穿刺诱导的虹膜新生血管形成作为虹膜红变的小鼠模型

摘要

虹膜新生血管是缺血性视网膜疾病的常见并发症，可能导致威胁视力的新生血管性青光眼。本文介绍一种用于诱导实验性虹膜新生血管的小鼠实验方案，可用于无创评估调节血管生成的物质。

摘要

我们描述了一种由穿刺诱导的虹膜新生血管化模型，可作为血管生成无创评估的通用模型。该模型也适用于研究糖尿病视网膜病变的致盲性并发症——新生血管性青光眼。该方法通过在BALB/c小鼠上进行一系列可自行闭合的葡萄膜穿刺，诱导虹膜血管反应，并利用小鼠眼部血管系统在出生后的成熟过程。小鼠幼崽从出生后12.5天（即自然睁眼时期）开始接受葡萄膜穿刺，持续至出生后24.5天。由于角膜透明，可通过无创的in vivo方法对虹膜血管结构进行随时间推移的简便观察。此外，BALB/c小鼠半透明的虹膜可进行平铺制片，便于开展详细的免疫组织化学分析，且非特异性背景染色极低。在此模型中，血管生成主要由炎症系统和纤溶酶原激活系统驱动。这种穿刺诱导模型是首个在小型啮齿类动物中成功诱导虹膜新生血管化的模型，其优势在于可对血管生成过程进行直接、无创的in vivo分析。此外，该模型可与血管生成调节物质联合使用，凸显了其在以in vivo视角研究血管生成方面的潜力。

引言

虹膜与睫状体和脉络膜共同构成葡萄膜，后者是眼球中血管最丰富的组织。虹膜血管系统对于维持眼球前房的稳态至关重要。由于动脉与静脉之间存在丰富的吻合支，虹膜血管不仅为虹膜本身提供营养和氧气，还供应整个眼球前段¹。

新血管的形成，即从已有血管中生成血管（血管生成），在发育和伤口愈合等生理过程中具有基础性作用²。血管生成受到多种经典因子的精细调控，例如血管内皮生长因子（VEGF）和纤溶酶原激活物抑制剂（PAI），同时也受到多种炎症因子的调节，这些因子的失衡可导致病理性血管生成³。

在眼部，新生血管形成是多种致盲性疾病的病因，例如增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和新生血管性青光眼（NVG）。在这些眼病中，局灶性新生血管通常位于视网膜组织，但眼后房和前房中炎症因子与促血管生成因子的失衡也与虹膜新生血管（rubeosis iridis）相关，后者是虹膜病理性新生血管形成的临床术语⁴。这些病理变化表明成人虹膜具有发生血管生成的能力。在小鼠中，眼部血管系统在出生后尚未成熟，需在出生后继续发育成熟。这一发育特性被应用于氧诱导视网膜病变小鼠模型，该模型可高度模拟早产儿视网膜病变的临床状况⁵。此外，血管生成和炎....

方案

按照《眼科与视觉研究中动物使用声明》的要求，选用雌雄不限的 BALB/c 小鼠幼崽进行实验，相关方案已获斯德哥尔摩伦理动物研究委员会批准。小鼠与其哺乳母鼠同窝饲养，保持 12 小时昼夜循环，自由获取食物和饮水，并每日进行健康监测。

注意：手术过程中，小鼠通过挥发性异氟烷维持麻醉状态。在眼部手术期间不建议使用眼膏，因为其可能干扰后续治疗及所用物质。如有必要，为防止干眼，可滴加一滴无菌生理盐水溶液。虽然葡萄膜穿刺可自行愈合，但在进行葡萄膜穿刺时仍需注意使用无菌外科器械以确保无菌操作。术后处理包括皮下注射生理盐水以维持水化，以及局部滴用盐酸四甲卡因进行眼部镇痛。幼鼠在返回清洁笼盒并交还给哺乳母鼠前，需在加热垫上恢复至胸卧位。为避免应激，同窝幼鼠始终与同一哺乳母鼠共同饲养。

1. 麻醉

1. 准备麻醉诱导室，用于给予异氟烷麻醉剂，并确保同时连接小型小鼠面罩。
   注意：所有动物实验均须符合所有适用的伦理许可要求。
2. 用大气空气中含3-4%挥发性异氟烷预先填充诱导室。
   注意：根据伦理许可，可使用异氟烷以外的其他麻醉剂。挥发性麻醉操作应在通风台或通风橱中进行。
3. 将一只出生后（P）12.5天的BALB/c小鼠幼崽放入诱导室中。确认麻醉装置已准备就绪，可向诱导室输送异氟烷。
   注意：小鼠幼崽较为脆弱，最好通过颈背部皮肤抓取。为避免应激，应将幼崽与....

结果

在出生后12.5天（P12.5）的白化BALB/c小鼠幼崽上进行脉络膜穿刺处理，每四天重复一次（实验第0、4、8、12天），直至出生后24.5天（P24.5）。在出生后27.5天（P27.5），处死小鼠并仔细分离虹膜组织（实验第15天）。每次实验日穿刺前，均使用连接于手术体视显微镜的相机拍摄小鼠眼睛照片，以无创评估虹膜血管反应情况。脉络膜穿刺通过激活伤口愈合系统，诱导虹膜产生血管反应（图1）。由于角膜透明且BALB/c小鼠缺乏黑色素，从实验第4天（P16.5）起即可清晰观察到虹膜血管增多现象，并随着实验进程逐渐增强。PECAM-1免疫组织化学图像显示，与对照组相比，穿刺眼虹膜的整体血管数量明显增加（图2）。

讨论

本方案介绍了一种通过葡萄膜穿刺诱导虹膜血管反应的新方法。该穿刺可触发伤口愈合机制，并促进虹膜的血管反应^10,11。这一现象与眼部疾病（如增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）和新生血管性青光眼（NVG））相符，在这些疾病中，眼后段视网膜过度的血管生成反应最终导致虹膜新生血管（rubeosis iridis）这一临床表现，即虹膜血管化程度增加^12,13。

角膜无血管，具有特殊的胶原结构，从而保证其透明性。基于这一特性，通过直接观察虹膜血管，可实现眼前节血管造影以显示虹膜血管结构。 体内 非侵入性方法^13,14既往的虹膜新生血管动物模型依赖于大眼动物，并需进行复杂的外科手术干预¹⁵

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
邦眼剪刀	Bausch & Lomb	23060
克莱曼-范纳斯弯头剪刀	Bausch & Lomb	E3383 C
克莱曼-范纳斯直头剪刀	Bausch & Lomb	E3383 S
显微镜相机物镜适配器	Handcrafted	N/A	或任何可将相机连接至显微镜的系统
加热垫 100–110 瓦	Non Applicable	N/A	宠物店或兽医用品店有售
30G 斜面皮下注射针头	KDM GmBH germany	911914
iPhone 4S	Apple	Non Applicable	或其他高分辨率图像采集设备
异氟烷	Baxter	KDG 9623
麦克弗森结扎钳	Bausch & Lomb	E1815 S
微型结扎钳	Bausch & Lomb	63140
盐酸四甲卡因滴眼液（Minims）	Bausch & Lomb	N/A	1 % (w/v) 滴眼液
中性缓冲福尔马林	Bioreagens	0018-40
生理盐水溶液	Fresenius Kabi	210352	注射用水中含 0.9 % (w/v) NaCl
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	10010023	pH 7.4 的平衡缓冲 PBS
培养皿 10 cm	Starstedt	83.3902
培养皿 3 cm	Starstedt	83.3900
Safe Seal 管 2.0 mL	Starstedt	72.685.200	或任何其他 Eppendorf 风格离心管
组织培养板 96 孔	Starstedt	83.3924
移液管 3.5 mL	Starstedt	86.1171	或其他类型的巴斯德移液管
Univentor 400 麻醉机	Univentor Limited	N/A	或具有诱导室和面罩的等效挥发性麻醉气体流量调节装置
Wild M650 手术显微镜	Wild Heerbrugg	N/A	或其他手术用或放大用立体显微镜