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方法文章

优化利用液体处理机器人对拟南芥（Arabidopsis thaliana）进行高通量正向化学生物学筛选

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DOI：

10.3791/57393

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2018年4月30日

 ,  , 
1Department of Horticulture, University of Kentucky

本文内容

摘要

在模式植物物种Arabidopsis thaliana上进行了一项针对合成小分子的高通量筛选。该实验方案专为液体处理机器人开发，可提高正向化学遗传学筛选的速度，加快发现影响植物生理学的新型小分子。

摘要

化学遗传学正越来越多地被用于解析植物中可能因基因冗余或致死性而难以通过传统遗传学方法研究的性状。然而，合成小分子具有生物活性的概率较低，因此必须测试成千上万种分子才能筛选出感兴趣的化合物。液体处理机器人系统能够处理大量样品，不仅加快了化合物文库的筛选速度，还最大限度地减少或标准化了操作误差。为了在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中实现对包含50,000种小分子的文库进行高通量正向化学遗传学筛选，研究人员开发了基于台式多通道液体处理机器人的实验方案，该方案几乎无需技术人员过多干预。利用这些方案，共发现3,271种引起明显表型变化的小分子：其中1,563种化合物诱导根长变短，1,148种化合物导致颜色改变，383种化合物引起根毛及其他未归类的形态变化，另有177种化合物抑制种子萌发。

引言

在过去20年中，植物生物学领域的研究人员在正向和反向化学遗传学方法的应用方面取得了巨大进展，加深了我们对细胞壁生物合成、细胞骨架、激素生物合成与信号传导、向重力性、致病过程、嘌呤生物合成以及内膜系统运输等过程的理解1,2,3,4,5。采用正向化学遗传学技术能够鉴定出感兴趣的表型，帮助研究人员理解特定生物学过程背后的基因型基础。相反，反向化学遗传学则旨在寻找能够与预先确定的蛋白质靶标相互作用的化合物6。拟南芥（*Arabidopsis*）在植物生物学的这些发现中处于领先地位，因其基因组较小，且已被测序和注释完整，具有较短的世代周期，同时存在多种突变体和报告基因品系，有助于识别异常的亚细胞机制7。

正向化学遗传筛选的进展主要受到两个关键瓶颈的限制：初始筛选过程以及确定感兴趣化合物的作用靶点8。加快小分子筛选速度的重要手段之一是使用自动化系统和自动化设备9。液体处理机器人是处理大量小分子文库的有力工具，在推动生命科学领域的发展中发挥了重要作用10。本文所介绍的方案旨在缓解与筛选过程相关的瓶颈问题，从而能够快速鉴定出具有生物活性的小分子。该技术减轻了操作人员的劳动强度和时间成本，同时也降低了课题负责人的经济投入。

迄今为止，已分析的大多数化合物库包含 10,000 至 20,000 种化合物，部分库多达 150,000 种，也有少至 70 种的9,11,12,13,14,15,16。本文所介绍的方案应用于一个包含 50,000 种小分子的化合物库（见材料表），是目前在拟南芥中开展的规模较大的正向化学生物学筛选之一。该方案符合当前正向化学生物学领域追求更高效率与速度的发展趋势，尤其适用于除草剂、杀虫剂、杀菌剂、药物发现以及癌症生物学研究17,18,19,20,21。尽管本方案以拟南芥为实验材料，但其可轻松拓展至细胞培养、孢子，甚至在 96、384 或 1536 孔板中的液体培养基内进行昆虫实验。由于拟南芥植株体型较小，适合在 96 孔板中进行筛选。然而，将种子均匀分配至各孔仍具挑战性。人工点种虽准确但耗时耗力，尽管已有专为向 96 孔板分配种子而设计的设备，但购置成本较高。本文展示了如何以极小的准确性损失规避此步骤。

该方法的总体目标是在不降低准确性的前提下，使针对拟南芥的大规模化合物库筛选更加易于操作。 通过 使用液体处理机器人。该方法通过缩短完成初始稀释系列管理和后续表型筛选所需的时间，提高研究人员的工作效率，实现解剖显微镜下对样品的快速观察，并快速鉴定新型生物活性小分子。 图1 以4个步骤展示本方案的关键结果。

化学筛选工作流程图：文库稀释、板制备、孵育、可视化。
图1：正向化学遗传学筛选的整体工作流程。 本文将概述即将描述的实验方案，并对其中4个关键步骤进行简要说明：1：接收化合物文库，2：制备稀释文库，3：制备筛选板，以及4：孵育并观察筛选板。 请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 构建稀释文库

  1. 手动标记625个稀释文库板，确保它们与化学文库中的对应板相匹配。此外，将进液和出液软管穿过控制台驱动器连接至5加仑储液罐上的多通道吸头清洗自动耗材定位器（ALP）（参见材料表）。
  2. 访问计算机，并通过设备控制器连接多通道吸头清洗ALP，启动清洗泵以循环水。此步骤将在方案结束时自动关闭。
  3. 手动将堆叠器10（Stacker 10）装载到堆叠器转盘（Stacker Carousel）上，按以下顺序放入A-D区的存放位（图4，堆叠器）：在1号位放置一盒AP96 P20吸头，在2-5号位各放置四个96孔V型底板，其中上方两个板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个 板为空板（图5，堆叠器）。此外，在6号位放置一盒AP96 P20吸头，在7-9号位放置四个96孔V型底板，其中上方两个 板包含订购文库的储备浓度溶液，下方两个板为空板（图5，堆叠器）。
  4. 手动设置工作台：在P3位置放置一个300 mL水储液罐，在P7位置放置一个300 mL 70%乙醇浴，以及Tip Loader ALP（TL1）和多通道吸头清洗ALP（TW1）（图4，工作台 和 图5，工作台）。
  5. 使用操作软件，从堆叠器10中取出AP96 P20吸头，并将其移至Tip Loader ALP。
    注意：步骤1.5至1.12均通过液体处理机器人的操作软件完成；参见材料表。
  6. 取出A区2号位的板，并将全部四个96孔V型底板分开放置于工作台上，将底部两个板分别置于P4和P8位置，顶部两个板分别置于P5和P9位置（图4）。
  7. 使用Tip Loader ALP将AP96 P20吸头装载到96通道200 µL移液头。从300 mL水储液罐中吸取90 µL水，并分配至P4位置的96孔V型底稀释板中。对P8位置的板重复此步骤。
  8. 通过反复吸取和分配15 µL溶液三次，混合P5位置的化学文库板 。此外，从P5位置的化学文库板 中吸取10 µL，并将10 µL分配至P4位置的稀释板中。
  9. 通过反复吸取和分配50 µL溶液共三次，混合P4位置板 中的溶液。混合完成后，使用P7中的70%乙醇吸取并分配70 µL以清洗AP96 P20吸头，然后在多通道吸头清洗ALP中通过吸取和分配110%体积的水四次进行冲洗。
  10. 对P8和P9位置的第二对板重复步骤1.8–1.9。在制备第二个96孔V型底稀释板后，按从下至上的顺序堆叠板：P9、P5、P8和P4。然后将该堆叠放置在一个空的静态ALP上；可选P1、P2、P6、P10、P11、P12或P13中的任意一个位置。
  11. 重复步骤1.6–1.10，直到A区5号位清空。当进行到6号位时，重复步骤1.5，将新的AP96 P20吸头移至Tip Loader ALP，并将使用过的AP96 P20吸头放置在一个空的静态ALP上。
  12. 重复步骤1.6–1.10，直到A区9号位清空。然而，若要进入B区，必须先将工作台上的板和吸头重新装回A区。
  13. 手动重新加满300 mL水储液罐。此步骤至关重要，计算机程序可设置暂停提示此信息，要求用户点击“继续”后方可执行下一步。
  14. 对剩余各区重复步骤1.5–1.13，确保每次进入下一个区之前水储液罐均为满的300 mL。

2. 将培养基-种子混合物加入筛选板

  1. 通过将 4.3 g MS 盐、0.50 g MES 和 1.0 g 琼脂加入 1 L 去离子 H2O 中，配制含 0.1% 琼脂的 ½ Murashige 和 Skoog (MS) 培养基。在 pH 探针监测下，加入 5 M 氢氧化钾调节 pH 至 5.7。
  2. 将种子在含 1% 次氯酸钠和 SDS 的溶液中振荡 15 至 30 分钟进行灭菌，随后通过离心用等体积水清洗 4 次。种子灭菌后，置于 4 °C 条件下 24 小时至 7 天以完成春化处理。拟南芥生物资源中心（Arabidopsis Biological Resource Center）提供了其他灭菌、春化及培养方法22。
  3. 以 0.1 g/100 mL 的密度手工将种子接种至培养基中。该密度可使每块 96 孔板的每个孔中平均分布 3 - 10 粒种子。
  4. 手工将四块 96 孔平底板分别放入 A 酒店的 1 号和 2 号房间（图 6，A 酒店）。在 Tip Loader ALP 上放置一盒 AP96 P250 吸头，在 P3 位置放置一个装有步骤 2.1 - 2.3 制备的培养基-种子混合液的 300 mL 储液槽，在 P7 位置放置一个装有 70% 乙醇的 300 mL 储液槽（图 4，工作台面 和 图 6，工作台面）。
    注意：步骤 2.5 至 2.8 需使用操作软件完成。
  5. 在软件中调出 A 酒店的 1 号和 2 号房间，并分离四叠板堆。将每块板分别放置于空的静态 ALP（P4、P5、P6、P8、P9、P10、P11 和 P12）上。在 96 通道 200 µL 移液头装载 AP96 P250 吸头。
  6. 从 P3 位置的 300 mL 培养基-种子储液槽中吸取 90 µL，加入第一块 96 孔平底板中。重复此操作，直至全部八块板均加入培养基-种子混合液。
  7. 通过从 P7 位置装有 70% 乙醇的 300 mL 储液槽中吸取并排出 70 µL 溶液，对 AP96 P250 吸头进行清洗。随后在多通道吸头清洗 ALP 中，用 110% 体积的水吸取并排出四次以洗涤吸头，在 TL1 卸载吸头，并手工收集各培养板。

3. 向筛选板中添加小分子

  1. 手动将一盒 AP96 P250 吸头放入 A 酒店 1 号房间，将两个 96 孔 V 型底稀释文库板分别放入 2、4、6 和 8 号房间，将两个 96 孔平底筛选板分别放入 3、5、7 和 9 号房间（图 4，堆叠器和 图 7，A 酒店）。此外，将多通道吸头清洗 ALP 的进出软管连接至 5 加仑储液罐。
    注意：步骤 3.2 至 3.10 通过操作软件完成。
  2. 配置工作台，在 P7 位置放置一个 300 mL 的 70% 乙醇清洗储液罐；培养基-种子储液罐可保留在 P3 位置的工作台上（图 4，工作台和 图 7，工作台）。此外，通过连接设备控制器启动控制台驱动，使水在多通道吸头清洗 ALP 中循环。该系统将在程序结束时自动关闭。
  3. 从 A 酒店取出 AP96 P250 吸头盒，并将其移至吸头装载 ALP。
  4. 将 A 酒店 2 号房间的 96 孔 V 型底稀释文库板送至工作台，分别放置于静态 ALP 的 P4 和 P8 位置。将 A 酒店 3 号房间的 96 孔平底筛选板送至工作台，分别放置于静态 ALP 的 P5 和 P9 位置。
  5. 使用吸头装载 ALP 将 AP96 P250 吸头加载到 96 通道 200 µL 移液头。
  6. 通过反复吸取和分配 50 µL 溶液三次，混合 P4 位置的 96 孔 V 型底稀释板中的溶液。随后，从此板中吸取 10 µL 溶液并分配至 P5 位置的 96 孔平底筛选板中。
  7. 通过反复吸取和分配 50 µL 溶液三次，混合 P5 位置筛选板中的溶液。使用乙醇清洗 AP96 P250 吸头：从 P7 位置的储液罐中吸取并分配 70 µL 的 70% 乙醇，然后在多通道吸头清洗 ALP 中通过反复吸取和分配 110% 体积的水四次来清洗吸头。
  8. 对第二个 96 孔 V 型底稀释文库板（P8）和 96 孔平底筛选板（P9）重复步骤 3.5 和 3.6。
  9. 将两个 96 孔 V 型底稀释文库板叠放在一起，两个 96 孔平底筛选板也叠放在一起。将这些板移至静态 ALP 的 P1、P2、P6、P10、P11、P12 或 P13 位置。
  10. 重复步骤 3.4 至 3.9 三次，共向筛选板中添加稀释后的化学品八次。最后，通过目视确认检查筛选板中每个孔内的种子数量，并对少于三粒种子的孔补充经过灭菌和春化的额外种子。

4. 筛选平板的孵育与显色

  1. 将96孔平底筛选板置于22 °C的环境培养箱中，在防干燥容器内以16/8小时光照/黑暗循环培养四天。在解剖显微镜下观察96孔平底筛选板。记录所有异常表型以供进一步研究。

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结果

基于在解剖显微镜下以筛选浓度添加小分子，从而准确、高效地鉴定表型，是本拟南芥正向化学遗传学方法的最终目标。 在完成全部50,000种化合物的筛选后，所观察到的表型具有多样性，可划分为若干明显不同的类别（图2）。图3A-F展示了在解剖显微镜下低倍率观察到的部分表型实例。某些表型结果不明确（图3G、H），需在更低浓度下重新测试，以确认该化合物在较低剂量下是否产生不同的表型。

结果不佳可能由多种原因导致。其中之一是种子萌发率低，这可能导致筛选平板中主要出现不萌发或萌发不完全的表型（图3G，H），从而造成误...

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讨论

本实验方案旨在帮助研究人员在拟南芥中开展正向化学遗传学筛选。我们提供了一项针对50,000种化合物的筛选所获得的代表性结果（图2 和 图3），这是迄今为止在拟南芥中进行的规模最大的正向化学遗传学筛选之一9,13,23。通过使用液体处理机器人，可更高效地完成稀释文库和筛选文库的制备，从而提高新化合物鉴定的速度与效率。高通量筛选能力的提升，同时减少了研究人员所需投入的人力。本技术设计用于96孔板，适用于在体视显微镜下可观察的小种子或小型植株。若使用孔径更大的培养板以容纳较大种子，则需对通量和实验设计进行相应调整。

该技术的其他局限性包括难以将此设备与无菌操作技术结合使用；然而，由于½ MS培养基不含蔗糖，我们并未遇到较高的污染率。可以通过将机器人置于无菌室中，以实现无菌环境和细胞培养...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 Jozsef Stork、Mitchel Richmond、Jarrad Gollihue 和 Andrea Sanchez 提供的建设性与批判性讨论。感谢 Sharyn Perry 博士提供表型照片。本研究工作基于美国国家科学基金会资助的协作协议第 1355438 号支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
键盘本地供应商N/A用于设计实验方案及操作 Biomek FX
鼠标本地供应商N/A用于设计实验方案及操作 Biomek FX
计算机显示器本地供应商N/A用于设计实验方案及操作 Biomek FX
计算机本地供应商N/A用于设计实验方案及操作 Biomek FX
DIVERSet 多样性筛选文库ChemBridgeN/A化学文库
Biomek 软件Beckman CoulterN/A运行并设计 Biomek FX 操作流程
设备控制器Beckman Coulter719366操作水泵/吸头清洗站
堆垛转盘吊坠Beckman Coulter148240手动操作 Biomek 堆垛转盘
Biomek 堆垛转盘Beckman Coulter148520容纳所有 FX 堆垛器 10 的旋转单元
FX 堆垛器 10Beckman Coulter148522容纳筛选实验组件的升降单元
FX 堆垛器 10Beckman Coulter148522容纳筛选实验组件的升降单元
FX 堆垛器 10Beckman Coulter148522容纳筛选实验组件的升降单元
FX 堆垛器 10Beckman Coulter148522容纳筛选实验组件的升降单元
Biomek FXBeckman Coulterhttps://www.beckman.com/liquid-handlers执行所需操作的自动化机器人
AccuframeArtisan Technology Group76853-4固定机械臂以准确定位组件
定位夹具Beckman Coulter719415在 Accuframe 中对准机械臂中心
多通道吸头清洗 ALPBeckman Coulter719662在乙醇浴后清洗吸头
吸头装载 ALPBeckman Coulter719356通过气动方式将吸头装载到机械臂上
空气压缩机本地供应商N/A为气动吸头装载提供压缩空气
MasterFlex 控制台驱动器Cole-Parmer77200-65用于循环水通过多通道吸头清洗器的泵
气管本地供应商N/A将空气从空气压缩机输送至吸头装载器
水管本地供应商N/A将水从 5 加仑储水桶输送至吸头清洗器
静态 ALPBeckman Coulter随 Biomek FX 提供支撑筛选实验所需设备
5 加仑储水桶本地供应商N/A循环清洗吸头后的脏水
夹持器Beckman Coulter随 Biomek FX 提供抓取并移动设备至正确位置
96 通道 200 µL 头Beckman Coulter随 Biomek FX 提供容纳筛选实验中使用的 96 个吸头
AP96 P200 移液吸头Beckman Coulter717251用于构建筛选文库
96 孔平底板Costar9018辅助筛选实验的可视化观察
96 孔 V 形底板Costar3897辅助稀释文库的储存
AlumaSeal 96 密封膜MedSciF-96-100用于化学文库和稀释文库储存时的密封
塑料自封袋（三明治袋）本地供应商N/A用于确保筛选实验的高湿度环境
AP96 P20 移液吸头Beckman Coulter717254用于构建稀释文库
生长培养箱PercivalAR36L3用于种子萌发以进行表型观察
刮铲本地供应商N/A用于承载种子，补充液体点种未能成功落种的孔位
牙签本地供应商N/A将种子从刮铲推入孔板中
Murashige 和 Skoog 基础盐混合物PhytoTechnology LaboratoriesM524添加至 MS 培养基混合物中
MES 自由酸一水合物Fisher ScientificICN19483580添加至 MS 培养基中以降低 pH 值
琼脂粉Alfa Aesar9002-18-0增加培养基黏度以支撑种子悬浮
5M KOHSigma-Aldrich484016将 pH 值提升至适宜水平
1L 培养基储存瓶Corning1395-1L容纳一次筛选实验所需的培养基量
聚丙烯离心管Corning431470在春化处理前对种子进行灭菌
pH 探针Davis InstrumentsYX-58825-26用于配制培养基
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Biomek FXP 实验室自动化工作站客户启动指南Beckman CoulterPN B32335AB辅助设置 Biomek FX
Biomek 软件用户手册Beckman CoulterPN 987835用于设置并理解软件操作

参考文献

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