在模式植物物种Arabidopsis thaliana上进行了一项针对合成小分子的高通量筛选。该实验方案专为液体处理机器人开发，可提高正向化学遗传学筛选的速度，加快发现影响植物生理学的新型小分子。
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摘要
摘要
化学遗传学正越来越多地被用于解析植物中可能因基因冗余或致死性而难以通过传统遗传学方法研究的性状。然而，合成小分子具有生物活性的概率较低，因此必须测试成千上万种分子才能筛选出感兴趣的化合物。液体处理机器人系统能够处理大量样品，不仅加快了化合物文库的筛选速度，还最大限度地减少或标准化了操作误差。为了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现对包含50,000种小分子的文库进行高通量正向化学遗传学筛选，研究人员开发了基于台式多通道液体处理机器人的实验方案，该方案几乎无需技术人员过多干预。利用这些方案，共发现3,271种引起明显表型变化的小分子：其中1,563种化合物诱导根长变短，1,148种化合物导致颜色改变，383种化合物引起根毛及其他未归类的形态变化，另有177种化合物抑制种子萌发。
引言
在过去20年中，植物生物学领域的研究人员在正向和反向化学遗传学方法的应用方面取得了巨大进展，加深了我们对细胞壁生物合成、细胞骨架、激素生物合成与信号传导、向重力性、致病过程、嘌呤生物合成以及内膜系统运输等过程的理解1,2,3,4,5。采用正向化学遗传学技术能够鉴定出感兴趣的表型，帮助研究人员理解特定生物学过程背后的基因型基础。相反，反向化学遗传学则旨在寻找能够与预先确定的蛋白质靶标相互作用的化合物6。拟南芥（*Arabidopsis*）在植物生物学的这些发现中处于领先地位，因其基因组较小，且已被测序和注释完整，具有较短的世代周期，同时存在多种突变体和报告基因品系，有助于识别异常的亚细胞机制7。
正向化学遗传筛选的进展主要受到两个关键瓶颈的限制：初始筛选过程以及确定感兴趣化合物的作用靶点8。加快小分子筛选速度的重要手段之一是使用自动化系统和自动化设备9。液体处理机器人....
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方案
1. 构建稀释文库
- 手动标记625个稀释文库板，确保它们与化学文库中的对应板相匹配。此外，将进液和出液软管穿过控制台驱动器连接至5加仑储液罐上的多通道吸头清洗自动耗材定位器（ALP）（参见材料表）。
- 访问计算机，并通过设备控制器连接多通道吸头清洗ALP，启动清洗泵以循环水。此步骤将在方案结束时自动关闭。
- 手动将堆叠器10（Stacker 10）装载到堆叠器转盘（Stacker Carousel）上，按以下顺序放入A-D区的存放位（图4，堆叠器）：在1号位放置一盒AP96 P20吸头，在2-5号位各放置四个96孔V型底板，其中上方两个板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个 板为空板（图5，堆叠器）。此外，在6号位放置一盒AP96 P20吸头，在7-9号位放置四个96孔V型底板，其中上方两个 板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个板为空板（图5，堆叠器）。
- 手动设置工作台：在P3位置放置一个300 mL水储液罐，在P7位置放置一个300 mL 70%乙醇浴，以及Tip Loader ALP（TL1）和多通道吸头清洗ALP（TW1）（图4，工作台 和
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结果
基于在解剖显微镜下以筛选浓度添加小分子，从而准确、高效地鉴定表型，是本拟南芥正向化学遗传学方法的最终目标。 在完成全部50,000种化合物的筛选后，所观察到的表型具有多样性，可划分为若干明显不同的类别（图2）。图3A-F展示了在解剖显微镜下低倍率观察到的部分表型实例。某些表型结果不明确（图3G、H），需在更低浓度下重新测试，以确认该化合物在较低剂量下是否产生不同的表型。
结果不佳可能由多种原因导致。其中之一是种子萌发率低，这可能导致筛选平板中主要出现不萌发或萌发不完全的表型（图3G，H），从而造成误.......
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讨论
本实验方案旨在帮助研究人员在拟南芥中开展正向化学遗传学筛选。我们提供了一项针对50,000种化合物的筛选所获得的代表性结果（图2 和 图3），这是迄今为止在拟南芥中进行的规模最大的正向化学遗传学筛选之一9,13,23。通过使用液体处理机器人，可更高效地完成稀释文库和筛选文库的制备，从而提高新化合物鉴定的速度与效率。高通量筛选能力的提升，同时减少了研究人员所需投入的人力。本技术设计用于96孔板，适用于在体视显微镜下可观察的小种子或小型植株。若使用孔径更大的培养板以容纳较大种子，则需对通量和实验设计进行相应调整。
该技术的其他局限性包括难以将此设备与无菌操作技术结合使用；然而，由于½ MS培养基不含蔗糖，我们并未遇到较高的污染率。可以通过将机器人置于无菌室中，以实现无菌环境和细胞培养.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Jozsef Stork、Mitchel Richmond、Jarrad Gollihue 和 Andrea Sanchez 提供的建设性与批判性讨论。感谢 Sharyn Perry 博士提供表型照片。本研究工作基于美国国家科学基金会资助的协作协议第 1355438 号支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 键盘 | 本地供应商 | N/A | 用于设计实验方案及操作 Biomek FX |
| 鼠标 | 本地供应商 | N/A | 用于设计实验方案及操作 Biomek FX |
| 计算机显示器 | 本地供应商 | N/A | 用于设计实验方案及操作 Biomek FX |
| 计算机 | 本地供应商 | N/A | 用于设计实验方案及操作 Biomek FX |
| DIVERSet 多样性筛选文库 | ChemBridge | N/A | 化学文库 |
| Biomek 软件 | Beckman Coulter | N/A | 运行并设计 Biomek FX 操作流程 |
| 设备控制器 | Beckman Coulter | 719366 | 操作水泵/吸头清洗站 |
| 堆垛转盘吊坠 | Beckman Coulter | 148240 | 手动操作 Biomek 堆垛转盘 |
| Biomek 堆垛转盘 | Beckman Coulter | 148520 | 容纳所有 FX 堆垛器 10 的旋转单元 |
| FX 堆垛器 10 | Beckman Coulter | 148522 | 容纳筛选实验组件的升降单元 |
| FX 堆垛器 10 | Beckman Coulter | 148522 | 容纳筛选实验组件的升降单元 |
| FX 堆垛器 10 | Beckman Coulter | 148522 | 容纳筛选实验组件的升降单元 |
| FX 堆垛器 10 | Beckman Coulter | 148522 | 容纳筛选实验组件的升降单元 |
| Biomek FX | Beckman Coulter | https://www.beckman.com/liquid-handlers | 执行所需操作的自动化机器人 |
| Accuframe | Artisan Technology Group | 76853-4 | 固定机械臂以准确定位组件 |
| 定位夹具 | Beckman Coulter | 719415 | 在 Accuframe 中对准机械臂中心 |
| 多通道吸头清洗 ALP | Beckman Coulter | 719662 | 在乙醇浴后清洗吸头 |
| 吸头装载 ALP | Beckman Coulter | 719356 | 通过气动方式将吸头装载到机械臂上 |
| 空气压缩机 | 本地供应商 | N/A | 为气动吸头装载提供压缩空气 |
| MasterFlex 控制台驱动器 | Cole-Parmer | 77200-65 | 用于循环水通过多通道吸头清洗器的泵 |
| 气管 | 本地供应商 | N/A | 将空气从空气压缩机输送至吸头装载器 |
| 水管 | 本地供应商 | N/A | 将水从 5 加仑储水桶输送至吸头清洗器 |
| 静态 ALP | Beckman Coulter | 随 Biomek FX 提供 | 支撑筛选实验所需设备 |
| 5 加仑储水桶 | 本地供应商 | N/A | 循环清洗吸头后的脏水 |
| 夹持器 | Beckman Coulter | 随 Biomek FX 提供 | 抓取并移动设备至正确位置 |
| 96 通道 200 µL 头 | Beckman Coulter | 随 Biomek FX 提供 | 容纳筛选实验中使用的 96 个吸头 |
| AP96 P200 移液吸头 | Beckman Coulter | 717251 | 用于构建筛选文库 |
| 96 孔平底板 | Costar | 9018 | 辅助筛选实验的可视化观察 |
| 96 孔 V 形底板 | Costar | 3897 | 辅助稀释文库的储存 |
| AlumaSeal 96 密封膜 | MedSci | F-96-100 | 用于化学文库和稀释文库储存时的密封 |
| 塑料自封袋（三明治袋） | 本地供应商 | N/A | 用于确保筛选实验的高湿度环境 |
| AP96 P20 移液吸头 | Beckman Coulter | 717254 | 用于构建稀释文库 |
| 生长培养箱 | Percival | AR36L3 | 用于种子萌发以进行表型观察 |
| 刮铲 | 本地供应商 | N/A | 用于承载种子，补充液体点种未能成功落种的孔位 |
| 牙签 | 本地供应商 | N/A | 将种子从刮铲推入孔板中 |
| Murashige 和 Skoog 基础盐混合物 | PhytoTechnology Laboratories | M524 | 添加至 MS 培养基混合物中 |
| MES 自由酸一水合物 | Fisher Scientific | ICN19483580 | 添加至 MS 培养基中以降低 pH 值 |
| 琼脂粉 | Alfa Aesar | 9002-18-0 | 增加培养基黏度以支撑种子悬浮 |
| 5M KOH | Sigma-Aldrich | 484016 | 将 pH 值提升至适宜水平 |
| 1L 培养基储存瓶 | Corning | 1395-1L | 容纳一次筛选实验所需的培养基量 |
| 聚丙烯离心管 | Corning | 431470 | 在春化处理前对种子进行灭菌 |
| pH 探针 | Davis Instruments | YX-58825-26 | 用于配制培养基 |
| ALP（自动化实验耗材定位器）用户手册 | Beckman Coulter | PN 987836 | 辅助设置 Biomek FX 的配套设备 |
| Biomek 2000 堆垛转盘用户指南 | Beckman Coulter | 609862-AA | 辅助设置堆垛转盘 |
| Biomek FX 和 FXP 实验室自动化工作站用户手册 | Beckman Coulter | PN 987834 | 用于固定多通道模块 |
| Biomek FXP 实验室自动化工作站客户启动指南 | Beckman Coulter | PN B32335AB | 辅助设置 Biomek FX |
| Biomek 软件用户手册 | Beckman Coulter | PN 987835 | 用于设置并理解软件操作 |
参考文献
- Blackwell, H. E., Zhao, Y. Chemical genetic approaches to plant biology. Plant Physiol. 133 (2), 448-455 (2003).
- Dejonghe, W., Russinova, E. Plant chemical genetics: From phenotype-based screens to synthetic biology. Plant Physiol. 174 (1), 5-20 (2017).
- Mc....
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