经记录。附着在 microdrives 上的 tetrodes 可以单独推进到轨道上的多个脑区, 也可以用来将电极阵列放置到较小的区域。多重 tetrodes 允许同时检查许多单个神经元的动作电位, 以及在活动行为期间大脑神经元的局部磁场电位。此外, 该设计提供了更简单的3D 绘图软件, 可以很容易地修改不同的实验需要。

Introduction

在系统神经科学领域, 科学家研究了神经相关的认知过程, 如空间导航, 记忆和决策。对于这些类型的研究, 在动物行为过程中监测许多单个神经元的活动是至关重要的。在过去的几十年中, 已经取得了两个重要进展, 以满足小动物细胞外神经记录的实验需要^1,2,3。首先是开发的电子四极, 一捆四微丝用于记录神经元的神经^活动同时^1,2,4。电子四极四通道的活动的差分信号振幅允许从许多同时记录的单元^格5 中分离单个神经元活动。此外, 微丝的柔韧性使得电子四极的稳定性能够最大限度地减少电子四极与目标细胞种群之间的相对位移。Tetrodes 现在被广泛使用, 而不是一个单一的电极为许多脑研究在不同的物种, 包括啮齿目动物^1,2,6, 灵长类⁷, 昆虫⁸。其次是开发一个超空间引擎运载多个独立移动的 tetrodes, 它允许同时监测神经活动从大群神经元从多个记录位置^{3, 9,10,11,12}。

为小动物提供可靠和负担得起的多电子四极记录装置是有限的。经典的超空间引擎最初由布鲁斯诺顿¹³开发, 已成功用于在过去两年中在许多实验室中自由行为的老鼠的神经记录^{9,10,14, 15}. 但是, 由于技术原因, 构建诺顿驱动器所需的原始组件现在很难获得, 并且与最近改进的数据获取接口不兼容。另一个很好接受的超空间引擎设计要求 microdrives 单独手工制作, 这可能产生不一致的结果并消耗大量的时间¹²。为了记录大鼠不同脑区的神经活动, 我们利用 stereolithographic 技术开发了一种新的超光速引擎。我们寻求满足以下要求: (1) 新的超空间引擎必须允许精确的 tetrodes 在大脑中的位移, 并提供来自多个目标区域的稳定记录;(2) 新的超空间引擎必须与最近开发的磁 quickclip 系统兼容, 以便于方便连接;(3) 新的超光速引擎可以用容易获得的材料准确地再现。在这里, 我们提供了一个技术, 建立3维可打印的超空间引擎, 包含十八独立移动 tetrodes, 基于诺顿设计。在该协议中, 我们描述了新的超空间引擎的制造过程的细节, 我们已经成功地记录了 postrhinal 和内侧嗅皮层的单神经元动作电位和局部场电位, 在一周内自由地在自然觅食任务中的行为鼠。

Protocol

1. 3D 机型的光固化成形

1. 使用 stereolithographic 技术打印超空间引擎部件和配件。每个超空间引擎由十八梭、十八个梭螺栓和其他所有塑料件 (图 1) 组成。
   注: 附件不是超空间引擎的一部分, 但对于超空间引擎的建设是必要的。

2. 附件的准备工作 (图 2)。

1. microdrive 机架的准备工作(图 2C)。
   1. 在机架上用直径为0.71 毫米 (0.028 英寸) 钻头和直径为0.84 毫米 (0.033) 的钻头分别清洗并展开较小的通孔和较大的盲孔。
   2. 将直径为0.89 毫米 (0.035 英寸) 的焊条切成17毫米长段, 两端圆, 并将每个导杆插入机架上的ø0.84 毫米 (0.033 英寸) 孔, 在外侧留11.5 毫米 (用螺纹棒冲洗)。
   3. 完全插入六0-80 螺纹, 15.88 毫米 (5/8 英寸) 长扁头螺钉向下进入机架中的插槽。确保导杆和螺纹棒是直的和平行的。用稀释的牙科水泥填充插槽中的剩余空间。台式上的空气干燥15分钟。
   4. 将焊接棒和螺钉粘附在带薄的超胶机架上, 使空气干燥15分钟。
2. 核心站的准备工作(图 2E)。
   1. 螺纹四孔与2-56 水龙头, 并使用 2-56, 4.76 毫米 (3/16) 长尼龙螺钉, 以确保核心在车站, 如果必要的话。
3. 车削工具的准备(图 2F)。
   1. 用4-40 丝锥将手柄上的孔螺纹。将加工尖端插入手柄中的插槽中, 并使用4-40、4.76 mm (3/16 英寸) 长杯螺钉固定。
4. 超空间引擎持有者的准备(图 2G)。
   1. 用8-32 丝锥将螺钉孔螺纹。使用 8-32, 9.52 毫米 (3/8) 长尼龙拇指螺钉, 以确保在使用时的超空间引擎。
5. 杆定位复合体的准备(图 2H)。
   1. 螺纹的茎从一侧与较大的孔 (顶部) 与8-32 丝锥的深度约7毫米. 螺纹较小的孔 (六在顶部, 十八在底部) 与0-80 水龙头。如果需要, 在顶部用直径为4.76 毫米 (3/16 英寸) 的钻头展开中心孔。
   2. 将阀杆装配到顶部, 使用 8-32, 直径4.76 毫米 (3/16 英寸), 6.35 毫米 (1/4 英寸) 长肩螺钉。使用时, 用0-80、6.35 毫米 (1/4 英寸) 长螺钉将底部固定在顶部。

3. 超空间引擎组件的准备工作 (图 3)。

1. 超空间引擎螺母的准备(图 3A)。
   1. 使用螺母支架 (图 2D), 螺纹螺母与 3/8-24 底触点直到平滑。
2. 超空间引擎内核的组件(图 3B)。
   1. 用不同大小的钻头 (十二地线通孔 (内圈) 清洁和扩大芯孔: ø0.61 毫米 (0.024 英寸); 十八电子四极通孔 (中间圆环): ø0.66 毫米 (0.026) 首先, 然后ø0.71 毫米 (0.028); 十八导杆盲孔 (外环): ø0.84 毫米 (0.033 英寸))。
   2. 螺纹的两个通孔上的核心和其余的八个盲孔 (四的一侧, 四附近的底部) 与0-80 水龙头。在盲孔上使用触底水龙头。
   3. 使用 3/8-24 模具在核心底部创建外部线程。正确调整模具, 使超空间引擎螺母将适合新的线程。
   4. 根据所需地线的数量, 将多个6毫米长段的23口径金属管 (套管) 插入核心的地线孔中, 如有必要, 将其胶合。将地线套管的两端锉至与芯的外冲, 并用直径为0.30 毫米 (0.012) 的钢丝清洁套管。
   5. 完全插入十八 0-80, 15.88 毫米 (5/8 英寸) 长扁头螺钉头向下进入插槽中的核心。在此过程中, 请勿弯曲螺钉或损坏线程。
   6. 使用杆定位复合体和核心站, 位置十八17毫米段的ø0.89 毫米 (0.035) 焊条在导杆孔的核心, 并锤击下来, 以与螺丝冲洗 (约5毫米)。
   7. 如有必要, 纠正焊接棒和螺钉的位置, 然后拧紧中心肩螺钉和周围的六螺钉, 以确保杆在核心的向外方向。拧紧螺母上的核心 (与杆定位复杂), 并使核心进入超空间引擎的持有者, 以允许更容易地在立体镜下定位。
   8. 用稀释的牙科水泥填充插槽, 将螺钉固定在芯上, 并允许空气干燥15分钟. 在牙科水泥变厚之前, 一次填充2-3 个插槽。在核心上刮掉多余的牙科水泥, 以保持与盾牌的适当配合。
   9. 用薄的超级胶水将螺丝和棒粘到芯中, 使空气干燥15分钟。
3. microdrive 的程序集(图 3C)。
   1. 用钻头 (小孔: ø0.61 毫米 (0.024) 钻头; 较大的孔: ø0.89 毫米 (0.035 英寸) 钻头) 清洁和扩展航天飞机上的两个外孔。
   2. 将梭螺栓插入螺栓座底座。注意方向。关闭螺栓支架盖, 紧紧抓住, 并通过0-80 水龙头在盖子孔慢慢通过。点击2-3 次, 直到平滑。
   3. 用较小的开口将梭螺栓插入航天飞机一侧。将穿梭梭螺栓复合体倒在 microdrive 组装站基地。
   4. 切割15毫米段的23口径金属油管和平滑两端, 然后定位油管在ø0.61 毫米 (0.024) 孔, 引导由插槽上的车站盖子。把套管锤进洞里, 直到上端与车站盖齐平。
   5. 用磨砂轮移除套管上端的外半部。用直径为0.30 毫米 (0.012) 的金属丝清洗套管。用薄的超级胶水将套管粘到梭上, 确保不将梭螺栓粘在航天飞机上, 空气干燥15分钟。
   6. 准备至少十八 microdrives, 测试 microdrive 机架上的 microdrive。确保航天飞机的螺栓能在航天飞机中平稳旋转, 并且整个 microdrive 沿着螺纹杆的长度自由移动。
4. 中央列的准备(图 3D)。
   1. 将中心柱顶部和底部的沙子, 如果需要, 直到平坦。用0-80 分路器将中心柱上的两个孔螺纹。将0-80 个六角螺母 (3.18 毫米 (1/8 英寸) 宽, 1.19 毫米 (3/64 英寸) 高) 插入每个插槽中。
5. 超空间引擎盖的准备工作(图 3E)。
   1. 使用非磁性镊子, 将四磁铁 (直径3毫米, 1 毫米厚) 粘附到四井中, 将其与电极接口板上的 N 和 S 极相匹配。
6. 指南套管到捆绑包中的程序集(图 3F)。
   1. 放置十八30规, 薄壁套管 (ID 0.19 毫米, 0.0075 英寸) 到ø2.29 毫米 (0.09 英寸) 热收缩管 (3-5 毫米长, 间隔沿捆绑由5-10 毫米)。使所有套管在捆绑的一端彼此刷新。
   2. 使用热枪收缩热收缩管, 直到束紧。轻轻地挤压包裹, 按需要的形状 (圆形或椭圆形)。确认所有套管都处于正确的位置, 没有扭曲、交叉或弯曲。
   3. 标记在套管上焊接的区域。发起部分应长度为26毫米, 而焊接部分应为5-10 毫米. 将收缩管移至焊接标记以防止扩散。
   4. 在旋转捆绑包时, 将焊剂应用于一个焊锡区和焊料。室温下冷却至少1分钟. 重复此步骤, 将同一区域再焊两次。通过焊接, 不应用焊剂和填料材料, 平滑焊接部分。室温下冷却至少1分钟。
   5. 用金刚石砂轮以最高的速度切开捆绑到适当的长度, 擦亮两端调整长度 (发起部分:26 毫米, 被焊接的部分: 5-10 毫米根据需要)。用直径为0.18 毫米 (0.007) 的金属线在立体镜下清洁导轨套管。
7. 准备 tetrodes。类似的过程被描述为^8、16、17 。
   1. 调整水平 T 杆的高度和磁力搅拌器的位置, 使 t 杆的横臂位于磁搅拌器中心的正上方。将 S 钩的一端钩到一个小的磁力搅拌杆的中心, 然后将它们粘在一起。用压缩空气和乙醇湿巾清洁电子四极制造空间。
   2. 将一块单电子四极线的两端绕在一起40厘米长, 然后用一块铜胶带固定。
   3. 握住铜带, 提起钢丝圈。将末端与铜带相反放置在 T 条的水平臂上。轻轻地降低铜带 (而另一端仍在 t 栏上), 扭转一次, 并将铜胶带放到 t 栏上。电子四极圆现在在图八 ("∞") 配置与铜磁带坐在横杠的十字架之上。
   4. 用一只手轻轻握住 T 条上的铜胶带。用另一只手钩住 s 钩的自由端 (用磁力搅拌连接到另一端) 通过电子四极线圈的底部, 轻轻松开 s 钩, 让它通过 s 钩的重量理顺四导线。
   5. 调整水平杆的高度, 直到 S 钩的底部约1厘米以上的磁性搅拌器板的中心。
   6. 向下弯曲铜胶带的边缘以将其固定在水平条上。检查四直电子四极线的眼睛, 然后清除任何碎片。
   7. 打开搅拌器扭四导线在速度大约60转每分钟, 直到角度在二对面解开导线之间是关于。
   8. 将热枪设置为210摄氏度, 并加热扭曲的电线, 沿直线长度的电线从不同的角度, 以2分钟, 以熔化的 VG 债券涂层。
   9. 轻轻地提起 S 钩, 用细剪刀剪下电子四极的下端。
   10. 用手指把横杠上的铜胶带用剪刀把铜胶带两边的导线剪掉, 然后取下铜胶带。切断水平条上的剩余导线, 释放电子四极。
   11. 将已完成的电子四极放在无尘箱中存放。准备至少二十五 tetrodes。

4. 超空间引擎的装配 (图 4)。

1. 将指南套管插入超空间引擎核心 (图 4A)。
   1. 卸下热收缩管并将4毫米的硅管段 (ID 1.02 毫米 (0.04))、外径2.16 毫米 (0.085 英寸)) 沿捆绑到焊接/发起边框上。在超空间超空间中楔入缝隙以加宽中心孔, 允许间隔在硅管周围滑动。当垫片位于硅管中心时, 取下楔形。
   2. 通过将直径 0.18mm (0.007) 金属导线的长段 (10 厘米) 通过每个套管放置到超空间超空间中的一个特定电子四极孔中, 以防止该过程中的导线或套管的任何交叉, 从而将指南套管的位置组织在捆绑包中。弯曲两端的电线, 以保持他们到位。
   3. 把套管通过各自的孔在核心, 小心避免弯曲或跨越他们之间, 直到每个套管的自由端是至少2毫米外的电子四极孔的上端。把螺母拧到芯上, 小心防止垫片旋转, 以确保垫片的安全。将一滴非常稀的牙科水泥从核心的顶端放到套管的交界处, 以确保它们的相对位置。
   4. 从包的焊接端剪下导丝, 从自由端缩回, 从套管中取出。
2. 将 microdrives 装配到超空间引擎核心 (图 4B)。在超空间引擎中, microdrives 的详细空域安排以前被描述为^11,13。
   1. 将 microdrives 慢慢地和仔细地加载到核心的每个螺纹杆上。确认 (1) 23 口径 microdrive 套管顺利进入电子四极孔, (2) 30 口径导套管顺利进入23口径 microdrive 套管, (3) 梭螺栓沿螺纹杆平稳转动。把 microdrives 拧到 1.0-1.5 毫米以上的螺纹棒的下端。
   2. 切割十八片聚酰亚胺油管 (ID 0.11 毫米 (0.0045), 外径0.14 毫米 (0.0055 英寸)) 成38-43 毫米段 (导套管束长度加7毫米)。用直径为0.08 毫米 (0.003) 的钢丝清洗每管。
   3. 反转核心, 把聚酰亚胺管小心地插入到指南套管从焊接端, 并推动他们一路在立体镜下。将核心垂直翻转, 将聚酰亚胺管的上端粘附在 microdrive 套管上, 用厚的超级胶水。将核心倒置, 让胶水干15分钟。
   4. 在上端切下多余的聚酰亚胺油管, 在 microdrive 套管外留下 0.5-1.0 毫米。
3. 接地线的装配(图 4C)。
   1. 从涂层钢丝 (直径为0.20 毫米 (0.008 英寸)、裸直径0.13 毫米 (0.005 英寸)) 中切割所需长度为25-30 毫米的地线的数量。从导线的两个尖端剥离2毫米的塑料绝缘, 并将每个端插入到 6-8 mm 长30口径套管的两端。压扁套管的两端, 以确保连接到各自的导线上。
   2. 使用 Dremel 工具将套管切成两半, 以便从每条线上创建二个完整的地线。
   3. 将30口径套管的圆端插入核心的地线套管的上端, 并按下以使插入紧密。
4. 电极接口板的装配(图 4D)。
   1. 将中心柱插入核心, 并用两个0-80、7.94 毫米 (5/16 英寸) 长的套筒头螺钉固定。胶水如果需要, 使中心柱稳定的核心。
   2. 展开 EIB-72-QC-Large 板中插槽的部分, 该槽对应于中心柱上的两个丝锥孔, 直径为1.2 毫米。将电极接口板连接到中心柱上, 有两个0-80、3.97 毫米 (5/32 英寸) 长盘头螺钉。请确保主板位于中心, 并且安全。
5. 连接接地线(图 4E)。
   1. 在中心柱周围布线每根地线, 并将暴露的自由端连接到电极接口板上, 并在指定的接地孔上使用金针。
6. 将tetrodes 加载到超空间引擎中, 如前所述^16,17 。
   1. 将每个电子四极小心地装入 microdrives 的聚酰亚胺管中, 小心不要在过程中弯曲它们。
   2. 将自由端线轻轻地送进电极接口板中的指定孔中, 并用金针电连接。
   3. 将 tetrodes 单独剪切到适当的长度。确认在切割后 tetrodes 的部分从聚酰亚胺管的下端凸出是直的, 否则取代整个电子四极和裁。
7. 附上盾牌。
   1. 使用四 0-80, 3.97 毫米 (5/32 英寸) 的盘头螺钉将防护罩连接到核心。盾上的数字应该与电极接口板上的数字相匹配。
8. 电镀电子四极提示。
   1. 使用装有 ADPT-NZ-EIB-36 连接器和 ADPT-EIB-72-QC-HS-36 适配器¹⁷的 NanoZ 电镀设备 tetrodes 的提示。或者, 按照其他地方¹⁶中的说明, 手动将它们板成一个。使用前的电子四极提示(例如, 植入前一天), 因为阻抗将随着时间的推移逐渐增加电镀。更换在电镀过程中短路或受阻的 tetrodes, 将其剪成适当的长度, 再重新制版。
9. 完成超空间引擎的最终完成(图 4F)。
   1. 将 tetrodes 粘附到其聚酰亚胺管上, 如前所述¹⁶。收回所有他们回到他们的指南套管, 所以镀的提示不暴露。
   2. 螺丝四 0-80, 6.35 毫米 (1/4 英寸) 长套筒头螺钉进入四孔附近的超空间引擎核心。
   3. 使用立体镜, 慢慢降低每个电子四极, 直到电子四极尖端正上方的导向套管的边缘。同时, 在导套管束中定位每个电子四极的位置。电子四极的位置图是重建记录站点的关键。
   4. 将瓶盖连接到驱动器上, 并将超空间引擎正确存储在植入中。

Results

我们用一个新的超光速引擎来获得试验结果。该驱动器配备了 tetrodes 从ø17µm (0.0007), 聚酰亚胺涂层铂铱 (90%-10%) 线。tetrodes 的尖端被镀在铂黑溶液中, 以减少电极阻抗到100和 200 kΩ在1赫之间。超空间超空间被植入4.6 毫米左侧的中线和0.5 毫米前的横窦的头骨上的550克, 雄性长埃文斯鼠。另外的地线连接在小脑上的颅骨螺钉上。所有程序都是由贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的, 与以前描述的¹⁸类似。手术后立即植入, tetrodes 1 毫米进入大脑。随后几天, 使用了不超过80µm 的较小的高级增量。tetrodes 被允许稳定在每个推进以后至少20小时在神经录音被执行之前。

为了记录神经活动, 超空间引擎连接到一个 headstage 前置放大器 (Neuralynx, HS-72-QC), 后者被连接到一个数据采集系统与可...

Discussion

在这里, 我们描述了建设一个新开发的超空间引擎由十八独立移动 tetrodes 组成的过程。该驱动器可以通过在许多可用的硬件商店购买的负担得起的部件构建, 并与 stereolithographic 打印创建的组件结合使用。超空间超光速可以用标准的手术方法长期植入大鼠的头骨, 并且能够记录细胞外神经活动, 而动物则执行各种行为任务。

超空间引擎保留了原始诺顿超空间引擎的许多可取特性, 包括从驱动器中心¹³向外定向的三脚架 microdrives, 它为 tetrodes 提供了可靠的支持。一旦植入, 超空间引擎提供了一个清醒的动物的大脑内的 tetrodes 小运动的执行, 具有相当的精确度。一个在螺纹杆上的穿梭机的全轮对应于317.5 µm 的线性位移。通过适当的训练, 实验者可以在1/16 个回合步骤 (20 µm) 中推进航天飞机。我们设计的超空间引擎用于成年大鼠, 但驱动器可以很容易地用于任何动物的身体大小350克或更大 (受头部大小限制)。该装置的一个限制可能在记录的限制深度, 因为 tetrodes 沿螺纹棒的最大行程距离...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
焊条	Blue Demon	ER308L-035-01T	不锈钢，直径 0.035"
螺丝	McMaster	91771A060	不锈钢，平头，0-80 线程， 5/8"
长度	螺丝 麦克马斯特	91772A051	不锈钢，盘头，0-80 线程， 5/32" 长度
螺丝	McMaster	92196A056	不锈钢，内六角头，0-80 线程， 5/16" 长度
螺丝	McMaster	92196A055	不锈钢，内六角头，0-80 线程， 1/4"
长度螺丝	McMaster	95868A131	尼龙，插座头，2-56 线程， 3/16" 长度，黑色
螺帽	McMaster	90730A001	不锈钢，窄六角，  0-80 螺纹
肩部螺钉	McMaster	90298A213	不锈钢，8-32螺纹，直径3/16英寸，长度1/4英寸
杯螺钉	McMaster	92313A105	不锈钢，4-40螺纹，长度3/16
英寸 拇指螺钉	McMaster	94323A592	尼龙，8-32 线程， 3/8" 长度，黑色
磁铁	Apex	M3X1MMDI	钕，3 mm X 1 mm 圆盘
金属管	小零件	B00137QHNS	不锈钢，23 号，0.0253" 外径，0.013" 内径，0.006" 壁厚
金属管	New England 小管	定制不锈钢	，30 号，0.012/0.0125" 外径，0.007/0.008" 内径，全硬
热缩管	麦克马斯特	7856K72	收缩前内径 0.09 英寸，蓝色
硅胶管	A-M Systems	807300	0.040 英寸内径，0.085 英寸外径
聚酰亚胺管	A-M 系统	823400	0.0045 英寸内径，0.0005 英寸壁
接地线	A-M 系统	791500	0.005 英寸裸露、0.008 英寸涂层、半硬
四极合金丝	加利福尼亚细丝	定制	直径 0.0007 英寸，铂铱 （90%-10%），HML 和 VG 涂层
EIB	Neuralynx		EIB-72-QC-大
金针	Neuralynx		大 EIB 针
Tap	Balax	01302-000	M1.2 螺纹尺寸
水龙头	McMaster	2522A811	0-80 螺纹尺寸，底部
水龙头	McMaster	2522A771	0-80螺纹尺寸，插头
水龙头	麦克马斯特	26955A94	3/8"-24 螺纹尺寸，打底
水龙头	麦克马斯特	2522A713	2-56 螺纹尺寸
Tap	McMaster	2522A715	4-40 螺纹尺寸
Tap	McMaster	2522A718	8-32 螺纹尺寸
模具	麦克马斯特	2576A457	3/8"-24 螺纹尺寸，1" OD
钻头	McMaster	30585A82	线规 65， 直径0.035英寸
钻头	麦克马斯特	30585A83	线规 66， 直径0.033英寸
钻头	麦克马斯特	30585A87	线规 70， 直径0.028英寸
钻头	麦克马斯特	30585A88	线规 71， 直径0.026英寸
钻头	麦克马斯特	30585A91	线规 73， 直径0.024英寸
钻头	McMaster	8870A23	3/16" 直径
Dremel 盘	Wagner	31M	钻石涂层，直径 22 毫米，厚度 0.17 毫米
钢丝	精密品牌	21212	直径 0.012"，全硬
钢丝	精密品牌	21007	直径 0.007"，全硬
钢丝	A-M Systems	792700	直径 0.003"，半硬
Super胶水	Loctite	LT-40640	# 406
强力胶	Loctite	LT-41550	# 415
牙科丙烯酸粉	Teets	223-3773	珊瑚
牙科丙烯酸液体	Teets	223-4003