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方法文章

一种用于血清学检测抗原特异性抗体应答的蛋白质微阵列实验方法 艰难梭菌 感染

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DOI：

10.3791/57399

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2018年6月15日

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单的蛋白质微阵列方法，用于分析体液免疫应答对高度纯化的7重蛋白组合的反应情况 艰难梭菌 人血清中的抗原。该方案可扩展用于多克隆静脉注射免疫球蛋白制剂中特异性抗体反应的测定。

摘要

我们提供了一种新型高通量蛋白质微阵列检测方法的详细概述，用于测定人血清及多克隆静脉注射免疫球蛋白（IVIg）制剂中抗Clostridium difficile抗体的水平。本方案描述了样本制备、微阵列打印、检测流程及数据分析所涉及的方法学步骤。此外，该方案还可进一步拓展，以纳入包括血浆和细胞培养上清液在内的多种临床样本。我们展示了如何利用蛋白质微阵列同时测定针对高度纯化的C. difficile毒素A和B（毒素型0，菌株VPI 10463，核糖型087）、仅表达毒素B的C. difficile菌株（CCUG 20309）的毒素B、二元毒素B片段前体pCDTb、核糖型特异性全表面层蛋白（SLPs；001、002、027）以及对照蛋白（破伤风类毒素和Candida albicans）的抗体，其类型涵盖免疫球蛋白同种型（IgG、IgA、IgM）、亚类（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2）以及菌株特异性抗体。实验中，使用来自C. difficile感染（CDI）患者、无腹泻的囊性纤维化（CF）患者、健康对照者（HC），以及接受IVIg治疗CDI、联合免疫缺陷病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经根神经病前后个体的血清对微阵列进行检测。我们发现不同患者组、不同商品化IVIg制剂，以及IVIg给药前后血清样本在毒素中和效力和多同种型特异性抗体水平方面存在显著差异。此外，微阵列法与酶联免疫吸附试验（ELISA）在血清抗毒素IgG水平检测结果之间具有显著相关性。这些结果表明，微阵列技术有望成为分析接种疫苗或感染个体对C. difficile抗原抗体应答特征的有力工具。随着抗原组合的进一步优化和生产成本的降低，我们预期微阵列技术可能有助于以个体化方式优化并选择针对C. difficile感染最具临床价值的免疫疗法。

引言

本方案描述了一种新型定制化蛋白质微阵列检测方法的开发与验证，用于检测和半定量分析针对C. difficile抗原的细菌菌株及同种型特异性抗体反应。我们成功地将这种特异性的C. difficile微阵列检测方法作为一种有前景的新工具，用于患者血清中特异性抗体成分的生物分析1,2、静脉注射免疫球蛋白（IVIg）制剂的分析3，以及鉴定与艰难梭菌感染（CDI）不良预后相关的抗体特异性4。我们展示了如何在微阵列芯片上分析生物样本库中保存的血清样本和市售IVIg制剂，从而在此检测中实现对C. difficile病原体特异性抗体反应的高质量、可重复的图谱绘制。

许多健康的儿童和成人血清中可检测到针对C. difficile毒素A和B的IgG和IgA抗体5,6。这些抗体被认为是在婴儿期短暂接触C. difficile后，以及成年后再次暴露于该菌时产生的。因此，多克隆静脉注射免疫球蛋白（IVIg）已被超说明书用于治疗复发性和暴发性艰难梭菌感染（CDI）7,8,9。然而，其确切作用机制和临床地位仍不明确。多项研究表明，针对C. difficile毒素的体液免疫反应在疾病表现和预后中发挥重要作用。具体而言，无症状个体的血清抗毒素A IgG浓度高于出现症状的患者10。已有研究报道，抗毒素A IgG的中位滴度与30天全因死亡率之间存在显著关联11。此外，多项报告还发现，针对毒素A、毒素B以及多种非毒素抗原（Cwp66、Cwp84、FliC、FliD和表面层蛋白（SLPs））的抗体反应与降低复发风险相关12,13,14,15。这些发现推动了首个靶向C. difficile毒素B的被动免疫治疗药物——贝洛托舒单抗（bezlotuxumab）的研发，该药最近已获得美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准，用于预防CDI的复发16。目前，基于灭活毒素或重组毒素片段的疫苗策略也正在研发中17,18,19。这些新型治疗方法无疑将促进对大样本量中针对多种抗原的体液免疫反应进行评估的需求。

目前，尚无 commercially available 的高通量检测方法能够同时评估针对C. difficile抗原的细菌菌株及同种型特异性抗体反应。开发此类检测方法存在尚未满足的需求，以推动未来的研究工作和临床应用。蛋白质微阵列是一种利用机器人系统将大量单独纯化的蛋白质固定在显微镜载片表面，形成空间有序的点阵的方法，该系统可以是接触式20或非接触式打印工具21。这些点阵可代表复杂的混合物，如细胞裂解液、抗体、组织匀浆物、内源性或重组蛋白质或多肽、体液或药物22,23。

蛋白质微阵列技术相较于传统的实验室自制ELISA技术具有明显优势，后者通常用于检测抗C. difficile抗体反应。这些优势包括：能够更灵敏地检测针对更广泛蛋白质靶标的多种同种型特异性抗体，抗原、样本和试剂的用量更少，以及能够增加技术重复的次数，并加入多种内部质量控制（QC）措施1。因此，微阵列技术具有更高的灵敏度、准确性、可重复性以及更宽的动态检测范围。这些特点使得微阵列成为大规模检测已知蛋白质时比ELISA更经济且更具潜力的替代方法。然而，微阵列技术的缺点主要源于建立一组高纯度抗原及搭建技术平台所需的巨大前期成本。

在过去的二十年中，蛋白质微阵列已被广泛用作临床应用中的诊断工具和基础研究工具。具体应用包括蛋白质表达谱分析、酶-底物关系研究、生物标志物筛选、宿主-微生物相互作用分析以及抗体特异性谱型分析23,24,25,26,27,28。目前已建立多种新的病原体蛋白质/抗原微阵列，包括疟疾（疟原虫）29、HIV-130、流感31、严重急性呼吸综合征（SARS）32、病毒性出血热33、疱疹病毒34和结核病35。

本方案涉及建立一种易于操作的C. difficile反应性抗原微阵列检测方法，可对血清和多克隆静脉注射免疫球蛋白（IVIg）中针对C. difficile抗原的多亚型及菌株特异性抗体应答进行准确、精确且特异的定量分析。本文提供了该微阵列检测方法在性能上与ELISA相当的代表性结果，以及检测的精密度和可重复性数据。该方法可进一步拓展用于其他临床样本的分析，为艰难梭菌感染（CDI）分子机制的研究设立了新的标准。

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方案

1. 准备微阵列板

  1. 用打印缓冲液 [PBS-Tween-海藻糖 (50 mM)] 将 C. difficile 抗原稀释至最佳浓度（该浓度在运行患者血清前已预先确定）：毒素 A（200 µg/mL）、毒素 B（100 µg/mL）、pCDTb（200 µg/mL），以及来自核糖型 001、002 和 027 的纯化天然全SLPs（200 µg/mL）。
    注意：毒素 B 来源于表达毒素 B 的菌株 CCUG 20309（90 µg/mL）。
    1. 用打印缓冲液将阳性对照、C. albicans 裂解物和破伤风类毒素稀释至 100 µg/mL。最后，用打印缓冲液将与待测抗体同种型匹配的纯化人免疫球蛋白进行系列稀释，起始浓度为 50 µg/mL，共进行10个梯度稀释，以建立标准曲线。
  2. 将 10 µL 用打印缓冲液稀释后的样品加入 384 孔板中。
  3. 用封板膜覆盖板孔，并在 300 × g 下离心 5 分钟。

2. 使用接触式机器人打印阵列

  1. 使用手持式燃气喷灯对硅针进行加热，每次2秒，共加热3次，每次加热后用洁净水冲洗，每次冲洗3秒，共冲洗3次。
  2. 将微阵列板放入点样仪的加载卡匣中。
  3. 将氨基硅烷包被的载玻片放置在载片托盘上。
    注意：载片托盘可容纳27张载玻片，分为三行，每行九张。载玻片以纵向方向从底行左侧开始放置，其余空位用空白载玻片覆盖，以确保托盘上所有孔位均被覆盖。
    1. 按下确定，并确认真空已开启 ，所有载玻片均已固定。在开始点样前，将载玻片置于湿润环境中至少1小时。
      注意：氨基硅烷包被的载玻片以密封袋包装，并配有干燥剂。一旦打开包装，未使用的载玻片应立即放回干燥器中保存，直至有效期结束。
  4. 设置合适的打印程序以点样 Clostridium difficile 抗原。启动TAS应用套件，并从“我的网格运行”目录中打开所需的打印运行参数文件。选择 Clostridium difficile 文件，用于以四重复方式打印所有 Clostridium difficile 抗原。
  5. 在主窗口双击“微阵列”图标后，将弹出一个名为“微阵列参数”的三标签窗口。  三个标签分别为“源”、“目标”和“选项”。“源”标签显示微阵列板中所用样本的数量信息。“目标”标签显示载玻片的加载方式、阵列在载玻片上的打印位置以及可编辑的载玻片布局（共16种子阵列格式）。“选项”标签显示清洗程序及所用工具的详细信息，例如 每完成一个样本后进行清洗。为避免不同样本间的交叉污染，应在样本之间清洁硅针。
  6. 编程选项位于TAS应用套件工具栏的“选项”>“运行偏好”中。此部分包含9个标签页，完成一个标签页后可通过点击下一个标签页继续操作。点击“确定”按钮将退出“运行偏好”设置。在“运行偏好”的“常规”标签页中，包含多个与程序启动时仪器行为相关的复选框。勾选“运行前预填充清洗液”选项，三个清洗站将在运行开始前执行一次短暂的预填充程序。勾选“运行开始时清洗”选项，点样针工具将在首次访问样本源前进行清洗。勾选“运行结束时清洗”选项，点样针工具将在最后一次访问样本源后进行清洗。用户可自行设置清洗循环次数。在“运行偏好”的“环境”标签页中，启动加湿功能。我们使用的设置如下：  启动湿度55%，运行湿度55%，最低湿度55%，目标湿度60%。在未达到目标湿度前不得开始运行，否则点样斑点尺寸将不正确，且样本库会迅速蒸发。
  7. 在TAS菜单栏中，点击绿色运行按钮。  启动运行，并在打印过程中定期观察点样仪，确保一切正常。 
    注意：每张载玻片可并行分析15个样本，其中一个子阵列用作阴性对照。子阵列的设计取决于所打印蛋白质（抗原）的数量以及生物学重复的次数。
    注意：每次打印完一个样本后，点样头将移向清洗槽，使点样针在两个清洗槽中分别浸入1.5秒，两个清洗槽分别装有蒸馏水和含0.002% Tween 20的溶液，随后用超纯水冲洗点样针，并在主清洗站干燥4秒。

3. 芯片阵列的保存

  1. 将打印好的载玻片在室温下置于干燥器中过夜保存。
    注意：打印好的载玻片最多可保存一周。

4. 芯片杂交

  1. 将打印好的载玻片小心放入16孔格式的载玻片架中。
    注意：这些孔腔深度约为7.5 mm，具有较大的表面积与体积比，有利于混合和洗涤步骤的进行。
  2. 使用前让所有试剂恢复至室温。除非另有说明，后续所有步骤均在室温下进行。
  3. 向每个区域加入100 µL经过滤的5%牛血清白蛋白Tween溶液（BSAT；使用0.2 µm注射器滤器过滤），覆盖载玻片，并在振荡条件下孵育1小时。
  4. 用每孔120 µL含0.1% Tween 20的磷酸盐缓冲液（PBST）振荡洗涤载玻片，每次1分钟，共洗5次。注意避免载玻片干燥。
  5. 将血清样本置于冰上解冻20分钟，并用市售含背景抑制成分的抗体稀释液（见材料表）对各样本进行稀释。
    1. 根据所检测的免疫球蛋白类型，按照表2所示优化血清样本的稀释比例。
  6. 将100 µL稀释后的血清样本加入除一个区域外的所有区域，留出的一个区域作为空白对照；向该对照区域仅加入100 µL抗体稀释液。将载玻片在轻度振荡条件下孵育1小时。
  7. 用每孔120 µL PBST（0.1% Tween）振荡洗涤载玻片，每次3分钟，共洗5次。
  8. 向每个区域加入100 µL用抗体稀释液稀释的生物素标记山羊抗人抗体。
    1. 根据所检测的免疫球蛋白类型，参照表2优化二抗的稀释比例。覆盖载玻片，并在轻度振荡条件下孵育1小时。
  9. 用每孔120 µL PBST振荡洗涤载玻片，每次3分钟，共洗5次。
  10. 向每个区域加入100 µL链霉亲和素Cy5，该试剂以5% BSA溶液稀释至1:2000。用铝箔覆盖载玻片以避光，在轻度振荡条件下孵育15分钟。
  11. 用每孔120 µL PBST振荡洗涤载玻片，每次1分钟，共洗5次，随后再用PBS洗涤2次，每次1分钟，均在振荡条件下进行。
  12. 以300 × g离心5分钟使载玻片干燥。
  13. 将载玻片保存于避光盒中，在室温下运输和储存。
  14. 应立即进行芯片扫描，以确保探针反应后信号的一致性。
    注意：然而，探针反应后的载玻片可在避光条件下保存，并在探针反应后一周内完成扫描。

5. 扫描芯片

  1. 在扫描前30分钟打开激光扫描仪（参见材料表），以预热激光。启动扫描仪软件，并将计算机连接至扫描仪。
  2. 将载玻片印刷面朝上放入扫描仪，直至运行指示灯变为稳定的绿色。
  3. 点击设置按钮，并按以下参数调整扫描设置：扫描模式为中位值（Median）；采集波长为635 Only；采集模式为手动（Manual）；增益（Gain）为20；激光功率为低（Low）；载玻片类型为未标记载玻片（Unlabeled Slide）；对焦方式为自动对焦（Auto Focus）。关闭自动滚动功能，并将条形码读取设置为像素大小10，扫描35。
  4. 将生成的图像保存为16位灰度多图像TIFF格式。点击导入网格按钮，并选择相应的阵列列表。
    注：阵列列表描述了子阵列的大小和位置，以及与每个特征指示符相关联的打印物质名称。
    1. 将网格与载玻片上的点阵对齐。
  5. 点击定量分析过程 按钮，分析图像，测量每个点的荧光信号强度，并将结果保存为一种名为GenePix结果（GPR）的文本格式。
    注：GPR文件包含阵列上抗原靶标的定位和识别变量，以及代表每个点抗体结合信号值的中位荧光强度和局部背景值。

6. 数据分析

  1. 使用一种名为反相蛋白微阵列（RPPA）分析器的免费微阵列分析软件（该软件是CRAN上R统计语言中的一个模块），在扣除背景后计算每个抗原重复实验的中位值36。
  2. 绘制标准曲线，并使用商业科学绘图与统计软件（参见材料表）将各抗原信号相对于免疫球蛋白标准曲线进行插值，以计算抗体水平。

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结果

图1 展示了描述本方案主要步骤的流程图。图2 显示了Spearman相关性检验结果，表明微阵列与ELISA在检测患者测试血清中IgG和IgA抗毒素A和B水平方面具有显著的一致性。图3 显示了非腹泻的囊性纤维化（CF）患者、艰难梭菌感染（CDI）腹泻患者以及健康对照（HC）个体对毒素A、毒素B和二元毒素（pCDTb）产生的IgG和IgA抗体类别特异性抗体反应的差异。图4 显示了患者血清中针对C. difficile 毒素的中和抗体反应。图5 显示了静脉注射免疫球蛋白（IVIg）对C. difficile 毒素和SLPs的免疫反应性及其对C. difficile 毒素的中和作用。图6

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讨论

在本实验方案中，我们证明了微阵列技术是用于定义患者血清（图3 和 图6）及静脉注射免疫球蛋白（IVIg）商品化制剂（图5）中针对 C. difficile 蛋白抗原的体液免疫反应的合适平台。我们还证实，与传统的ELISA方法相比，微阵列技术表现良好（图2），且具有优异的重复性，其板内和板间检测变异度均处于可接受的精密度范围之内（表1）。

关键步骤：
在构建任何成功的抗原微阵列平台时，必须遵循若干关键步骤。首先，进行质控实验极为重要。在质控实验中，应评估不同参数，例如适当表面化学的选择、打印缓冲液、封闭缓冲液、血清样本及二抗的稀释度。这些实验必须以建立一种经过充分验证且可靠的技术为目标来进行38,3...

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致谢

本研究得到了赫尔墨斯奖学金对 Ola Negm 和 Tanya Monaghan 的资助，以及诺丁汉消化系统疾病中心和英国国家健康研究所诺丁汉消化系统疾病生物医学研究中心的独立资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BioRobotics MicroGrid II 点样仪Digilab, Malborough, MA, USAN/A用于将抗原自动点样到载玻片上的接触式点样仪。
扫描仪 InnoScan 710InnopsysN/A配备红色（Cy5）激光的荧光微阵列载玻片扫描仪，用于读取反应信号。
MAPIX 软件版本 7.2.0InnopsysN/A测量点样信号的强度。
硅接触针Parallel Synthesis TechnologiesSMT-P75将样品打印到载玻片上。
Thermo Scientific Nalgene 干燥器Thermo Scientific41102426用于储存新的和已打印的载玻片。
384 孔板GenetixX7022UN用于制备抗原。
板盖Sigma Aldrich, UKCLS6570-100EA减少样品蒸发。
氨基硅烷载玻片Schott,  Germany1064875用于打印抗原的首选载玻片。
载玻片支架GraceBio Labs, USA204862将载玻片划分为 16 个相同的子阵列。这些支架为可重复使用、可拆卸、防漏的微孔。 
白色念珠菌裂解物NIBSCPR-BA117-S阳性对照
破伤风类毒素 Athens Research and Technology04/150阳性对照
免疫球蛋白 G (IgG)，正常人血浆 Athens research and  technology  16-16-090707纯化的天然人免疫球蛋白 G IgG，人血浆。 
免疫球蛋白 G1 (IgG1)，正常人血浆 Athens research and  technology  16-16-090707-1纯化的天然人免疫球蛋白 G1 IgG1，人血浆。 
免疫球蛋白 G2 (IgG2)，正常人血浆 Athens research and  technology  16-16-090707-2纯化的天然人免疫球蛋白 G2 IgG2，人血浆。 
免疫球蛋白 G3 (IgG3)，正常人血浆 Athens research and  technology  16-16-090707-3纯化的天然人免疫球蛋白 G3 IgG3，人血浆。 
免疫球蛋白 G4 (IgG4)，正常人血浆 Athens research and  technology  16-16-090707-4纯化的天然人免疫球蛋白 G4 IgG4，人血浆。 
免疫球蛋白 A (IgA)，人血浆 Athens research and  technology  16-16-090701纯化的天然人免疫球蛋白 A (IgA)，人血浆。
免疫球蛋白 A1 (IgA1)，人骨髓瘤血浆 Athens research and  technology  16-16-090701-1M纯化的天然人免疫球蛋白 A1 (IgA1)，人血浆。
免疫球蛋白 A2 (IgA2)，人骨髓瘤血浆 Athens research and  technology  16-16-090701-2M纯化的天然人免疫球蛋白 A2 (IgA2)，人血浆。
免疫球蛋白 M (IgM)，人血浆 Athens research and  technology  16-16-090713纯化的天然人免疫球蛋白 M (IgM)，人血浆。
生物素化山羊抗人 IgG 抗体，γ 链特异性Vector LabsBA-3080山羊抗人 IgG（γ 链特异性）-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgG1 铰链区-生物素Southern Biotec9052-08 山羊抗人 IgG1 生物素抗体特异性结合人 IgG1，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgG2 Fc 区-生物素Southern Biotec9060-08  山羊抗人 IgG2-生物素抗体特异性结合人 IgG2，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgG3 铰链区-生物素Southern Biotec9210-08   山羊抗人 IgG3-生物素抗体特异性结合人 IgG3，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgG4 pFc'-生物素Southern Biotec9190-08  山羊抗人 IgG-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
抗人 IgA，α 链特异性，山羊来源-生物素化Vector LabsBA-3030山羊抗人 IgG-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgA1-生物素Southern Biotec9130-08山羊抗人 IgG-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgA2-生物素Southern Biotec9140-08  山羊抗人 IgG-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
小鼠抗人 IgM-生物素Southern Biotec9020-08 山羊抗人 IgG-生物素抗体特异性结合人 IgG，不与其他免疫球蛋白反应。
0.2 mm 注射器滤器Thermo scientific723-2520过滤 5% BSA 溶液。
牛血清白蛋白 (BSA)Sigma Aldrich, UKA7284使用 5% BSA 进行载玻片封闭。
抗体稀释液Dako, UKS3022用于稀释血清和二抗。
链霉亲和素 Cy5eBioscienceSA1011用于检测免疫反应。
纯化的完整艰难梭菌毒素 A 和 B（毒素型 0，菌株 VPI 10463，核糖体型 087）Toxins Group, Public Health EnglandNA
纯化的完整艰难梭菌毒素 B（仅表达毒素 B 的 CCUG 20309 菌株）Toxins Group, Public Health EnglandNA
二元毒素 B 片段前体形式，pCDTbUniversity of Bath NA由完全合成的重组基因构建体在大肠杆菌（E. Coli）中表达生产。氨基酸序列基于 027 核糖体型已发表序列（http:www.uniprot.org/uniprot/A8DS70）。
纯化的天然全核糖体型特异性（001、002、027）表面层蛋白Dublin City University NA
Vigam（静脉注射免疫球蛋白制剂 1）Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen（静脉注射免疫球蛋白制剂 2）Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Intratect（静脉注射免疫球蛋白制剂 3）Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A

参考文献

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