本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。
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本文内容
摘要
摘要
结核病至今仍是全球发病和死亡的主要原因之一。迫切需要改进现有的药物治疗方案并开发新的治疗方法。结核病药物能否有效到达肺部肉芽肿内血管分布稀少的坏死区域（干酪样物质）并杀灭其中的细菌，是治疗成功的关键。因此，有效的治疗方案必须包含能够良好穿透干酪样物质的药物。目前用于定量生物组织中药物浓度的液相色谱-质谱（LC/MS）方法空间分辨率有限，难以准确测定坏死性肉芽肿等微小组织区域内药物的绝对浓度。本文介绍了一种将激光显微切割技术（LCM）与LC/MS定量相结合的实验方案。该技术可对肉芽肿干酪样核心、周围细胞病变区域以及未受累肺组织中的药物进行绝对定量，从而准确判断是否达到了杀菌药物浓度。除结核病研究外，该技术还可广泛应用于其他疾病组织中药物的空间分辨定量分析。
引言
能够对药物浓度进行空间分辨和定量，是确定抗结核药物是否以杀菌浓度到达肺部病灶内细菌亚群的关键要求1。尤为重要的是确定药物是否能够渗透至病灶的坏死核心（称为干酪样物质），该区域通常含有最多数量的杆菌，且由于缺乏血管化，药物可能难以进入。
评估病灶渗透的传统方法包括对切除的肺部病灶进行匀浆，随后通过溶剂萃取并结合液相色谱-质谱联用（LC/MS）分析，这些方法对目标药物具有高度的灵敏度和选择性。然而，这些方法的空间分辨率较差，仅限于原始匀浆组织的尺寸。基于质谱成像的技术，如基质辅助激光解吸电离（MALDI）2,3、解吸电喷雾电离（DESI）4 或液体增强表面萃取5,6，可提供高空间分辨率的成像能力，但由于分析物在不同类型细胞或组织中存在离子抑制效应的不均一性以及萃取效率的差异，直接定量极为困难甚至无法实现7。此外，大多数直接组织质谱成像方法由于缺乏对内源性物质的色谱分离（这些物质会竞争电离），以及药物从组织中溶剂萃取效率较低，其固有灵敏度通常低于LC/MS。
激光捕获显微切割（LCM）结合液相色谱-质谱（LC/MS）分析已常规用于分离和表征不同组织区域，以开展蛋白质组学研究8,9，并最近被用于药物暴露动物组织中的药物定量10。本文介绍了一种优化的实验方案，采用LCM结合LC/MS（LCM-LC/MS）分析技术，用于定量结核病（TB）药物在不同肉芽肿结构区室中的分布。在激光捕获显微切割过程中，紫外激光通过显微镜物镜聚焦至组织切片上，沿用户定义的路径切割并分离目标组织区域。对于重力辅助式LCM（本研究所采用的技术），组织切片被固定在一层薄的聚合物膜载玻片（PET或PEN）上，切割后的组织在载玻片下方的收集管帽中被捕获。随后从切除的组织中提取药物，并采用标准的LC/MS方法进行定量。所需收集的组织量最终取决于组织中预期的药物浓度以及LC/MS方法的检测灵敏度。对于以治疗剂量给药、并使用常规三重四极杆质谱仪分析的大多数药物而言，收集3百万µm2（3 mm2）的组织表面积已足够。
本方案描述了LCM-LC/MS技术所提供的空间分布分析与完全定量的强大结合，可提供结核肉芽肿各组分内的药物绝对浓度。该技术也可用于测定多种不同病变组织中的药物浓度，从而提供至关重要的药物发现与开发信息。
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方案
所有动物实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并获得美国国立过敏与传染病研究所（NIAID，NIH）动物实验管理和使用委员会（IACUC）的批准，贝塞斯达，马里兰州。
1. 动物实验与组织采集
本方案的这一部分描述了在生物安全三级（BSL3）条件下进行的动物实验操作与样本采集。详细的操作流程如下： 结核分枝杆菌 此前已描述过兔子的气溶胶感染程序及药物给药方案11,12.
- 使用仅暴露鼻腔的气溶胶系统，按照先前所述方法11，感染4至5月龄的新西兰白兔（雄性和雌性），菌株为M. tuberculosis HN878。
- 通过选定的给药途径给予实验药物（本示例中为乙胺丁醇），并在给药后2、6和24小时处死动物。首先，通过肌肉注射给予每公斤体重35 mg的氯胺酮和每公斤体重5 mg的赛拉嗪进行麻醉。等待10分钟后，通过夹捏尾巴和轻触眼睛来确认麻醉效果。若无反应，则以每4.5 kg体重1 mL的剂量，在2 mL无菌生理盐水中静脉注射戊巴比妥和苯妥英钠（见材料表）实施安乐死。
注意：这些时间点最适合覆盖乙胺丁醇的药代动力学曲线，若研究其他药物可能需要调整或优化。 - 使用镊子、剪刀和/或手术刀从胸腔中取出肺组织，切除包含大型坏死性肉芽肿的肺组织活检样本，确保周围保留未受累的肺组织（如先前所述3）。坏死性肉芽肿呈浅 beige 色，通常略微突出于周围红色或粉红色的肺组织。为便于冷冻切片，确保活检组织大小不超过2 × 1.5 × 1.5 cm。
- 使用镊子将活检组织放置于预先标记好的冷冻模具托盘上，使所需切面直接接触托盘底部。冷冻后，该接触面将形成一个平整的表面，用于后续冷冻切片。
- 在液氮蒸气中冷冻活检组织。将液氮倒入泡沫塑料容器中，深度约2英寸，并放入金属丝网架。网架应高出液氮表面，提供一个可放置组织托盘的平坦平台。盖上容器盖子，将组织放置其中冷冻10分钟，确保完全冻结。
- 取出组织托盘，迅速用铝箔包裹，放入单独标记的可密封塑料袋中并封口。转移至-80 °C冰箱中保存。
注意：步骤1.1至1.6均在BSL3条件下进行（包括所有动物操作以及感染器官和组织的处理）。肺组织活检样本需经3兆拉德伽马射线照射，以允许在BSL3 containment之外进行操作。若已建立批准的安全规程，可在BLS3设施内对未灭菌组织进行激光捕获显微切割。然而，本方案其余部分描述的是在BSL-2实验室中进行的后续处理步骤。
2. 组织切片
- 将冷冻切片机设定至所需的切片温度。将经γ射线辐照的肺活检组织从-80 °C储存环境中转移至冷冻切片机中，静置30分钟以平衡组织温度。注意：TB病灶活检组织的最佳切片温度为-20至-22 °C。
- 使用镊子将活检组织固定在冷冻切片机的样品头（chuck）上，用少量最佳切割温度粘合剂（OCT）将组织底部粘附于样品头。调整组织方向，使与冷冻模具底面接触的平坦面朝上，作为切片时的暴露表面。确保OCT不污染组织表面，以免干扰后续的质谱分析。
- 切取三片厚度为25 µm的组织切片，并贴附于PET膜载玻片上。轻轻将膜接触组织切片后移开。若施加压力过大，可能导致薄膜破裂。
- 在贴附前应避免过度操作载玻片，否则会导致PET膜带电，影响组织切片的贴附效果。确保膜载玻片保持在室温条件下，以利于组织的解冻贴附及成功粘附。
- 将载玻片从冷冻切片机中取出，静置空气中干燥3分钟。若不立即进行显微切割-液相色谱/串联质谱（LCM-LC/MS/MS）分析，应将载玻片密封于小型密封袋中，并转移至-80 °C保存，待后续切割使用。
- 切取相邻的另一组织切片，厚度为10–12 µm，并解冻贴附于标准玻璃载玻片上，用于苏木精-伊红（H&E）染色及对照。此时也可根据需要切取额外切片，用于其他组织化学染色（如用于观察结核分枝杆菌（MTB）的Ziehl-Neelsen染色）。
3. 显微解剖
- 从 -80 °C 保存环境中取出装有切片的密封袋，置于室温下平衡 5 分钟。
注意：若低温切片立即暴露于实验室环境中，组织表面将产生冷凝水，可能导致药物空间完整性的破坏。 - 开启显微镜和激光器（激光器需预热 5 - 10 分钟后方可开始切割）。将平盖 0.20 mL PCR 管装入样品架中。
- 从密封袋中取出切片，使用平板扫描仪对 PET 切片上的组织切片进行光学成像。
- 将切片放入切片架中（组织面向下），并通过显微镜软件为特定的肉芽肿感兴趣区域分配独立的收集管。通常包括“未受累肺组织”、“细胞型肉芽肿”和“干酪样坏死中心”（坏死中心），但具体区域可根据肉芽肿/活检样本的病理特征进行调整。
- 使用 5X 显微镜物镜对组织进行聚焦。该放大倍数可提供包含细胞区和坏死区在内的组织整体视野。在软件中选择标记为“干酪样坏死”的收集管，使其移动至组织下方对应位置。
- 输入所需的切割参数。对于 25 µm 厚的肺组织切片，典型设置为激光功率 30、速度 15、孔径 35（任意单位）。然而，具体参数可能因所用显微镜型号及激光器使用年限导致的功率衰减而有所不同。
- 选择“自由绘制”工具，使用鼠标或触控笔勾画出目标切割区域。软件将显示所选区域的表面积。为便于切割操作，建议单个区域面积不超过 500,000 µm2（0.5 mm2）。重复切割过程，直至收集管盖中累计收集面积达到 3 百万 µm2（3 mm2）。
- 偶尔，切割后的组织区域可能因静电吸附等原因仍粘附于周围膜上，未能落入收集管盖中。此时应在软件中手动选择并移除该区域，以从累计表面积中剔除。
- 选择“细胞型病灶”对应的管盖，按照步骤 3.7 所述方法收集总计 3 百万 µm2 的组织。
- 选择“未受累肺组织”对应的管盖，同样按照步骤 3.7 所述方法收集 3 百万 µm2 的组织。需注意，未受累肺组织中含有大量细支气管和肺泡腔隙，在定义切割区域时应仔细排除这些结构。
- 取下管盖架，小心取下每个管盖，密封并贴上标签。避免周围气流（如开门引起的空气扰动）影响切割后的组织样本。应立即进行后续分析，或于 -80 °C 保存，并在处理及 LCMS 分析前解冻。
4. 提取与液相色谱-质谱分析
- 配制含有乙胺丁醇-d10内标物的1:1乙腈/甲醇提取溶液。选择内标物时，应使用分析物药物的稳定同位素标记形式（如本实验中使用的氘代EMB），其质量位移应足够大，以避免分析物药物与内标物之间发生同位素串扰（通常至少为4道尔顿）。
注意：由于可用于制备匀浆标准品的对照组织非常有限，因此很难通过各类相应组织的匀浆液来制备标准品。作为向加标匀浆样品中制备标准品的替代方法，可通过将空白组织与待测化合物混合后进行提取来制备标准品。将与研究样本组织切片目标体积相匹配的一定体积的对照组织，直接与相当于某一特定浓度下所含待测化合物的量混合。 - 根据组织切片的表面积和厚度计算目标组织体积，并根据将加入标准品和质控样品的匀浆液体积，确定匀浆液所需的稀释倍数。以下以3百万µm2（3 mm2）的目标切割面积、25 µm厚度以及2 µL匀浆液体积为例说明计算过程。
- 假设组织密度为1 g/mL，通过称取50 mg对照组织并加入PBS缓冲液稀释，配制匀浆储备液（使用步骤4.2中计算出的26.67倍匀浆稀释倍数，稀释液体积为1.283 mL）。在珠磨匀浆仪上以1750 rpm转速对肺组织和PBS缓冲液进行珠磨匀浆5分钟。
- 将1 mg/mL的药物储备液用1:1乙腈/水稀释，配制用于标准曲线加标的标准溶液。根据加标体积和目标组织体积确定加标标准品的浓度。图示示例为使用10 µL加标体积配制100 ng/mL标准品。
- 从-80 °C冰箱中取出含有显微切割组织的离心管，置于室温平衡5分钟。
- 向含有显微切割组织的离心管中加入10 µL的1:1乙腈/水溶液和2 µL PBS缓冲液。
- 对于标准曲线管和质控管，向2 µL对照肺匀浆液中加入10 µL加标溶液。
- 向每根离心管中加入50 µL提取溶液。
- 每根离心管涡旋振荡5分钟，超声处理5分钟，然后在5000 RPM下离心5分钟，使每管中形成薄膜和组织沉淀。
- 将50 µL上清液转移至96孔深孔板中，并在每孔中额外加入50 µL去离子水进行稀释。
- 采用针对乙胺丁醇和乙胺丁醇-d10内标物优化的仪器参数进行LC/MS/MS分析（具体参数如先前文献12中详细描述）。
- 使用稀释倍数校正每个样本实际切割组织的精确量。
5. 方法验证
- 通过将1份肺组织、2份PBS缓冲液和3-4个钢珠混合，制备对照肺组织的匀浆。使用珠磨匀浆器以1750 rpm转速研磨肺组织和PBS缓冲液5分钟。
- 向匀浆中加入10 µL浓度为1 mg/mL的乙胺丁醇DMSO储备液至990 µL匀浆中，使终浓度达到10,000 ng/mL（10 mg/mL），涡旋混匀1分钟。
- 将匀浆倒入冷冻模具中，在干冰上快速冷冻5分钟，制备成冷冻匀浆块。
- 按照步骤2.1-2.5所述方法，从匀浆块中制备厚度为25 µm的切片。
- 按照步骤3.2-3.10中规定的方法分离目标组织区域。
- 向含有显微切割组织的各管中加入10 µL乙腈/水（1:1）溶液和2 µL PBS缓冲液。
- 向每根试管中加入50 µL提取液。按照步骤4.9-4.12建立标准曲线，并测定组织匀浆块中的药物浓度。
- 使用以下公式计算提取效率：
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结果
LCM-LC/MS 方法的总体流程如图1所示。在通过γ射线辐照对组织进行灭菌后，所有后续步骤（从组织切片开始）均在非BSL3条件下进行。图2展示了结核病灶组织在激光显微切割分离前后的病变活检切片。通过直接观察光学图像，即可清晰识别并分离结核病灶中的坏死区域和细胞区域（无需参考相邻的组织学染色切片）。切割过程可实现干净的切缘，对周围组织扰动极小，从病灶中分离每个目标区域约3百万µm2（3 mm2）的面积，总耗时约为1小时。
采用添加乙胺丁醇（EMB）的肺组织匀浆评估LCM-LC/MS方法的提取效率与稳定性（表1）。结果显示药物被完全提取，在解剖与提取过程中未发现药物稳定性问题。通过与已建立的LC/MS定量方法在相同组织上的结果进行比较，进一步验证了LCM-LC...
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讨论
需要对肺结核病变内药物进行空间分辨的定量分析，以确定药物暴露是否达到对存在于不同病灶区域内的细菌群体具有杀菌作用的浓度。本文所述的激光捕获显微切割-液相色谱/质谱（LCM-LC/MS）方法仅需总共1至3张组织切片，即可实现对所有病灶区域（包括富含细菌的干酪样坏死物）中抗结核药物的绝对定量。传统的组织匀化及用于组织中药物定量的液相色谱/质谱（LC/MS）方法通常缺乏足够的空间特异性来区分特定的病灶区域；即使能够实现，手动提取过程中也极易导致细胞区域与坏死病灶区域之间的交叉污染。
LCM-LC/MS 方法相较于基于质谱成像的技术具有若干关键优势，其中最主要的是该方法具备完全定量的能力，以及由于通过色谱分离将药物与内源性干扰/抑制物质区分开，从而提高了LC/MS分析的灵敏度。然而，MALDI-MSI 能够提供更详细的药物分布空间信息。由于 MALDI-MSI 和 LCM-LC/MS/MS 均需相同的样品制备步骤来制备冷冻组织切片，因此这两种技术可对同一组织活检样本进行联用分析，既实现药物分布的高分辨率成像，又提供完整的定量数据。分析灵敏度要求更高的一个实例见于
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Paul O'Brien、Marizel Mina 和 Isabella Freedman 在动物实验方面的协助，感谢美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所（NIH/NIAID）的 Jacquie Gonzalez 和 Danielle Weiner 在激光显微切割前对兔组织进行γ射线照射的帮助，以及 Jansy Sarathy 在论文撰写方面的思路与建议。本研究得到了比尔及梅琳达·盖茨基金会（OPP1174780）和美国国立卫生研究院共享仪器资助项目（1S10OD018072）的资金支持。我们感谢 Eliseo A. Eugenin 提供使用 Leica LMD 6500 显微镜的机会，并分享专业知识与建议。LMD 6500 显微镜的采购及后续维护由美国国家精神卫生研究所资助项目 MH096625、国家神经疾病与中风研究所 NS105584、PHRI 资金（资助对象：E.A.E）以及葛兰素史克（GSK）的资助（资助对象：E.A.E）共同支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 新西兰白兔 | Covance | N/A | |
| HN878 结核分枝杆菌 | BEI 资源 | NR-13647 | |
| 氯胺酮（Ketamine）100 mg/mL C3N | Henry Schein 动物健康 | 56344 | |
| Anased（赛拉嗪）100 mg/mL | Henry Schein 动物健康 | 33198 | |
| Euthasol（戊巴比妥钠和苯妥英钠）溶液 | Virbac | 710101 | |
| 乙腈（LC-MS级） | Fisher | A955-212 | |
| 甲醇（LC-MS级） | Fisher | A456-212 | |
| 甲酸（LC-MS 级） | Fisher | A117-50 | |
| 水（LC-MS级） | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL 平盖 PCR 管 | 康宁 | 07-200-392 | |
| 钢架，聚对苯二甲酸乙二醇酯膜 | 徕卡 | 11505151 | |
| 高级磨砂载玻片 | Fisher | 12-544-2 | |
| 96深孔板 2.0 mL PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 色谱柱（4.6 × 50 mm；粒径，3.5 μm) | 安捷伦 | 820631-001D | |
| "拉链” 密封样品袋 | Fisher | 01-816-1B | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>仪器设备 | |||
| CM1850 冷冻切片机 | Leica | 已停止 | Leica CM1860 是当前型号 |
| 激光显微切割系统 6500 | Leica | 已停止 | Leica LMD 6 是当前型号 |
| 安捷伦 1260 Infinity II 高效液相色谱仪 | 安捷伦 | ||
| API 4000 QTRAP 质谱仪 | Sciex |
参考文献
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重印与许可
