方法文章

检测梭菌感染后抗原特异性抗体应答的蛋白微阵列测定方法

DOI：

10.3791/57399

⸱

2018年6月15日

 ,  , 
1Breast Surgery Group, Division of Medical Sciences and Graduate Entry Medicine, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham, 2Medical Microbiology and Immunology Department, Faculty of Medicine, Mansoura University, 3Nottingham Digestive Diseases Centre and NIHR Nottingham Digestive Diseases Biomedical Research Centre, School of Medicine, Queen's Medical Centre, University of Nottingham

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种简单的蛋白质芯片方法, 用于分析人体血清中高纯度梭菌抗原7丛细胞的体液免疫反应。该协议可推广用于测定多克隆静脉注射免疫球蛋白制剂中特异抗体的反应。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供了一种新的高通量蛋白微阵列检测方法, 用于测定人血清中的抗梭菌抗体水平, 以及单独制备多克隆静脉注射免疫球蛋白 (球蛋白)。该议定书描述了样品制备、阵列印刷、化验程序和数据分析所涉及的方法步骤。此外, 本议定书还可进一步发展, 以纳入多种临床样本, 包括血浆和细胞培养上清液。我们展示了如何使用蛋白微阵列来确定同种的组合 (IgG, IgA, IgM), 子类 (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2), 和应变特异抗体的高度纯化全C. 梭菌毒素 a 和 B (toxinotype 0, 应变新品10463, ribotype 087), 毒素 b 从一个C. 芽孢杆菌毒素 b 只表达应变 (CCUG 20309), 一种前体形式的 b 片段的二元毒素, pCDTb, ribotype 特定的整个表面层蛋白 (SLPs; 001, 002, 027) 和控制蛋白 (破伤风毒素和白色念珠菌)。在实验中, 微阵列是用C................................治疗 CDI, 联合免疫机能丧失障碍, 慢性炎症性脱髓鞘 polyradiculopathy。我们在免疫球蛋白治疗前和之后的毒素中和疗效和多同种特异抗体水平上均有显著差异。此外, 基因芯片与酶联免疫吸附试验 (ELISA) 在血清样品中抗毒素 IgG 水平有显著的相关性。这些结果表明, 微阵列可能成为一个很有希望的工具来分析抗体反应的C.随着抗原板的进一步细化和生产成本的降低, 我们预计微阵列技术可以帮助优化和选择临床上最有用的免疫疗法, 以病人特有的方式感染.

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该协议描述了一种新的和自定义的蛋白质微阵列检测和半定量的细菌应变和同种特异抗体反应的C.我们成功地使用了我们的C. 梭菌特异微阵列检测作为一个有希望的新工具的成分生物分析中的具体抗体含量的患者血清1,2, 免疫球蛋白3的准备, 并识别与 CDI4中不良结局相关的抗体特异性。我们展示了如何 biobanked 血清样品和免疫球蛋白的商业制剂可以分析在微阵列, 允许高质量的重现性分析的C.

许多健康的儿童和成人有检测到的血清 IgG 和 IgA 抗体的C. 梭菌毒素 a 和 B5,6。这些被认为是发生在婴儿期短暂暴露后, 在成年后接触到C.由于这个原因, 多克隆免疫球蛋白已被使用离标签治疗复发和暴发的 CDI7,8,9。然而, 它的明确作用和行动方式仍然不清楚。几项研究表明, 体液免疫反应的C. 梭菌毒素在疾病的呈现和结果中发挥作用。具体而言, 无症状患者显示, 血清抗毒素抗体浓度增加, 与发育症状性疾病10的患者相比。据报, 有一个明显的关联, 其中中位抗毒素抗体滴度和30天全死因死亡率11。一些报告还揭示了一个协会的预防复发和抗体反应的毒素 a, B, 和一些非毒素抗原 (Cwp66, Cwp84, FliC, FliD 和表层蛋白 (SLPs))12,13,14,15. 这些观察刺激了第一个被动免疫治疗药物靶向C. 刺杆菌毒素 B (bezlotuxumab), 最近被美国食品和药物管理局和欧洲药品批准防止经常性 CDI16的机构。使用灭活毒素或重组毒素片段的免疫接种战略目前也在开发17、18、19。这些新的治疗方法无疑将刺激对大样本大小的多抗原的体液免疫应答的评估要求。

今天, 有明显的缺乏商业可用的高通量检测, 能够同时评估细菌的应变和同种特异抗体反应的C. 梭菌抗原。目前尚无未满足的需要开发这种化验, 以促进今后的研究工作和临床应用。蛋白质微阵列是一种将大量单独纯化的蛋白质作为空间组织的斑点排列在微观滑动表面上的一种方法, 使用机器人系统, 可以是接触20或非接触印刷工具21。斑点可能代表复杂的混合物, 如细胞裂解物, 抗体, 组织组织匀浆, 内源性或重组蛋白或肽, 体液或药物22,23。

蛋白质微阵列技术比标准的内部 ELISA 技术具有明显的优势, 传统的检测方法用于评估抗C.其中包括提高检测一系列多同种特异抗体的能力, 针对更广泛的蛋白质靶点, 减少抗原、样品和试剂的体积要求, 以及增强吸收更大技术复制的数量, 除了多个内部质量控制 (QC) 措施1。因此, 微阵列更灵敏、准确、重现性强, 具有更大的动态范围。这些因素使微阵列成为一种更便宜和潜在的有利替代 ELISAs 的大规模检测已知蛋白质。然而, 微阵列技术的缺点主要是由于建立了高度纯化抗原的面板, 建立了技术平台, 导致了巨大的前置成本。

蛋白质微阵列作为临床应用的诊断和基础研究工具, 在过去的两年中得到了广泛的应用。具体应用包括蛋白质表达谱、酶基质关系的研究、生物标志物筛选、寄主-微生物相互作用分析、以及分析抗体特异性23、24、 25,26,27,28。许多新的病原体蛋白/抗原微阵列已经建立, 包括疟疾 (疟原虫)29, HIV-130, 流感31, 严重急性呼吸道综合征 (SARS)32, 病毒性出血热33, 疱疹病毒34, 结核病35。

本议定书涉及建立一个易于操作的c. 梭菌反应抗原微阵列检测, 这使得对 C 的多同种和应变特异抗体反应的准确、精确和具体量化。血清中的梭菌抗原和多克隆免疫球蛋白。在这方面, 我们包括了与 ELISA 相比可接受的微阵列检测性能的具有代表性的结果, 以及测定的精确度和重现性。该方法可进一步开发, 以分析其他临床样本, 并制定一个新的标准, 研究的分子基础的 CDI。

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方案

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1. 制备微阵列板

  1. 用印刷缓冲器稀释C. 梭菌抗原 [PBS-海藻糖 (50 毫米)] 在最佳的浓度 (在运行患者血清之前预定义): 毒素 a (200 µg/毫升) 和毒素 B (100 µg/毫升), pCDTb (200 µg/毫升), 纯化本机整个 SLPs 来自核糖体 001, 002 和 027 (200 µg/毫升)。
    注: 毒素 b 从毒素 b 表达菌株 CCUG 20309 (90 µg/毫升) 获得。
    1. 稀释阳性对照, 裂解物白念珠菌, 破伤风毒素与印刷缓冲器在100µg/毫升。最后, 稀释纯化的人类免疫球蛋白与测试过的抗体同种序列, 开始在50µg/mL 横跨10稀释在打印缓冲区, 以创建一个校准曲线。
  2. 将打印缓冲区中的稀释的10µL 转移到384井板中。
  3. 用板封和离心机盖板, 300 x 克, 5 分钟。

2. 用接触机器人打印阵列

  1. 使用手持式燃气燃烧器加热硅销, 每 3x 2 秒, 并在清水中冲洗 3x 3 秒。
  2. 将微阵列板放入机器人的加载盒中。
  3. 将 aminosilane 幻灯片放在幻灯片托盘上。
    注意: 幻灯片托盘可以容纳27张幻灯片: 三行九张幻灯片。幻灯片以纵向方向排列, 从底部行的左边开始, 其余的空格用空白幻灯片覆盖, 以确保幻灯片托盘上的所有孔都被覆盖。
    1. 按"确定"并检查是否已打开真空, 所有幻灯片都是安全的。在开始打印之前, 将幻灯片放在潮湿的环境中至少1小时。
      注: aminosilane 幻灯片是在密封袋中提供干燥剂。打开后, 任何未使用的幻灯片都应立即返回到干燥, 以便存储到到期日期为止。
  4. 建立合适的印刷方案, 打印出梭菌抗原。启动助教应用程序套件, 并从 "我的网格运行" 目录中打开所需的打印运行参数文件。选择四份梭菌文件, 打印出所有的梭菌抗原。
  5. 当双击主窗口上的微阵列图标时, 三个选项卡式窗口将显示为 "MicroArraying 参数"。 三选项卡是 "源"、"目标" 和 "选项"。"源" 选项卡显示了微阵列中使用的样本数量的详细信息。"目标" 选项卡显示了如何加载幻灯片的详细信息, 其中应在幻灯片上打印数组并编辑幻灯片版式 (16 个子数组格式)。"选项" 选项卡显示了要使用的洗涤协议和工具的详细信息。每次完成样品后清洗。清洁样品之间的硅针, 以避免不同样品之间的交叉污染。
  6. 编程选项位于助教应用程序套件工具栏上的 "选项" > "运行首选项" 下。在本节中, 有9个选项卡可供使用, 当您完成一个 tab 键移动到下一个选项卡时, 单击它。单击 "确定" 按钮将带您走出 "运行首选项"。在 "运行首选项" 的 "常规" 选项卡中, 在本节中有许多可用的复选框, 其中涉及在程序启动时仪器的行为方式。检查 "开始运行前的主要浴缸" 框, 所有三个洗涤站将经历一个短的启动序列之前的运行开始。检查 "在运行开始时清洗" 框, pin 工具将在第一次源访问之前清洗。检查 "在运行结束时清洗" 框, pin 工具将在最后一次源访问后清洗。用户可以设置洗涤周期的数量。在 "运行首选项" 的 "气候" 选项卡中, 开始加湿。我们使用的设置如下: 启动速率 55%, 运行速率 55%, 最小湿度 55%, 目标湿度60%。在达到目标湿度之前, 不要开始运行, 否则斑点将是错误的大小, 库将迅速蒸发。
  7. 在助教的菜单栏中, 单击 "绿色转到" 按钮。 开始运行, 并定期观察机器人在打印运行期间, 确定一切正常。
    注意: 这可以在每张幻灯片上并行分析15个样本, 因为一个子数组用作负控制。子阵的设计是由印刷蛋白 (抗原) 的数量和印刷的生物复制的数量决定的。
    注: 打印完每个样品后, 头部向洗涤浴池移动, 允许将针多次浸入两个沐浴液中, 每个浴缸中含有蒸馏水和0.002% 吐温 20, 然后用超纯水冲洗别针, 然后将针脚烘干。4 s 的主要洗涤站。

3. 阵列的存储

  1. 将打印的幻灯片存放在干燥的室温下过夜。
    注意: 打印的幻灯片最多可存储一周。

4. 阵列探测

  1. 小心地将打印的幻灯片放在16多井室格式的幻灯片夹中。
    注: 分庭, 深度约7.5 毫米, 提供了一个慷慨的表面体积比, 以方便混合和洗涤步骤。
  2. 使用前, 请允许所有试剂对室温进行预热。除非另行指定, 否则在室温下执行以下步骤。
  3. 添加100µL 过滤5% 牛血清白蛋白 (BSAT; 使用0.2 µm 注射器过滤器) 到每个块, 覆盖的幻灯片, 并孵化他们与颤抖1小时。
  4. 在120µL 的磷酸盐缓冲盐水中, 每1分钟洗一次, 每袋 20 (PBST; 0.1% 补间) 用颤抖。不要让幻灯片干燥。
  5. 将血清样品在冰上解冻20分钟, 用具有背景还原成分的商用抗体稀释剂稀释每个样品 (见材料表)。
    1. 根据检测到的免疫球蛋白, 优化血清样品的稀释, 如表 2所示。
  6. 将稀释后的血清样品的100µL 转移到除一条以外的所有区块, 用作阴性对照;对这个区块, 只添加100µL 的抗体稀释剂。用柔和的搅拌1小时孵化幻灯片。
  7. 在120µL PBST (0.1% 补间) 中每张幻灯片 5x 3 分钟, 每井都用震动冲洗。
  8. 添加100µL 的生物素化山羊抗人抗体稀释与抗体稀释剂。
    1. 按照表 2所述, 根据所测试的免疫球蛋白优化二次抗体的稀释。盖上幻灯片, 用柔和的震动孵化1小时。
  9. 在120µL 中, 每 PBST 3 分钟的每井都要用震动来清洗。
  10. 添加100µL 的链亲和素 Cy5 每块稀释 1:2000 5% BSA。用箔盖在幻灯片上, 以保护他们免受光线的震动, 同时用柔和的搅动15分钟。
  11. 在120µL 的 PBST 中, 每井1分钟冲洗一张幻灯片, 然后在 PBS 中进行2洗1分钟, 仅与震动。
  12. 旋转幻灯片5分钟, 在 300 x g, 以烘干它们。
  13. 将幻灯片放在一个深色的盒子里, 以便在室温下进行运输和储存。
  14. 继续扫描阵列, 以确保探测后信号的一致性。
    注意: 但是, 探测到的幻灯片可以存储在黑暗中, 并在一个星期内扫描探测。

5. 扫描阵列

  1. 打开激光扫描仪 (见材料表), 扫描前30分钟预热激光。上载扫描仪软件并将计算机连接到扫描仪。
  2. 将带有打印面的幻灯片放到扫描仪中, 直到播放指示灯变为实心绿色。
  3. 在扫描幻灯片时按下 "设置" 按钮并调整以下设置: 扫描模式, 中值;承购, 仅 635;采购模式, 手册;增益, 20;功率低;幻灯片类型, 未标记幻灯片;焦点, 自动对焦。打开自动滚动, 并将条形码读数设置为像素大小10和扫描35。
  4. 将结果图像保存为16位灰度多图像 TIFF 格式。按 "导入网格" 按钮, 然后选择相应的阵列列表。
    注意: 数组列表描述了子阵的大小和位置以及与每个特征指示器关联的打印物质的名称。
    1. 将网格与幻灯片上的点对齐。
  5. 通过按量化过程按钮对图像进行分析, 测量每个点的荧光信号强度, 并将结果保存为称为 GenePix 结果 ("探地") 的文本格式。
    注: 探地雷达文件包含了阵列抗原靶的定位和识别变量, 同时也包括了中值荧光强度和局部背景, 代表了各点的抗体结合信号值。

6. 数据分析

  1. 用一个叫做反向相蛋白阵列 (RPPA) 分析仪的自由基因芯片分析软件 (莓36中的 R 统计语言中的一个模块) 计算背景减法后各抗原复制的中位数。
  2. 利用商业科学绘图和统计软件 (见材料表), 绘制标准曲线, 并用相关的免疫球蛋白标准曲线来插入每个抗原的信号, 以计算抗体水平。

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结果

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图 1展示了描述协议中主要步骤的流程图。图 2显示了与检测血清中的 IgG 和 IgA 抗毒素 A 和 B 水平的基因芯片和 ELISA 之间的显著一致的长矛相关性试验。图 3显示了不同的 IgG 和 IgA 抗体类特异抗体反应的毒素 A, 毒素 B, 二进制毒素 (pCDTb) 的患者没有腹泻, CDI 患者腹泻, 和 HC。图 4显示了在患者血清中的C. 梭菌抗毒素中和抗体应答。图 5显示了免疫反应 (对c..... ...... ...。图 6显示了免疫反应性 (对c....... .......... ....

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讨论

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在本议定书中, 我们已经表明, 微阵列是一个适当的平台, 以确定体液免疫反应的C. 梭菌蛋白抗原的患者血清 (图3和6) 和商业制剂丙种球蛋白 (图 5)。我们还表明, 微阵列技术表现良好, 当与常规 ELISA (图 2), 并显示优良的重现性, 与内和间化验多变性在可接受的精确度范围内 (表 1)。

关键步骤:
在建立任何成功的抗原微阵列平台时, 必须遵循一些关键步骤。首先, 运行 QC 实验是极其重要的。在 QC 实验中, 应评估不同的参数, 如适当的表面化学选择, 印刷缓冲器, 阻断缓冲器, 血清样品的稀释和二次抗体。这些实验必须进行, 目的是提供一个良好的验证和可靠的技术38,39...

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致谢

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这项研究得到了爱马仕 Negm 和坦尼娅莫纳汉的支持, 并通过诺丁汉消化系统疾病中心和 NIHR 诺丁汉消化系统疾病生物医学研究中心的单独资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BioRobotics MicroGrid II 阵列仪Digilab，美国马萨诸塞州马尔伯勒N/A接触式阵列仪，用于自动将抗原点样到载玻片上。
扫描仪 InnoScan 710。InnopsysN/A带有红色 （Cy5） 激光的荧光微阵列玻片扫描仪，用于读取反应。
MAPIX 软件版本 7.2.0InnopsysN/A测量斑点的信号强度。
硅接触针Parallel Synthesis TechnologiesSMT-P75将样品打印到载玻片上。
Thermo Scientific Nalgene 干燥器Thermo Scientific41102426存放新的和打印的载玻片。
384 孔板GenetixX7022UN制备抗原。
板盖Sigma Aldrich， UKCLS6570-100EA减少样品蒸发。
氨基硅烷载玻片Schott， 德国1064875打印抗原的首选玻片。
玻片架GraceBio Labs， USA204862玻片分成相同的 16 个子阵列。这些支架是可重复使用、可拆卸、防漏的孔。
念珠菌裂解物NIBSCPR-BA117-S阳性对照
破伤风类毒素 Athens Research and Technology04/150阳性对照
免疫球蛋白 G （IgG），正常人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090707纯化的天然人免疫球蛋白 G IgG，人血浆。
免疫球蛋白 G1 （IgG1），正常人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090707-1纯化的天然人免疫球蛋白 G1 IgG1，人血浆。
免疫球蛋白 G2 （IgG2），正常人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090707-2纯化的天然人免疫球蛋白 G2 IgG2，人血浆。
免疫球蛋白 G3 （IgG3），正常人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090707-3纯化的天然人免疫球蛋白 G3 IgG3，人血浆。
免疫球蛋白 G4 （IgG4），正常人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090707-4纯化的天然人免疫球蛋白 G4 IgG4，人血浆。
免疫球蛋白 A （IgA），人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090701纯化的天然人免疫球蛋白 A （IgA），人血浆。
免疫球蛋白 A1 （IgA1），人骨髓瘤血浆 雅典研究和 技术  16-16-090701-1M纯化的天然人免疫球蛋白 A1 （IgA1），人血浆。
免疫球蛋白 A2 （IgA2），人骨髓瘤血浆 雅典研究和 技术  16-16-090701-2M纯化的天然人免疫球蛋白 A2 （IgA2），人血浆。
免疫球蛋白 M （IgM），人血浆 雅典研究和 技术  16-16-090713纯化的天然人免疫球蛋白 M （IgM），人血浆。
生物素化山羊抗人 IgG 抗体，γ 链特异性Vector LabsBA-3080山羊抗人 IgG（&γ;-链特异性）-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgG1 铰链-BIOTSouthern Biotec9052-08 山羊抗人 IgG1 生物素抗体与人 IgG1 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgG2 Fc-BIOTSouthern Biotec9060-08  山羊抗人 IgG2-生物素抗体与人 IgG 2 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgG3 铰链-BIOTSouthern Biotec9210-08   山羊抗人 IgG3-生物素抗体与人 IgG3 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgG4 pFc'-BIOTSouthern Biotec9190-08  山羊抗人 IgG-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
山羊制造的抗人 IgA，α 链特异性，山羊 - 生物素化Vector LabsBA-3030山羊抗人 IgG-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgA1-BIOTSouthern Biotec9130-08山羊抗人 IgG-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgA2-BIOTSouthern Biotec9140-08  山羊抗人 IgG-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
小鼠抗人 IgM-BIOTSouthern Biotec9020-08 山羊抗人 IgG-生物素抗体与人 IgG 发生特异性反应，但不与其他免疫球蛋白发生反应。
0.2 mm 针式过滤器Thermo Scientific723-2520过滤 5% BSA。
牛血清白蛋白 （BSA）Sigma Aldrich， UKA7284使用 5% BSA 封闭载玻片。
抗体稀释剂Dako，UKS3022稀释血清和二抗。
链霉亲和素 Cy5eBioscienceSA1011免疫反应检测。
纯化的艰难梭菌全毒素 A 和 B（毒素型 0，菌株 VPI 10463，核糖型 087）毒素组，英国公共卫生NA
纯化的艰难梭菌毒素全 B（CCUG 20309 毒素 B 仅表达菌株）毒素组，英国公共卫生NA
元毒素 B 片段的前体形式，pCDTb巴斯大学 NA在大肠杆菌中由全合成重组基因构建体产生。氨基酸序列基于已发表的 027 核糖型 （http：www.uniprot.org/uniprot/A8DS70）
纯化的天然全核糖型特异性 （001， 002， 027） 表层蛋白柏林城市大学 
Vigam （IVIg preparation 1）Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
Privigen （IVIg preparation 2）诺丁汉大学医院 NHS TrustN/A
Intratect （IVIg preparation 3）Nottingham University Hospitals NHS TrustN/A
将白色部 部 二 序列都NA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Negm, O. H., et al. Profiling humoral immune responses to Clostridium difficile.-specific antigens by protein microarray analysis. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (9), 1033-1039 (2015).
  2. Monaghan, T. M., et al. High prevalence of subclass-specific binding and neutralizing antibodies against Clostridium difficile. toxins in adult cystic fibrosis sera: possible mode of immunoprotection against symptomatic C. difficile infection. Clinical and Experimental Gastroenterology. 10, 169-175 (2017).
  3. Negm, O. H., et al. Protective antibodies against Clostridium difficile. are present in intravenous immunoglobulin and are retained in humans following its administration. Clinical & Experimental Immunology. 188 (3), 437-443 (2017).
  4. Monaghan, T., et al. OC-058 A protein microarray assay for predicting severe outcomes in Clostridium difficile infection. Gut. 66, Suppl. 2 31(2017).
  5. Bacon, A. E. Immunoglobulin G directed against toxins A and B of Clostridium difficile in the general population and patients with antibiotic-associated diarrhea. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 18 (4), 205-209 (1994).
  6. Viscidi, R., et al. Serum antibody response to toxins A and B of Clostridium difficile. The Journal of Infectious Diseases. 148 (1), 93-100 (1983).
  7. Salcedo, J., et al. Intravenous immunoglobulin therapy for severe Clostridium difficile colitis. Gut. 41 (3), 366-370 (1997).
  8. Abougergi, M. S., Kwon, J. H. Intravenous immunoglobulin for the treatment of Clostridium difficile infection: a review. Digestive Diseases and Sciences. 56 (1), 19-26 (2011).
  9. Shah, N., Shaaban, H., Spira, R., Slim, J., Boghossian, J. Intravenous immunoglobulin in the treatment of severe Clostridium difficile colitis. Journal of Global Infectious Diseases. 6 (2), 82-85 (2014).
  10. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. The New England Journal of Medicine. 342 (6), 390-397 (2000).
  11. Solomon, K., et al. Mortality in patients with Clostridium difficile infection correlates with host pro-inflammatory and humoral immune responses. Journal of Medical Microbiology. 62, Pt 9 1453-1460 (2013).
  12. Kyne, L., Warny, M., Qamar, A., Kelly, C. P. Association between antibody response to toxin A and protection against recurrent Clostridium difficile diarrhoea. Lancet. 357 (9251), 189-193 (2001).
  13. Leav, B. A., et al. Serum anti-toxin B antibody correlates with protection from recurrent Clostridium difficile infection (CDI). Vaccine. 28 (4), 965-969 (2010).
  14. Drudy, D., et al. Human antibody response to surface layer proteins in Clostridium difficile infection. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 41 (3), 237-242 (2004).
  15. Bauer, M. P., Nibbering, P. H., Poxton, I. R., Kuijper, E. J., van Dissel, J. T. Humoral immune response as predictor of recurrence in Clostridium difficile infection. Clinical Microbiology and Infection. 20 (12), 1323-1328 (2014).
  16. Wilcox, M. H., et al. Bezlotoxumab for prevention of recurrent Clostridium difficile infection. The New England Journal of Medicine. 376 (4), 305-317 (2017).
  17. Leuzzi, R., Adamo, R., Scarselli, M. Vaccines against Clostridium difficile. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 10 (6), 1466-1477 (2014).
  18. Ghose, C., Kelly, C. P. The prospect for vaccines to prevent Clostridium difficile infection. Infectious Disease Clinics of North America. 29 (1), 145-162 (2015).
  19. Henderson, M., Bragg, A., Fahim, G., Shah, M., Hermes-DeSantis, E. R. A review of the safety and efficacy of vaccines as prophylaxis for Clostridium difficile infections. Vaccines. 5 (3), Basel. (2017).
  20. Zhu, H., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science. 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  21. Delehanty, J. B., Ligler, F. S. Method for printing functional protein microarrays. BioTechniques. 34 (2), 380-385 (2003).
  22. Sutandy, F. X., Qian, J., Chen, C. S., Zhu, H. Overview of protein microarrays. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 27 (Unit 27) 21(2013).
  23. Huang, Y., Zhu, H. Protein array-based approaches for biomarker discovery in cancer. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 15 (2), 73-81 (2017).
  24. Vigil, A., Davies, D. H., Felgner, P. L. Defining the humoral immune response to infectious agents using high-density protein microarrays. Future Microbiology. 5 (2), 241-251 (2010).
  25. Bacarese-Hamilton, T., Mezzasoma, L., Ardizzoni, A., Bistoni, F., Crisanti, A. Serodiagnosis of infectious diseases with antigen microarrays. Journal of Applied Microbiology. 96 (1), 10-17 (2004).
  26. Davies, D. H., et al. Profiling the humoral immune response to infection by using proteome microarrays: high-throughput vaccine and diagnostic antigen discovery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (3), 547-552 (2005).
  27. Wadia, P. P., Sahaf, B., Miklos, D. B. Recombinant antigen microarrays for serum/plasma antibody detection. Methods in Molecular Biology. 723, 81-104 (2011).
  28. Moore, C. D., Ajala, O. Z., Zhu, H. Applications in high-content functional protein microarrays. Current Opinion in Chemical Biology. 30, 21-27 (2016).
  29. Crompton, P. D., et al. A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (15), 6958-6963 (2010).
  30. Khodakov, D. A., et al. An oligonucleotide microarray for multiplex real-time PCR identification of HIV-1, HBV, and HCV. BioTechniques. 44 (2), 241-246 (2008).
  31. Ryabinin, V. A., et al. Universal oligonucleotide microarray for sub-typing of Influenza A virus. PLoS One. 6 (4), 17529(2011).
  32. Zhu, H., et al. Severe acute respiratory syndrome diagnostics using a coronavirus protein microarray. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (11), 4011-4016 (2006).
  33. Cleton, N. B., et al. Spot the difference: development of a syndrome based protein microarray for specific serological detection of multiple flavivirus infections in travelers. PloS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003580(2015).
  34. Liu, Y., Yu, F., Huang, H., Han, J. Development of recombinant antigen array for simultaneous detection of viral antibodies. PLoS One. 8 (9), 73842(2013).
  35. Zhou, F., et al. Protein array identification of protein markers for serodiagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection. Scientific Reports. 5, 15349(2015).
  36. Mannsperger, H. A., Gade, S., Henjes, F., Beissbarth, T., Korf, U. RPPanalyzer: analysis of reverse-phase protein array data. Bioinformatics. 26 (17), 2202-2203 (2010).
  37. Monaghan, T. M., et al. Circulating antibody and memory B-cell responses to C. difficile-associated diarrhoea, inflammatory bowel disease and cystic fibrosis. PLoS One. 8 (9), 74452(2013).
  38. Grainger, D. W., Greef, C. H., Gong, P., Lochhead, M. J. Current microarray surface chemistries. Methods in Molecular Biology. 381, 37-75 (2007).
  39. Wellhausen, R., Seitz, H. Facing current quantification challenges in protein microarrays. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, article ID 831347 (2012).
  40. Guo, A., Zhu, X. -Y. The critical role of surface chemistry in protein microarrays. Functional Protein Microarrays in Drug Discovery. , CRC Press. Boca Raton. (2007).

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