虹膜新生血管是缺血性视网膜疾病的常见并发症，可能导致威胁视力的新生血管性青光眼。本文介绍一种用于诱导实验性虹膜新生血管的小鼠实验方案，可用于无创评估调节血管生成的物质。
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摘要
摘要
我们描述了一种由穿刺诱导的虹膜新生血管化模型，可作为血管生成无创评估的通用模型。该模型也适用于研究糖尿病视网膜病变的致盲性并发症——新生血管性青光眼。该方法通过在BALB/c小鼠上进行一系列可自行闭合的葡萄膜穿刺，诱导虹膜血管反应，并利用小鼠眼部血管系统在出生后的成熟过程。小鼠幼崽从出生后12.5天（即自然睁眼时期）开始接受葡萄膜穿刺，持续至出生后24.5天。由于角膜透明，可通过无创的in vivo方法对虹膜血管结构进行随时间推移的简便观察。此外，BALB/c小鼠半透明的虹膜可进行平铺制片，便于开展详细的免疫组织化学分析，且非特异性背景染色极低。在此模型中，血管生成主要由炎症系统和纤溶酶原激活系统驱动。这种穿刺诱导模型是首个在小型啮齿类动物中成功诱导虹膜新生血管化的模型，其优势在于可对血管生成过程进行直接、无创的in vivo分析。此外，该模型可与血管生成调节物质联合使用，凸显了其在以in vivo视角研究血管生成方面的潜力。
引言
虹膜与睫状体和脉络膜共同构成葡萄膜，后者是眼球中血管最丰富的组织。虹膜血管系统对于维持眼球前房的稳态至关重要。由于动脉与静脉之间存在丰富的吻合支，虹膜血管不仅为虹膜本身提供营养和氧气，还供应整个眼球前段1。
新血管的形成，即从已有血管中生成血管（血管生成），在发育和伤口愈合等生理过程中具有基础性作用2。血管生成受到多种经典因子的精细调控，例如血管内皮生长因子（VEGF）和纤溶酶原激活物抑制剂（PAI），同时也受到多种炎症因子的调节，这些因子的失衡可导致病理性血管生成3。
在眼部，新生血管形成是多种致盲性疾病的病因，例如增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和新生血管性青光眼（NVG）。在这些眼病中，局灶性新生血管通常位于视网膜组织，但眼后房和前房中炎症因子与促血管生成因子的失衡也与虹膜新生血管（rubeosis iridis）相关，后者是虹膜病理性新生血管形成的临床术语4。这些病理变化表明成人虹膜具有发生血管生成的能力。在小鼠中，眼部血管系统在出生后尚未成熟，需在出生后继续发育成熟。这一发育特性被应用于氧诱导视网膜病变小鼠模型，该模型可高度模拟早产儿视网膜病变的临床状况5。此外，血管生成和炎症在伤口愈合机制中发挥关键作用6，而伤口愈合过程本身也已被关联到血管生成模型的研究中7。
在本研究中，我们描述了一种穿刺诱导的虹膜新生血管模型。通过在角巩膜缘外侧边界附近进行葡萄膜穿刺，可激活伤口愈合系统，从而诱导虹膜新生血管形成。由于角膜具有透明性，虹膜血管结构可被便捷地观察与分析 体内 通过无创方法检测。穿刺眼的虹膜血管床增加，这与纤溶酶原激活剂和炎症标志物的升高相关。8该模型在研究血管生成及筛选促血管生成化合物方面具有巨大潜力，并可实现直接观察 体内 血管生成过程的可视化
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方案
按照《眼科与视觉研究中动物使用声明》的要求，选用雌雄不限的 BALB/c 小鼠幼崽进行实验，相关方案已获斯德哥尔摩伦理动物研究委员会批准。小鼠与其哺乳母鼠同窝饲养，保持 12 小时昼夜循环，自由获取食物和饮水，并每日进行健康监测。
注意：手术过程中，小鼠通过挥发性异氟烷维持麻醉状态。在眼部手术期间不建议使用眼膏，因为其可能干扰后续治疗及所用物质。如有必要，为防止干眼，可滴加一滴无菌生理盐水溶液。虽然葡萄膜穿刺可自行愈合，但在进行葡萄膜穿刺时仍需注意使用无菌外科器械以确保无菌操作。术后处理包括皮下注射生理盐水以维持水化，以及局部滴用盐酸四甲卡因进行眼部镇痛。幼鼠在返回清洁笼盒并交还给哺乳母鼠前，需在加热垫上恢复至胸卧位。为避免应激，同窝幼鼠始终与同一哺乳母鼠共同饲养。
1. 麻醉
- 准备麻醉诱导室，用于给予异氟烷麻醉剂，并确保同时连接小型小鼠面罩。
注意：所有动物实验均须符合所有适用的伦理许可要求。 - 用大气空气中含3-4%挥发性异氟烷预先填充诱导室。
注意：根据伦理许可，可使用异氟烷以外的其他麻醉剂。挥发性麻醉操作应在通风台或通风橱中进行。 - 将一只出生后（P）12.5天的BALB/c小鼠幼崽放入诱导室中。确认麻醉装置已准备就绪，可向诱导室输送异氟烷。
注意：小鼠幼崽较为脆弱，最好通过颈背部皮肤抓取。为避免应激，应将幼崽与其同窝仔鼠或哺乳母鼠放在一起。 - 让幼崽完全麻醉。
- 轻轻抓住小鼠幼崽的颈背部皮肤将其提起。
注意：为确保安全和稳定的麻醉诱导，诱导室应始终处于关闭状态。 - 将小鼠转移至啮齿类动物面罩。移动小鼠时，务必将麻醉气体从诱导室切换至面罩。
- 进行足趾夹捏以确认麻醉状态。
2. 手术体视显微镜下的穿刺操作
- 将小鼠置于侧卧位。确认面罩位置良好，使小鼠眼睛位于体视显微镜的视野范围内。
- 轻轻旋转小鼠头部，使眼睛朝上对准体视显微镜。
注意：应在体视显微镜下清晰聚焦眼睛。建议定位时使用16倍放大，而进行手术操作时应使用40倍放大。若伦理许可允许，修剪胡须尖端可有助于更好地观察眼睛。 - 使用小型持针钳，通过向眼球上下方的眼睑施加轻柔压力，小心地将幼鼠眼球突出。
- 用小型镊子轻柔但稳固地夹住幼鼠眼睑。
注意：建议用非优势手完成眼球突出和眼睑固定操作，以便优势手执行穿刺步骤。 - 使用体视显微镜定位角膜缘。白化BALB/c小鼠的角膜缘可通过角膜后方的环形血管丛清晰识别。
- 使用直径0.25 mm（30 G）斜面针头，在接近虹膜睫状体后缘处进行小的葡萄膜穿刺。仅使用针尖部分，穿刺深度不超过斜面的一半（相当于0.5 mm）。若操作正确，葡萄膜穿刺口可自行闭合，但研究物质仍可通过同一穿刺口注入眼内。
注意：若操作者熟悉小鼠眼部解剖结构，可在睫状体与锯齿缘之间进行葡萄膜穿刺。操作时需格外小心，避免刺破晶状体。 - 在眼球上与第一穿刺点相对的位置进行第二次葡萄膜穿刺。优化两个穿刺点之间的距离和位置，建议采用12点和6点位穿刺，其中12点位尽可能靠背侧。
- 每隔四天重复一次葡萄膜穿刺操作，直至出生后24.5天（P24.5）。每次后续穿刺前，应监测动物状态，特别注意是否存在因穿刺损伤晶状体导致的外伤性白内障，或明显的眼内压降低。为达到最佳效果，应尽量在与前次相同的位置重复穿刺。
3. 非侵入性 在体 监测
- 每次实验日进行穿刺或注射前，按照上述方法对小鼠实施麻醉。
- 将小鼠置于侧卧位，轻柔地使眼球突出。
- 使用手术体视显微镜对准虹膜血管结构。
- 使用安装在手术体视显微镜上的相机拍摄虹膜血管图像。
注意：尽管并非必需，但诱导瞳孔缩小有助于标准化每只动物的虹膜面积。选择诱导瞳孔缩小的试剂时，需考虑伦理许可问题。准确对焦虹膜血管结构将有助于后续定量分析。建议放大倍数为40倍。
4. 术后护理
- 将BALB/c乳鼠从啮齿类动物面罩上取下，并轻轻转移到铺有手术垫的加热垫上。
- 在穿刺过的眼睛上滴加一滴1%丁卡因溶液。
注意：根据伦理许可，也可使用其他镇痛溶液。 - 通过皮下注射200 µL无菌生理盐水对动物进行补水。
- 将乳鼠放回清洁的小鼠笼中，交由哺乳母鼠照护。
- 监测其恢复过程。乳鼠应能自主走动并回到同窝幼鼠中。
5. 眼球摘除
- 通过颈椎脱位法处死动物。在体视显微镜下进行眼球摘除和解剖，以更好地观察操作过程。
注意：可采用不同的安乐死方法。建议严格遵守伦理许可规定。 - 拉开眼睑，以充分暴露眼球。
- 使用弯头Bonn眼科剪在眼睑眦部附近做一个小切口（约0.5 cm）。
- 利用暴露的眶周间隙，将微型结扎镊插入眼球后方（下方）的眶内。
- 夹住眼球周围组织，轻柔向上牵拉。避免夹持眼球本身，应夹持靠近眼窝的周围组织。
- 将弯头Bonn眼科剪插入眼球后方的眶内。
- 剪断周围组织，直至眼球完全从眼窝中分离。
注意：该解剖技术可保持眼球解剖结构完整，有利于后续分析。 - 继续清除眼球上的多余组织。如需要，也可在固定后进行多余组织的去除。
注意：BALB/c小鼠缺乏黑色素，因此建议使用深色背景以增强对比度，便于解剖操作。 - 将完整眼球置于盛有无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中短暂冲洗。
- 将眼球转移至含有1.5 mL 4%缓冲福尔马林溶液的2 mL离心管中。
- 在室温下固定6小时。
注意：固定可增加组织硬度，有助于虹膜的解剖。固定时间应根据不同的应用需求进行测试和调整。
6. 体视显微镜下的虹膜解剖操作步骤
- 使用1.5 mL塑料巴斯德吸管（或类似工具）从离心管中移除固定液，并用新鲜的PBS冲洗眼球三次。
- 将固定后的眼球置于光滑干燥的表面（解剖台）上，前房朝上。
- 使用斜面30 G针头，在角膜缘后方进行穿刺进入。
- 用小型持针钳夹住前节结构，将Clayman-Vannas直剪刀的一侧刀尖插入先前创建的开口中。
注意：建议用非优势手持钳子，优势手持剪刀进行操作。 - 在用持针钳旋转眼球的同时，沿角膜缘剪切，以去除眼球的后节部分。
注意：进行部分剪切可使剪刀内侧刀尖持续进入组织，显著简化操作过程。 - 将前节结构翻转至朝下位置，暴露晶状体。
- 用小型镊子小心夹住晶状体并向上牵拉，将其移除。
注意：可使用斜面针头刺破并牵引晶状体。 - 将前节结构放置为角膜朝下，切面垂直于视野方向。
- 用小型持针钳轻轻夹住睫状体后方的组织。
- 使用Clayman-Vannas直剪刀，从前至睫状体前方进行修剪，以去除小梁网并分离虹膜。确认小梁网已被完全清除；此时虹膜应在角膜内可自由移动。
- 用小型持针钳小心夹住角膜，将前节眼杯转移至含有200 µL PBS的96孔板中。
- 在孔板中继续夹住角膜，用移液器冲洗PBS以分离虹膜。
注意：若虹膜仍黏附于角膜，可能提示存在残留的小梁网组织，可使用30 G针头的斜面辅助分离虹膜。 - 用小型持针钳将角膜从96孔板中取出，保留分离后的虹膜于孔中以供后续分析。
- 将游离虹膜样本置于4 °C保存。
注意：尽管组织已固定，仍不建议长期以游离状态保存虹膜样本。
7. 可能的实验检测指标
- 为了在分离的虹膜中可视化血管，可采用游离漂浮式全层免疫组织化学染色法，标记血小板内皮细胞黏附分子（PECAM）-1或凝集素B4（isolectin B4）。或者，可通过全身体灌注血管染色法，如使用荧光标记的高分子量葡聚糖（dextran）进行染色。
- 使用 体内 非侵入性成像以执行 计算机模拟 平铺并利用适当的成像软件对整个虹膜血管系统进行定量分析。
注意：血管系统可进行定量分析，两者均可 体内 和 体外，使用密度测定法或血管分析软件9. - 对完整眼球进行核酸和蛋白质提取，随后采用PCR或免疫印迹法，对穿刺眼组织进行分子分析。
注意：组织的分子分析最好使用未固定的组织进行，但未固定虹膜的分离极具挑战性，而既往研究中使用整个眼球已获得具有统计学意义的结果8.
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结果
在出生后12.5天（P12.5）的白化BALB/c小鼠幼崽上进行脉络膜穿刺处理，每四天重复一次（实验第0、4、8、12天），直至出生后24.5天（P24.5）。在出生后27.5天（P27.5），处死小鼠并仔细分离虹膜组织（实验第15天）。每次实验日穿刺前，均使用连接于手术体视显微镜的相机拍摄小鼠眼睛照片，以无创评估虹膜血管反应情况。脉络膜穿刺通过激活伤口愈合系统，诱导虹膜产生血管反应（图1）。由于角膜透明且BALB/c小鼠缺乏黑色素，从实验第4天（P16.5）起即可清晰观察到虹膜血管增多现象，并随着实验进程逐渐增强。PECAM-1免疫组织化学图像显示，与对照组相比，穿刺眼虹膜的整体血管数量明显增加（图2）。
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讨论
本方案介绍了一种通过葡萄膜穿刺诱导虹膜血管反应的新方法。该穿刺可触发伤口愈合机制，并促进虹膜的血管反应10,11。这一现象与眼部疾病（如增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和新生血管性青光眼（NVG））相符，在这些疾病中，眼后段视网膜过度的血管生成反应最终导致虹膜新生血管（rubeosis iridis）这一临床表现，即虹膜血管化程度增加12,13。
角膜无血管，具有特殊的胶原结构，从而保证其透明性。基于这一特性，通过直接观察虹膜血管，可实现眼前节血管造影以显示虹膜血管结构。 体内 非侵入性方法13,14既往的虹膜新生血管动物模型依赖于大眼动物，并需进行复杂的外科手术干预15
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Linnea Tankred 和 Diana Rydholm 在动物饲养方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 邦眼剪刀 | Bausch & Lomb | 23060 | |
| 克莱曼-范纳斯弯头剪刀 | Bausch & Lomb | E3383 C | |
| 克莱曼-范纳斯直头剪刀 | Bausch & Lomb | E3383 S | |
| 显微镜相机物镜适配器 | Handcrafted | N/A | 或任何可将相机连接至显微镜的系统 |
| 加热垫 100–110 瓦 | Non Applicable | N/A | 宠物店或兽医用品店有售 |
| 30G 斜面皮下注射针头 | KDM GmBH germany | 911914 | |
| iPhone 4S | Apple | Non Applicable | 或其他高分辨率图像采集设备 |
| 异氟烷 | Baxter | KDG 9623 | |
| 麦克弗森结扎钳 | Bausch & Lomb | E1815 S | |
| 微型结扎钳 | Bausch & Lomb | 63140 | |
| 盐酸四甲卡因滴眼液（Minims） | Bausch & Lomb | N/A | 1 % (w/v) 滴眼液 |
| 中性缓冲福尔马林 | Bioreagens | 0018-40 | |
| 生理盐水溶液 | Fresenius Kabi | 210352 | 注射用水中含 0.9 % (w/v) NaCl |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | ThermoFisher Scientific | 10010023 | pH 7.4 的平衡缓冲 PBS |
| 培养皿 10 cm | Starstedt | 83.3902 | |
| 培养皿 3 cm | Starstedt | 83.3900 | |
| Safe Seal 管 2.0 mL | Starstedt | 72.685.200 | 或任何其他 Eppendorf 风格离心管 |
| 组织培养板 96 孔 | Starstedt | 83.3924 | |
| 移液管 3.5 mL | Starstedt | 86.1171 | 或其他类型的巴斯德移液管 |
| Univentor 400 麻醉机 | Univentor Limited | N/A | 或具有诱导室和面罩的等效挥发性麻醉气体流量调节装置 |
| Wild M650 手术显微镜 | Wild Heerbrugg | N/A | 或其他手术用或放大用立体显微镜 |
参考文献
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