成年耳部皮肤全组织共聚焦显微镜观察：研究神经-血管分支形态发生及免疫细胞分布的模型系统

摘要

本文介绍了一种针对成年小鼠耳部皮肤全组织的高分辨率整体成像方法，该方法能够实现对外周神经和血管的分支形态发生及模式形成的可视化观察，同时可展示免疫细胞的分布情况。

摘要

本文介绍了一种用于研究成年小鼠耳部皮肤全组织三维神经-血管分支形态发生与模式形成以及免疫细胞在细胞水平上分布情况的全组织成像技术方案。对成年组织中周围神经和血管解剖结构的分析，有助于深入理解伤口愈合等病理条件下功能性神经-血管连接及神经-血管退行性变化的机制。作为一种信息丰富的模型系统，我们选择易于解剖获取的成年耳部皮肤作为研究对象。本方案操作简便且可重复，能够精确呈现整个皮肤组织中的各类细胞成分，包括周围神经（感觉轴突、交感轴突和施万细胞）、血管（内皮细胞和血管平滑肌细胞）以及炎性细胞。我们相信，该技术方案将为研究不同病理条件下成年耳部皮肤中周围神经与血管的形态学异常以及炎症反应提供重要途径。

引言

皮肤由三层组成：表皮、真皮和皮下组织。皮肤已被用作研究干细胞在发育过程中的维持、分化和形态发生，以及成体中的再生、肿瘤发生和炎症的模型系统。皮肤富含血管和神经支配，使得周围神经系统和血管系统的发育能够高度协调。

我们此前已展示了一种用于研究完整外周神经和血管（包括其细胞成分）的多重标记整体胚胎皮肤成像技术^1,2,3,4：感觉轴突、交感轴突、神经中的施万细胞、血管中的内皮细胞、周细胞以及血管平滑肌细胞（VSMCs）。在血管生成过程中，初级毛细血管网络经历强烈的血管重塑，进而发育形成具有层级结构的血管分支网络。在发育中的真皮/皮下组织中，动脉沿外周感觉神经分支，而静脉则在动脉旁侧形成。当层级血管网络被VSMCs充分包绕后，交感神经随之沿大直径血管延伸并实现神经支配^1,5,6。尽管发育中的神经系统与血管系统之间存在密切关联具有重要意义，但一个关键的科学问题仍是：在成人各种病理状态下，神经-血管网络会发生怎样的变化？要深入理解其发病机制，必须借助....

方案

本节中的所有实验均经国家心肺血液研究所（NHLBI）动物护理与使用委员会批准进行。

1. 成年小鼠耳部皮肤采集

1. 将成年小鼠置于密闭容器中，通过二氧化碳（CO₂）暴露实施安乐死，随后通过颈椎脱位确认死亡。
   注：本实验遵循美国国立卫生研究院（NIH）关于安乐死方法的指南。
2. 从基部解剖取下耳朵，并将其置于一个含有2 mL汉克斯平衡盐溶液（HBSS）的35 × 10 mm²培养皿中。用剪刀简单修剪毛发。
3. 小心地将耳后皮肤和耳前皮肤从中间的软骨上剥离。
   注：软骨附着于耳前皮肤。
4. 将耳后皮肤和耳前皮肤分别转移至24孔板中，每孔加入1 mL冰上预冷的新鲜4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS），并将皮肤在4% PFA中展平。
5. 在4 °C条件下，用含软骨的耳后和耳前皮肤固定1小时。
6. 在室温下，用1 mL PBS轻轻振荡洗涤耳后和耳前皮肤，每次5分钟，共洗涤3次。
7. 将带软骨的耳后和耳前皮肤转移至35 × 10 mm²培养皿底部。剪除折叠的基部区域，该区域含有脂肪组织和结缔组织。使用精细弯头镊子将软骨从耳前皮肤上剥离。
8. 使用精细弯头镊子小心去除耳后皮肤内侧的毛发、脂肪组织和结缔组织。保持皮肤湿润，随时滴加PBS。

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结果

对成年小鼠耳后皮肤（图1A）和耳前皮肤（图1B）进行免疫染色，所用抗体包括αSMA（红色）、Tuj1（绿色）和PECAM-1（蓝色）。耳后皮肤使用CD11b（红色）和MBP（绿色）抗体，联合Tuj1（蓝色）进行免疫染色，以研究神经-免疫分布情况（图2A）。在单细胞分辨率下检测到CD11b⁺炎症细胞（包括巨噬细胞）的分布（图2B）。

讨论

本方案描述了用于分析神经血管结构和免疫细胞分布的成年小鼠耳部皮肤全组织免疫组织化学成像方法。我们认为，该方法在研究分支形态发生、外周神经和血管的模式形成，以及包括免疫细胞和毛囊在内的皮肤组分的三维分布方面，具有多种实验优势。成像结果可通过图像分析软件进行量化，以进一步开展定量分析。

正确制备耳部皮肤对该实验方案的成功至关重要。首先，应在小鼠安乐死后尽快仔细解剖耳部皮肤。需将耳部皮肤的后侧从软骨上剥离。随后，在染色前应将软骨从前侧皮肤上完全剥离。其次，在封片前应轻柔而彻底地去除结缔组织、脂肪组织和毛发。由于皮肤表面存在外周神经，因此需小心操作以避免损伤神经。第三，应通过去除部分较厚的组织使耳部皮肤充分展开。最后，耳部皮肤应平整封片，避免产生气泡。

该方案的一个局限性在于，带有耳标穿孔的耳部皮肤不适合用于分析，因为耳标会造成孔洞或疤痕。因此，当需要分析多只小鼠时，必须采用除耳标以外的其他方法对小鼠进行识别，例如在尾部进行标记。

虽然已有文献报道可以使用高分辨率对感兴趣区域进行.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 倍磷酸盐缓冲液	KD Medical	RGE-3210	PBS，不含 Ca2+/Mg2+
Hank’s 平衡盐溶液	Gibco	14025-092	HBSS，含 Ca2+/Mg2+
16% 多聚甲醛	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA，固定剂，用 PBS 稀释
曲拉通 X-100	Sigma	X100	去垢剂
正常山羊血清	Gibco	16210064	封闭/洗涤缓冲液组分
正常驴血清	Jackson Immuno research	017-000-121	封闭/洗涤缓冲液组分
弯头精细镊子	Dumont	RS-5047
弯头镊子	Integra Miltex Vantage	V918-782, V918-784
滤器单元 0.45 mm	Thermo Scientific	157-0045	用于过滤
1 mL 注射器	Coviden	8881501400	用于过滤
注射器滤器单元 0.22 mm	Millex-GV	SLGVR04NL	用于过滤
ProLong Gold	Thermo Scientific	P36934	抗荧光淬灭封片剂
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	用于封固
解剖显微镜	Leica	MZ95
共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5
Photoshop CC 2017	Adobe		图像编辑软件
Illustrator CC 2017	Adobe		图像编辑软件
Image J	NIH		图像处理软件
抗 PECAM-1 (CD31) 抗体	Millipore	MAB1398Z	仓鼠 IgG，血管内皮细胞标志物，1:300
抗 PECAM-1 (CD31) 抗体	BD Pharmingen	553369	大鼠 IgG2a κ，血管内皮细胞标志物，1:300
与 Cy-3 偶联的抗-αSMA 抗体	Sigma	C6198	小鼠 IgG2a，血管平滑肌细胞标志物，1:500
抗 EphB1 抗体	Santa Cruz	sc-9319	山羊多克隆，静脉内皮细胞标志物，1:100
抗神经元特异性 III 类 β-微管蛋白 (Tuj1)	Abcam	AB18207	Tuj1，兔多克隆 IgG，全轴突标志物，1:500
抗 Tuj1 抗体	Covance	MMS-435P	小鼠 IgG2a，全轴突标志物，1:500
抗 MBP 抗体	Abcam	AB40390	兔多克隆 IgG，髓鞘形成标志物，1:200
抗酪氨酸羟化酶抗体	Chemicon	AB152	兔多克隆，交感神经元标志物，1:500
抗周围蛋白抗体	Chemicon	AB1530	兔多克隆，外周神经元标志物，1:1000
抗 CD11b 抗体	Bio-Rad	MCA74G	大鼠 IgG2b，炎症细胞标志物（巨噬细胞），1:50
抗 CD45 抗体	Thermo Fisher Scientific	14-0451-85	大鼠 IgG2b κ，全造血细胞标志物，1:500
抗 CD3 抗体	Bio-Rad	MCA1477T	大鼠 IgG1，免疫细胞标志物，1:100
抗 CD45R (B220) 抗体	Thermo Fisher Scientific	14-0452	大鼠 IgG2a κ，炎症细胞标志物，1:200
抗 GFP 抗体	Thermo Fisher Scientific	A11122	兔多克隆，1:300
抗 GFP 抗体	Abcam	Ab13970	鸡多克隆，1:500
抗-β-半乳糖苷酶抗体	Cappel	55976	兔多克隆，1:5000
抗 RFP 抗体	Abcam	Ab62341	兔多克隆，1:300
驴抗兔 IgG (H+L) Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A11034	兔多克隆二抗，1:250
驴抗仓鼠 IgG (H+L) Alexa 647	Jackson Immuno research	127-605-160	仓鼠多克隆二抗，1:250
驴抗大鼠 IgG (H+L) Alexa 594	Jackson Immuno research	112-585-167	大鼠多克隆二抗，1:250
驴抗小鼠 IgG2a Alexa 633	Thermo Fisher Scientific	A21136	小鼠 IgG2a 二抗，1:250