方法文章

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

DOI：

10.3791/57402

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2018年4月18日

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1Public Health Research Institute, New Jersey Medical School, Rutgers, The State University of New Jersey

本文内容

摘要

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本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。

摘要

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结核病至今仍是全球发病和死亡的主要原因之一。迫切需要改进现有的药物治疗方案并开发新的治疗方法。结核病药物能否有效到达肺部肉芽肿内血管分布稀少的坏死区域（干酪样物质）并杀灭其中的细菌，是治疗成功的关键。因此，有效的治疗方案必须包含能够良好穿透干酪样物质的药物。目前用于定量生物组织中药物浓度的液相色谱-质谱（LC/MS）方法空间分辨率有限，难以准确测定坏死性肉芽肿等微小组织区域内药物的绝对浓度。本文介绍了一种将激光显微切割技术（LCM）与LC/MS定量相结合的实验方案。该技术可对肉芽肿干酪样核心、周围细胞病变区域以及未受累肺组织中的药物进行绝对定量，从而准确判断是否达到了杀菌药物浓度。除结核病研究外，该技术还可广泛应用于其他疾病组织中药物的空间分辨定量分析。

引言

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能够对药物浓度进行空间分辨和定量，是确定抗结核药物是否以杀菌浓度到达肺部病灶内细菌亚群的关键要求1。尤为重要的是确定药物是否能够渗透至病灶的坏死核心（称为干酪样物质），该区域通常含有最多数量的杆菌，且由于缺乏血管化，药物可能难以进入。

评估病灶渗透的传统方法包括对切除的肺部病灶进行匀浆，随后通过溶剂萃取并结合液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析，这些方法对目标药物具有高度的灵敏度和选择性。然而，这些方法的空间分辨率较差，仅限于原始匀浆组织的尺寸。基于质谱成像的技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）2,3、解吸电喷雾电离（DESI）4 或液体增强表面萃取5,6，可提供高空间分辨率的成像能力，但由于分析物在不同类型细胞或组织中存在离子抑制效应的不均一性以及萃取效率的差异，直接定量极为困难甚至无法实现7。此外，大多数直接组织质谱成像方法由于缺乏对内源性物质的色谱分离（这些物质会竞争电离），以及药物从组织中溶剂萃取效率较低，其固有灵敏度通常低于LC/MS。

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方案

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所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并获得美国国立过敏与传染病研究所（NIAID，NIH）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，贝塞斯达，马里兰州。

1. 动物实验与组织采集

本实验方案的这一部分描述了在生物安全等级3级（BSL3）条件下进行的动物实验操作与样本采集。详细的实验方案 结核分枝杆菌 兔类气溶胶感染程序及药物给药方案此前已有描述11,12.

  1. 使用仅鼻腔暴露的气溶胶系统，按照先前所述方法11，感染4至5月龄的新西兰白兔（雄性和雌性），菌株为M. tuberculosis HN878。
  2. 通过选定的给药途径给予实验药物（本示例中为乙胺丁醇），并在给药后2、6和24小时处死动物。首先，通过肌肉注射给予每公斤体重35 mg的氯胺酮和每公斤体重5 mg的赛拉嗪进行麻醉。等待10分钟后，通过夹捏尾巴和轻触眼睛来确认麻醉效果。若无反应，则以每4.5 kg体重1 mL的剂量，在2 mL无菌生理盐水中静脉注射戊巴比妥和苯妥英进行安乐死（参见材料表）。
    注意：这些时间点最适合覆盖乙胺丁醇的药代动力....

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结果

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LCM-LC/MS 方法的总体流程如图1所示。组织经γ射线灭菌后，所有后续步骤（从组织切片开始）均在非BSL3条件下进行。图2展示了结核病变组织在激光显微切割分离前后的活检切片。通过直接观察光学图像（无需参考相邻的组织学染色切片），即可清晰识别并分离结核病变中的坏死区域和细胞区域。切割过程可实现精准分离，对周围组织扰动极小；从病变区域中分离总计3百万µm2（3 mm2）的目标区域，全程约需1小时。

通过使用添加乙胺丁醇（Ethambutol, EMB）的肺组织匀浆评估了LCM-LC/MS方法的提取效率和稳定性（表1）。结果显示药物被完全提取，在解剖和提取过程中未发现药物稳定性问题。LCM-LC/MS的提取与定量方案进一步通过与已建立的LC/MS定量方法在相同.......

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讨论

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需要对肺结核病变内药物进行空间分辨的定量分析，以确定药物暴露是否达到对存在于不同病灶区域内的细菌群体具有杀菌作用的浓度。本文所述的激光捕获显微切割-液相色谱/质谱（LCM-LC/MS）方法仅需总共1至3张组织切片，即可实现对所有病灶区域（包括富含细菌的干酪样坏死物）中抗结核药物的绝对定量。传统的组织匀化及用于组织中药物定量的液相色谱/质谱（LC/MS）方法通常缺乏足够的空间特异性来区分特定的病灶区域；即使能够实现，手动提取过程中也极易导致细胞区域与坏死病灶区域之间的交叉污染。

LCM-LC/MS 方法相较于基于质谱成像的技术具有若干关键优势，其中最主要的是该方法具备完全定量的能力，以及由于通过色谱分离将药物与内源性干扰/抑制物质区分开，从而提高了LC/MS分析的灵敏度。然而，MALDI-MSI 能够提供更详细的药物分布空间信息。由于 MALDI-MSI 和 LCM-LC/MS/MS 均需相同的样品制备步骤来制备冷冻组织切片，因此这两种技术可对同一组织活检样本进行联用分析，既实现药物分布的高分辨率成像，又提供完整的定量数据。分析灵敏度要求更高的一个实例见于

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢 Paul O'Brien、Marizel Mina 和 Isabella Freedman 在动物实验方面的协助，感谢美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）的 Jacquie Gonzalez 和 Danielle Weiner 在激光显微切割前对兔组织进行γ射线照射的帮助，以及 Jansy Sarathy 在论文撰写方面的思路与建议。本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1174780）和美国国立卫生研究院共享仪器资助项目（1S10OD018072）的资金支持。我们感谢 Eliseo A. Eugenin 提供使用 Leica LMD 6500 显微镜的机会，并分享专业知识与建议。LMD 6500 显微镜的采购及后续维护由美国国家精神卫生研究所资助项目 MH096625、国家神经疾病与中风研究所 NS105584、PHRI 资金（资助对象：E.A.E）以及葛兰素史克（GSK）的资助（资助对象：E.A.E）共同支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
新西兰白兔CovanceN/A
HN878 结核分枝杆菌BEI 资源NR-13647
氯胺酮（Ketamine）100 mg/mL C3NHenry Schein 动物健康56344
Anased（赛拉嗪）100 mg/mLHenry Schein 动物健康33198
Euthasol（戊巴比妥钠和苯妥英钠）溶液Virbac710101
乙腈（LC-MS级）FisherA955-212
甲醇（LC-MS级）FisherA456-212
甲酸（LC-MS 级）FisherA117-50
水（LC-MS级）FisherW6212
0.2 mL 平盖 PCR 管康宁07-200-392
钢架，聚对苯二甲酸乙二醇酯膜徕卡11505151
高级磨砂载玻片Fisher12-544-2
96深孔板 2.0 mL PP RBFisherNC0363259
Zorbax SB-C8 色谱柱（4.6 × 50 mm；粒径，3.5 μm)安捷伦820631-001D
"拉链” 密封样品袋Fisher01-816-1B
<强>名称<强>公司<强>货号<强>评论
<强>仪器设备
CM1850 冷冻切片机Leica已停止Leica CM1860 是当前型号
激光显微切割系统 6500Leica已停止Leica LMD 6 是当前型号
安捷伦 1260 Infinity II 高效液相色谱仪安捷伦
API 4000 QTRAP 质谱仪Sciex

参考文献

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  1. Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
  2. Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tu....

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