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从正常结肠和结直肠癌组织中分离人内皮细胞——一种改进的方案

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DOI：

10.3791/57400

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2018年4月4日

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1Division of Molecular and Experimental Surgery, Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 2Department of Surgery, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 3Division of Nephropathology, Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg, 4Department of Pathology, University Medical Center Erlangen, Friedrich-Alexander University of Erlangen-Nuremberg

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

肿瘤内皮细胞是肿瘤微环境及疾病进程的重要决定因素。本文描述了一种从人结直肠癌及正常结肠组织中分离出纯净且具有活性的内皮细胞的实验方案，可用于药物测试和发病机制研究。

摘要

从人类癌组织中分离的原代细胞是识别导致疾病发生和进展的致病机制的重要工具。特别是构成血管内表面的内皮细胞（EC），直接参与向肿瘤输送氧气和营养物质，以及清除代谢废物，在肿瘤微环境（TME）的形成中发挥关键作用。肿瘤内皮细胞（TECs）可作为肿瘤与基质细胞之间相互作用所建立的瘤内微环境的细胞生物传感器，同时也可作为治疗的靶点。因此，在体外培养条件下，这些细胞可用于研究抗血管生成治疗的响应或耐药机制。最近研究发现，从人结直肠癌（CRC）中分离的TECs表现出类似记忆效应的特征，这种特性取决于其来源的特定TME。此外，这些TECs通过分泌多种因子，主动参与特定TME的建立。例如，在预后良好的Th1型TME中，TECs会分泌一种具有抗血管生成和肿瘤抑制功能的因子——富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白样1（SPARCL1）。SPARCL1可调节血管稳态，并抑制肿瘤细胞的增殖和迁移。因此，从人类实体瘤中分离获得的高纯度、活性良好的TECs培养物，是研究血管系统在肿瘤发生过程中功能的宝贵工具。本文介绍了一种最新且高效的从正常结肠组织及结直肠癌组织中分离原代内皮细胞的实验方案。该技术基于机械与酶联合消化组织、免疫标记以及对三重阳性细胞（CD31、VE-钙黏蛋白、CD105）进行荧光激活细胞分选（FACS）。采用该方案，在66份组织样本中成功获得41份纯化的内皮细胞培养物，FACS分选的成功率为62.12%。因此，该方案为从正常结肠和结直肠癌组织中分离人源内皮细胞培养物提供了一种可靠的方法。

引言

肿瘤微环境（TME）是指肿瘤细胞与肿瘤间质之间密切相互作用的体系，其中肿瘤间质包含内皮细胞（EC）、周细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞或免疫细胞等细胞类型。这些细胞区室之间的通讯可通过旁分泌因子（例如，促血管生成生长因子、细胞因子）、细胞外基质或直接的细胞-细胞接触来驱动。间质区室可能促进或抑制肿瘤的发生或进展，具体取决于所形成的特定TME。

肿瘤与血管系统建立连接的能力是疾病进展和转移的关键。血管系统主要使肿瘤能够获得氧气和营养物质的输送，同时排出代谢废物1,2,3。内皮细胞（EC）构成血管的内表面，因此是积极参与该过程的重要细胞组分。众所周知，肿瘤内皮细胞（TEC）在多个特征上与其对应的正常内皮细胞（NEC）存在差异，例如血管树结构紊乱、血管通透性增加，或由于包裹在内皮细胞周围的周细胞/壁细胞数量减少且与内皮细胞连接松散，导致血管成熟度降低4。

因此，肿瘤来源的内皮细胞（TEC）是研究癌变过程的重要细胞工具。TEC最初被认为可促进肿瘤的生长和进展3。因此，TEC可用作生物传感器，用于监测和识别启动、促进或抑制肿瘤发生的过程。此外，TEC在临床上也是治疗的重要靶点5。因此，分离获得的TEC及其相应的正常内皮细胞（NEC）也可作为研究抗血管生成治疗响应或耐药机制的工具。

此前，我们建立了一种分离这些细胞的方案6,7，并发现肿瘤血管内皮细胞（TECs）不仅与正常血管内皮细胞（NECs）不同，而且根据其来源的肿瘤微环境（TME）的不同，彼此之间也存在差异8。通过该方法，研究发现某些肿瘤微环境中的TECs可通过分泌SPARCL1等抗血管生成的肿瘤抑制蛋白，主动抑制肿瘤的生长和进展。这表明，在人结直肠癌（CRC）中，TECs积极参与构建具有有利预后意义的肿瘤微环境8。

既往研究尝试从实体瘤中分离人类肿瘤内皮细胞（TEC）。这些研究的重要目标之一是，例如，鉴定新的肿瘤内皮细胞标志物（TEM）9。为避免体外培养过程中TEC表型发生改变或丢失，曾采用激光显微切割后立即使用TEC的策略。然而，后续研究发现该方法存在严重缺陷，即存在壁细胞污染的问题10。本实验室首次建立了从结直肠癌（CRC）患者中分离纯度高且具有活性的TEC的实验方案6,7。该方案采用多次磁珠激活细胞分选（MACS）步骤，以确保所获得的内皮细胞（EC）培养物具有高纯度。然而，该方法需要相对较长的培养周期（平均6周），从而增加了培养诱导的人工假象风险。因此，下一步的目标是缩短从手术到获得首个纯培养物之间的时间。为实现这一目标，我们开发了一种改进的方案：首先对原始肿瘤组织进行机械与酶联合消化解离，随后通过荧光激活细胞分选（FACS）对三重标记的EC进行分选。该改进使分离时间平均缩短至三周，获得了纯度更高、活性更好的TEC和正常内皮细胞（NEC）培养物，更适用于功能研究。以高成功率从人体组织中分离出具有活性的纯TEC和NEC培养物，可能为个体化治疗方案研发过程中的患者特异性药物测试开辟新途径。以下段落将详细描述该分离方法。

方案

该分离过程已获得埃尔朗根大学医学中心当地伦理委员会的批准（#159_15 B，TuMiC 研究）。患者纳入标准如下：结直肠癌（CRC），UICC 分期 I-IV 期，无炎症性肠病史，且未接受过新辅助治疗。

1. 单细胞分离的手术与组织制备

  1. 通过手术从结直肠癌（CRC）患者获取标本（癌组织 >0.5 g，取肿瘤中央非坏死区域；正常结肠组织距离肿瘤部位 >10 cm）。
  2. 所获取的癌组织块通常 <1 g，而正常结肠组织则 >1 g。若获取的组织块 >1 g，应使用新的手术刀将其分割为多个约1 g的组织块，以便后续组织处理。
    注：若初始肿瘤组织块小于0.5 g，通常会导致分离失败。
  3. 使用无菌镊子将新鲜未固定的组织块放入含40 mL冰上预冷的含青霉素/链霉素/两性霉素B（1% HBSS-pen/strep/ampho）的Hanks平衡盐溶液（HBSS）中，置于50 mL离心管内，并迅速转移至实验室。
    ​注：结肠组织在取材时通常含有大量细菌/真菌污染。在整个分离过程中，所有溶液均需添加青霉素/链霉素/两性霉素B，以清除污染微生物。
  4. 使用无菌镊子将每块组织在50 mL离心管中用40 mL冰上预冷的HBSS-pen/strep/ampho溶液至少清洗4次（参见步骤1.3），每次将组织块依次从一个离心管转移至下一个离心管。
    1. 每次操作后，用70%乙醇清洁镊子。
    2. 癌组织和正常结肠组织应使用不同的镊子分别处理。
    3. 称量所有组织块。
      注：不得将组织块直接放置于天平上称重。清洗后，通过称量盛有组织的最后一个离心管在加入组织前后的质量差，计算各组织块的重量。

2. 单细胞悬液的制备

注意：建议始终使组织保持湿润。

  1. 如果存在，使用无菌镊子将手术标本中的组织块转移至无菌细胞培养培养皿中，并去除附着的脂肪、其他非肿瘤组织或可能坏死的组织部分。
    1. 始终通过添加 3–5 mL HBSS-青霉素/链霉素/两性霉素（HBSS-pen/strep/ampho）保持组织块湿润。
    2. 使用新的无菌弯刃手术刀修剪组织块（图1）。若组织鉴定不明确，请咨询病理学家。
  2. 使用带有弯刃的新手术刀将剩余组织切成小块（约 2 × 2 × 2 mm3）。使用无菌镊子将组织块转移至预先加入预热（37 °C）细胞培养基（根据制造商说明使用 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 [DMEM] 基础培养基）的组织解离管（例如 gentleMACS C 管）中。
    注意：尽量将手术刀用作 rocking 工具。避免挤压细胞，以防组织损伤。
  3. 使用组织解离仪（如 gentleMACS Octo Dissociator）结合人组织肿瘤解离试剂盒，按照制造商说明运行程序 "37C_h_TDK_1"，对组织块进行消化/解离。
  4. 在室温（RT）下以 300 × g 离心解离管 1 分钟。
  5. 使用移液管向每根管中加入 10 mL 预热（37 °C）的含 0.5% 胎牛血清（FBS）的 DMEM（DMEM-Low），并通过移液将细胞悬液加至置于 50 mL 离心管上方、孔径为 100 µm 的细胞筛网上，过滤细胞悬液。
  6. 再次使用移液管向每根 MACS 管中加入 10 mL DMEM-Low，并将残留细胞转移至置于 50 mL 离心管上方的细胞筛网上。
  7. 使用移液管以额外的 10 mL DMEM-Low 培养基清洗细胞筛网一次。
  8. 在室温下以 300 × g 离心细胞悬液 7 分钟，弃去上清液。
  9. 在同一个 50 mL 离心管中，将细胞重悬于 5 mL 预热的、添加了青霉素/链霉素/两性霉素（pen/strep/ampho）的内皮基础培养基（EBM）-2 微血管（MV）培养基（Lonza）中。
  10. 将细胞悬液接种至预先用 1.5% 明胶-磷酸盐缓冲液（PBS）在 37 °C 条件下孵育过夜包被的 T-25 细胞培养瓶中，并置于含 5% CO2 的环境中。
  11. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下培养细胞 24 小时，小心用约 5 mL PBS 洗涤细胞两次，然后加入 5 mL 新鲜培养基。
  12. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下继续培养细胞，每隔 48 小时更换一次培养基，直至细胞融合度达到 80–90%（通常为 5–7 天）。

3. 内皮细胞的FACS分选

注意：应尽量避免在任何步骤中损失细胞，例如将染色过程限制在单个试剂管中孵育细胞。

  1. 用1 mL的accutase消化细胞（约10分钟），然后加入4 mL预热至37 °C的EBM-2-MV培养基。
  2. 使用自动细胞计数仪测定细胞数量（范围为10 - 25 µm）。
  3. 将细胞悬液在室温下以250 × g离心4分钟，弃上清液。
  4. 用预热的FACS缓冲液（1x PBS，2.5%牛血清白蛋白[BSA]，5 mM EDTA pH 8.0，10 µM Y-27632）重悬细胞，根据细胞计数调整至（5 x 10⁶ 个细胞/mL）6/mL
  5. 根据细胞数量/FACS 缓冲液体积加入 FACS 染色抗体：CD31-FITC（100 µL/mL = 1/10）、CD144/血管内皮（VE）-cadherin-PE（100 µL/mL = 1/10）、CD105-APC（25 µL/mL = 1/40），混匀后避光室温孵育 7 分钟；轻轻振荡混匀，再孵育 8 分钟（总孵育时间为 15 分钟）。
  6. 使用血清移液管向标记的细胞悬液中加入 2 mL FACS 缓冲液。
  7. 在室温下以250 × g离心4分钟，弃去上清液。
  8. 加入2 mL FACS缓冲液重悬，洗涤两次，每次在室温下以250 × g离心4分钟，弃上清液。
  9. 将细胞重悬于500 µL预热的EBM-2-MV-pen/strep/ampho培养基中，并将细胞转移至FACS分选仪器。
    1. 如果流式细胞分选仪经过冷却，内皮细胞在分选过程中会迅速死亡。因此，内皮细胞的分选应在室温下进行，分选完成后立即将收集的细胞转移至37 °C培养箱中。
      注意：FACS 仪器通常为非无菌状态！
  10. 将三重阳性细胞直接分选/收集至细胞培养皿中（例如， 预先用1.5%明胶-PBS在4℃包被过夜的24孔板，每孔加入0.5 mL预热的新鲜培养基（EBM-2-MV-pen/strep/ampho）。
    注意：分选后使用显微镜检查细胞悬液。若细胞发生聚集，可通过缓慢混匀或添加培养基的方式，使细胞在培养皿中分布均匀。
  11. 细胞培养至90–100%汇合度，每48小时更换一次培养基，并将细胞扩增至所需培养皿规格（24孔板 → 12孔板 → 3.5 cm培养皿 → T-25 → T-75）。

4. 纯内皮细胞的收获与表征

  1. 在细胞融合度达到90 - 100%时收获细胞，并采用适当方法进行表征（例如，流式细胞术、细胞化学染色、定量聚合酶链式反应（qPCR）或内皮细胞功能检测7,8）。
  2. 使用所选的表征方法分析分离的细胞。

结果

本文描述了通过联合机械/酶法组织解离，随后进行CD31/CD105/VE-钙黏蛋白驱动的FACS分选，从人结直肠癌（CRC）中分离NEC和TEC的方法（图1A）。与先前基于MACS的方案相比，该方案为一种改进方案，可缩短获得纯度高且具有活性的内皮细胞的首次收获时间7。

NEC和TEC通过以下步骤从人结直肠癌组织中分离：（1）采用机械法与酶解法联合消化组织，制备单细胞悬液，并将这些细胞培养至80–90%融合度图1)，（2）使用与荧光染料偶联的CD31/CD105/VE-钙黏蛋白抗体对内皮细胞进行三重标记，以及（3）对相应的三重阳性细胞进行FACS分选（图2A值得注意的是，成功分离细胞并保持其活力的关键步骤是尽快将手术标本进行分离处理（制备单细胞悬液）。 <切除后1小时）。通过FACS分选，平均获得12,500个TEC（n = 12）和17,800个NEC（n = 12， 图2B，左侧）分别占总细胞群的平均比例为3.6%和5.6%（图2B，右侧）可被分离。随后，细胞在T-75培养瓶中扩增（称为第1代），并用于收获或进一步分析。值得注意的是，采用先前基于MACS的方案，平均分离成功率为49.6%（来自117例患者，共获得58例纯胸腺上皮细胞）8手术后平均约6周可获得纯内皮细胞（EC）培养物。采用本文所述的新型基于FACS的方案，首次获得纯EC培养物的平均时间为手术后3周，分离成功率为62.1%（对66份单细胞悬液进行FACS分选，获得41份纯EC培养物）。因此，分离成功率提高了12.5%，同时培养时间由6周缩短至3周。培养时间的缩短提高了细胞活力，延长了细胞寿命，并减少了建立的培养物因长期培养而产生潜在培养依赖性人工假象的风险。

首先通过CD31细胞化学染色对内皮细胞（EC）纯度进行表征（图3A）。若培养物中无CD31阴性细胞（图3A，TEC和NEC），则进一步采用逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进行更详细的细胞分型（图3B）。所用细胞类型特异性引物包括内皮细胞（CD31、CD105、VE-钙黏蛋白和血管性血友病因子[vWF]）、白细胞（CD45）、上皮细胞（细胞角蛋白[CK]-20）以及平滑肌细胞/成纤维细胞（结蛋白）（图3B）。通过这种基于qPCR的细胞分型方法，可检测到内皮细胞培养物中可能存在的其他细胞污染，检出灵敏度根据细胞类型不同，可达0.1–2%8。

值得注意的是，我们此前曾报道过，在TEC培养物中vWF蛋白表达的丢失程度明显高于相应的NEC培养物7这些发现可通过新建立的分离方案加以验证（图3C，平均 Ct 值降低 NEC-TEC = 0.687， p = 0.173，配对t检验）。成功通过这些质量控制的培养物经检测无支原体污染后，用于后续实验。

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图1：可通过FACS分选从人正常结肠和结直肠癌组织中分离出纯内皮细胞。（A）内皮细胞分离过程关键步骤的流程图。（B）从手术标本中去除脂肪组织（黄色）、其他非肿瘤组织或可能坏死的组织部分（棕色）（左图和中图），并将肿瘤组织切割成边长为2–3 mm的组织块，以进行后续组织解离（右图）。（C）组织解离后获得的单细胞悬液（左图）在细胞培养皿中孵育24小时。随后用PBS轻轻洗涤去除非贴壁细胞（中图），贴壁细胞继续培养至80–90%汇合度，然后进行FACS分选（右图）。下层面板（C）的图像通过相差显微镜拍摄。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：从人类结直肠癌（CRC）患者中分离并经FACS分选的单细胞悬液中，平均有3.6 - 5.6%为三重阳性内皮细胞（EC）。 （A）使用抗CD31、CD105和VE-钙黏蛋白抗体对细胞进行三重标记，通过FACS分选获得正常内皮细胞（NEC）和肿瘤相关内皮细胞（TEC）。（B）通过FACS分选（CD31、CD105和VE-钙黏蛋白阳性细胞，左图）可从人正常结肠组织或结直肠癌组织中平均分离得到12,500个TEC（n = 12）和17,800个NEC（n = 12），分别占所用总细胞群体的平均比例为3.6%和5.6%（右图）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：人结直肠癌中的正常肠内皮细胞（NEC）和肿瘤内皮细胞（TEC）表达典型的内皮细胞标志物。 来自人结直肠癌（CRC）的正常肠内皮细胞（NEC，n = 10）和肿瘤内皮细胞（TEC，n = 10）表达CD31（内皮细胞标志物）、CD105（内皮细胞标志物）、VE-钙黏蛋白（内皮细胞标志物）和vWF（内皮细胞标志物），且呈阳性，而CK20（结直肠癌细胞标志物）、波形蛋白（成纤维细胞/平滑肌细胞标志物）和CD45（白细胞标志物）呈阴性，结果通过（A）CD31免疫细胞化学染色（阳性细胞为红色）和（B）RT-qPCR（虚线下方的数据点表示检测为阴性的样本）确定。（C）同一患者来源的相应TEC/NEC样本中vWF表达的RT-qPCR检测结果。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前，从人实体组织中分离出纯净且具有活性的NEC和TEC主要采用三种不同的方法，即（1）免疫磁珠富集法，（2）激光显微切割法，以及（3）内皮细胞（EC）组分的FACS分选法。在大多数已发表的研究中，均采用机械解离获得单细胞悬液后，再进行免疫磁珠富集的方法11,12,13。例如，已有研究报道通过肿瘤坏死因子（TNF）-α处理新生儿包皮组织后，利用E-选择素抗体对人真皮微血管内皮细胞（HDMEC）进行免疫磁珠纯化13；也有研究通过组织消化、Percoll梯度离心及使用抗CD31/CD105和VE-钙黏蛋白抗体进行筛选，从胶质瘤组织中分离人内皮细胞12；或利用抗CD105抗体从人乳腺癌组织中分离内皮细胞11。采用激光显微切割或FACS分选的方法报道相对较少。例如，激光显微切割曾被用于分析人结直肠癌来源的内皮细胞，以鉴定潜在的泛肿瘤内皮细胞标志物（TEMs），并在切割后立即对细胞进行分析9。此外，使用抗CD31抗体进行FACS分选已被成功应用于从未分化的人胚胎干细胞中分离内皮细胞组分14。

这些方法具有不同的优缺点，需要加以考虑。基于免疫磁珠的方法的优点在于不需要复杂的设备，分选可随时进行，且细胞富集速度快（约15分钟），相比之下，FACS分选耗时较长（约1小时）。长时间缺乏基质可能导致内皮细胞因失巢凋亡而死亡。因此，在FACS缓冲液中添加了Rho激酶抑制剂Y-27632，以防止细胞发生失巢凋亡15。

免疫磁珠富集的缺点是需要进行多轮筛选才能达到99%以上的纯度。此外，富集过程中需要在细胞培养之间进行恢复培养，这会延长培养时间，增加由培养引起的假象。激光显微切割的优点是细胞可立即使用，从而减少培养诱导的假象，但存在邻近组织区域细胞污染的风险10。此外，显微切割技术尚未在所有实验室中普及。基于FACS分选的方法的缺点包括：与激光显微切割类似，所需设备复杂且成本高昂，因此可能无法随时获得。在临床环境中，由于目标组织的获取时间难以精确规划，这可能带来进一步的不利影响。

然而，FACS分选的主要优势在于，内皮细胞（EC）组分可以同时使用多种抗体进行标记。因此，可采用严格的设门策略，从而确保高纯度。根据经验，与之前基于MACS的方案需要多轮筛选不同，FACS分选无需重新分选EC组分。这使得获得纯细胞所需的培养时间显著缩短，从MACS方法的六周减少至FACS方法的三周，从而提高了细胞活力，延长了分析的时间窗口。最后，采用基于FACS分选的策略，整体分离成功率得到提升（提高了12.5%）。综上所述，通过机械与酶联合消化组织后，同时使用三种抗体进行FACS分选的策略在多个方面具有优势，使其成为从人结直肠癌及结肠组织中分离胸腺上皮细胞（TECs）和神经内分泌细胞（NECs）的首选方法。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢Christian Flierl、Katja Petter、Christina Schnürer（以上均属分子与实验外科系）、Uwe Appelt、Michael Mroz（FACS分选核心单元）以及Simon Völkl（FACS免疫监测核心单元）提供的出色技术支持。本工作获得了埃尔兰根大学医学中心临床研究跨学科中心（IZKF）向EN/MS提供的资助、德国研究基金会（DFG: FOR 2438, SP2）和Lutz基金会的资助，VSS获得了Robert-Pfleger基金会的资助，MS还获得了德国研究基金会的资助[DFG: KFO257（子项目4）、SFB 796（子项目B9）]。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
HBSS 1xGibco by Life Technologies14175-053
青霉素-链霉素Gibco by Life Technologies15140-122
两性霉素BGibco by Life Technologies15290-026
一次性手术刀FeatherNo. 23
gentleMACS octo 组织解离仪Miltenyi Biotec130-095-937
gentleMACS C管Miltenyi Biotec130-093-237
人肿瘤组织解离试剂盒Miltenyi Biotec130-095-929
DMEMGibco by Life Technologies21969-035
EGM-2-MV BulletKitLonzaCC-3202
细胞筛，100 µmFalcon352360
StemPro Accutase Gibco by Life TechnologiesA11105-01
自动细胞计数仪Coulter CounterZ1
Y-27632Sigma-AldrichY0503
CD31-FITCBD Pharmingen555445
CD144/VE-钙黏蛋白-PEBD Pharmingen560410
CD105-APCBD Pharmingen562408
牛皮来源明胶Sigma-AldrichG9391
FACS分选设备Beckman CoulterMoFlo XDP

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FACS CD31 VE CD105

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