本实验方案描述了利用血流停滞模型诱导静脉血栓形成的操作步骤。此外，我们采用一种非侵入性方法，用于随时间测量血栓的形成与溶解过程。
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本文内容
摘要
摘要
静脉血栓是一种常见疾病，影响约1%至2%的人群，年发病率为每500人中1例。静脉血栓可因肺栓塞导致死亡，或引发血栓后综合征，表现为慢性腿部疼痛、肿胀和溃疡，也可导致慢性肺动脉高压，进而引起明显的慢性呼吸功能障碍。该病是心肌梗死和缺血性卒中之后最常见的心血管疾病，也是所有医学学科面临的临床挑战，因为它可能并发于癌症、系统性疾病、外科手术和重大创伤等其他疾病过程之中。
研究这些机制需要借助实验模型。静脉淤滞模型可诱导出大小一致的血栓，并产生可量化的血栓量。然而，必须系统性地结扎下腔静脉的侧支血管，以避免血栓大小的变异以及对数据的错误解读。我们已开发出一种利用超声成像测量血栓大小的非侵入性技术。通过该技术，可在同一动物体内随时间推移评估血栓的形成与消退过程。这种方法减少了为量化静脉血栓形成所需使用的实验小鼠数量，符合研究中动物使用“替代、减少和优化”（3R）原则。我们已证实，血栓重量及血栓大小的组织学分析结果与超声成像测量值具有良好的相关性。因此，本研究旨在描述如何利用下腔静脉淤滞模型在小鼠中诱导深静脉血栓形成，并介绍如何使用高频超声对其进行监测。
引言
静脉血栓栓塞症（VTE）包括深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞，是继心肌梗死和卒中之后心血管死亡的第三大原因。该病较为常见，影响约1%至2%的人群，年发病率约为每500人中1例1。VTE可导致：1）因肺栓塞而致死；2）血栓后综合征，表现为慢性腿部疼痛、肿胀和溃疡；或3）慢性肺动脉高压，进而引起显著的慢性呼吸功能障碍。VTE是一种多因素疾病，可能由血流淤滞、血管壁损伤和/或凝血与纤溶系统之间的平衡紊乱所导致的高凝状态引起，这一机制早在一百多年前由Virchow提出，被称为Virchow三要素（Virchow's Triad）。
由于大多数情况下无法获取人类深静脉血栓（DVT）样本，研究人员已开发出DVT的实验动物模型。已有多种动物被用于该研究，包括大鼠2、小鼠3、兔4、猪5、狗6和非人灵长类动物7。小鼠可进行基因修饰，是研究DVT最常用的动物。然而，与其他所有动物一样，小鼠不会自发形成DVT。因此，需通过物理或化学方法改变静脉壁以在小鼠体内诱导血栓形成。我们此前曾采用三氯化铁模型在小鼠下腔静脉（IVC）中诱导血栓形成
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方案
所有实验程序均经加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学机构动物护理委员会批准。所需全部设备列于表 I 中。
1. 小鼠（C57BL/6J）IVC 淤滞实验方案
- 手术准备
注意：本手术为可存活手术，因此必须始终遵循无菌操作技术。包括确保所有材料均已备齐，使用前后对器械进行清洁和灭菌，并在工作台面上划定一个无菌区域用于放置所有无菌物品。- 通过高压灭菌器对所有手术器械 和材料进行灭菌。若同时进行多个手术操作，玻璃珠灭菌器足以用于动物间器械尖端的灭菌。
- 使用100%氧气与2.5%异氟烷混合气体对8至10周龄的雄性C57Bl/6小鼠进行麻醉。
注意：根据需要调整氧气和异氟烷的流速。 - 用镊子夹住动物后肢脚趾之间的部位以确认麻醉状态。若无反应，则表明动物已处于麻醉状态。
- 通过皮下注射给予缓释镇痛药（丁丙诺啡），剂量为每1 kg体重给予1 mg镇痛药（1 mg/kg）。
- 在动物双眼上涂抹眼膏，以确保手术过程中角膜不会干燥。
- 按每10 g体重0.2–0.5 mL的剂量，皮下注射等渗液体。
- 使用手术胶带将动物固定在手术台上，使其呈仰卧位以暴露腹部。手术过程中应将动物置于加热垫上，防止低体温。
- 在小鼠腹部涂抹脱毛膏，持续1–2分钟....
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结果
静脉淤滞血栓形成模型
在淤滞模型中，小鼠被麻醉后，通过在小鼠左侧或右侧做切口暴露下腔静脉（IVC），而非采用腹中线剖腹术，以避免干扰超声探头。将腹肌和皮肤向两侧翻折以暴露下腔静脉（图1）。首先，使用6-0丝线结扎侧支血管（图2）。然后，通过钝性分离将下腔静脉与主动脉分开，并将丝线环绕下腔静脉（图3A-C）。使用6-0丝线结扎下腔静脉。结扎部位远端下腔静脉的扩张表明血流阻断成功（图3D）。最后，连续缝合腹膜腔和皮肤（图3E）。
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讨论
使用淤滞模型成功形成静脉血栓有几个关键步骤。由于下腔静脉和主动脉周围脂肪的积累，老年小鼠的静脉血栓诱导更具挑战性。理想情况下，接受该手术的小鼠应为8至10周龄。在钝性分离和结扎过程中，应格外小心，避免对下腔静脉（IVC）造成内皮损伤。此外，手术后必须将动物置于34 °C的培养箱中至少30分钟，并且仅在动物完全恢复后才将其放回其他动物群体中。 若手术操作正确，动物在术后护理期间表现良好，无严重副作用，如跛行、轻瘫或大小便失禁。手术后动物可能出现活动减少和轻微弓背姿势，但只要镇痛有效且手术操作得当，这种情况并不常见。
血流停滞模型可产生大小可重复的大型血栓。与人类相似，小鼠静脉系统的解剖结构存在个体差异，近期研究已针对深静脉血栓形成（DVT）的狭窄模型和血流停滞模型中下腔静脉分支阻断的问题进行了探讨。13,14. Brandt 等 表明当侧支位于受限血流区域时，可防止由血流受限诱导的血栓形成 <下腔静脉结扎部位远端1.5 mm处。然而.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由加拿大心脏与卒中基金会以及莫里斯和贝拉·法因曼家族基金会的资助支持。作者感谢维罗尼卡·米肖在使用VEVO770超声成像系统过程中提供的技术帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6-0 永久手缝丝线 | Ethicon | 706G | |
| 手术剪 | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| 打结镊 | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| 钝头镊（直头和弯头） | Fine Science Tools | 20830-00 | |
| 持针器 | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Moria 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| 1 ml 注射器 | BD Biosciences | ||
| 26G 针头 | Becton Dickinson & Co. | ||
| VEVO 770 高分辨率成像系统 | Visualsonics | 已停售 | |
| 缓释布托啡诺 | ZooPharm | 由兽医给予 LDI | |
| 手术显微镜 | Leica | Leica M651 | |
| Systan 眼药膏 | Alcon | 288/28062-0 | |
| 2×2 无菌纱布 | CDMV | #104148 | |
| 棉签 | 来自 JGH | ||
| 透气性低致敏外科胶带 | CDMV | #7411 | |
| 超声耦合剂（Aquasonic-100） | Dufort & Lavigne | #AKEN4061 | |
| 培养箱 | 来自 JGH | ||
| 异氟烷 | Dispomed | ||
| 麻醉室、管路及给药设备 | Dispomed | ||
| 脱毛剂 | Nair | ||
| 水循环加热硬垫 | Braintree Scientific, Inc. | #HHP-2 | |
| Gaymar 加热器水泵 TP500 | MATVET Inc. | #R-500305 | |
| 红外加热灯 | electrimat inc. | #1R175R-PAR | |
| 小鼠直肠温度探头 | emkaTECHNOLOGIES | ||
| 无菌水 | 来自 JGH |
参考文献
- Fowkes, F. J., Price, J. F., Fowkes, F. G. Incidence of diagnosed deep vein thrombosis in the general population: systematic review. Eur J Vasc Endovasc Surg. 25 (1), 1-5 (2003).
- McGuinness, C. L., et al. Recruitment of labelled monocytes b....
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重印与许可
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