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方法文章

评估活体肠道中溶酶体的碱化 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/57414

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2018年4月13日

 , 
1Department of Biology, University of Saskatchewan

本文内容

摘要

使用 pH 敏感性活体染料 5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（cDCFDA）逐步检测 C. elegans 肠道内溶酶体酸性丧失的实验指南

摘要

线虫 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种广泛用于研究寿命和发育通路的模式系统。该系统的透明性、正向与反向遗传学分析的可行性、荧光标记蛋白构建的相对简便性，以及可通过显微注射导入早期胚胎或通过食物摄取整合到体内的荧光染料的使用，为相关研究提供了便利。E. coli 菌株 OP50）以标记细胞器（例如 9-二乙氨基-5H-苯并(a)吩噁嗪-5-酮和(3-{2-[(1H,1'H-2,2'-联吡咯-5-基-κN(1))亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-N-[2-(二甲氨基)乙基]丙酰胺基)(二氟)硼。本文介绍一种荧光pH敏感性染料的应用，该染料可标记肠道溶酶体，从而在活体线虫中直观显示溶酶体酸度的动态生理变化。本方案并不直接测量溶酶体pH值，而是旨在建立一种可靠的方法，用于评估具有生理相关性的溶酶体酸度变化。cDCFDA是一种可穿透细胞的化合物，在细胞内酯酶的作用下水解后转化为荧光发色团5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素（cDCF）。cDCF在溶酶体内发生质子化，从而被滞留并在此类细胞器中积累。由于其pKa值较低（4.8），该染料已被用作酵母中的pH传感器。本文描述了将cDCFDA作为食物添加剂用于评估线虫肠道溶酶体酸度的方法 秀丽隐杆线虫 该技术可用于在活体动物中检测碱化的溶酶体, 具有广泛的实验应用，包括衰老、自噬和溶酶体生物发生等方面的研究。

引言

蛋白质聚集体的出现被广泛认为是真核细胞衰老的一个标志性特征1,2,3，其形成被认为是驱动细胞衰老的主要因素之一4,5,6,7。越来越多的证据表明，随着细胞老化，蛋白质分解代谢功能受损，导致蛋白质聚集增加。衰老细胞中蛋白水解功能的崩溃涉及自噬功能受损8以及蛋白酶体介导的蛋白质降解能力下降9。最后，老年细胞中不可逆的蛋白质氧化水平升高，进一步损害了蛋白质的分解代谢10。

自噬最初被认为是一种非选择性降解受损蛋白质的批量降解过程，但近期研究表明，自噬对那些无法通过其他蛋白质清除机制降解的蛋白质聚集体和功能失调的细胞器具有高度选择性的分解作用11。在自噬过程中，受损和聚集的蛋白质被包裹进一种称为自噬体的双层膜囊泡中。随后，该自噬体与被称为溶酶体的酸性细胞器融合，导致自噬体内容物的降解12。溶酶体代表了自噬通路的终点，并参与多种细胞过程，如膜修复、转录调控和营养感知，凸显其在细胞稳态中的核心作用（详见参考文献13综述）。多项研究已表明，溶酶体功能随年龄增长而下降与多种神经退行性疾病相关13。相应地，在老年细胞中恢复溶酶体功能可延缓衰老相关表型的出现14,15。对溶酶体内腔环境组成的研究提示，老年细胞中溶酶体功能的衰退并非源于溶酶体蛋白酶生成减少16。相反，有研究提出，溶酶体内酸性环境的丧失——这是其酶活性的关键前提——可能是溶酶体介导的蛋白水解能力下降的根本原因17。为了能够深入探究这一假说，开发可在活细胞中以可重复且一致的方式检测溶酶体pH动态变化的试剂和实验方案至关重要。

肠道的 秀丽隐杆线虫 是蠕虫体内的主要代谢组织，在系统稳态和寿命调控中起关键作用。我们已建立检测蠕虫肠道溶酶体腔内酸性变化的实验方法，以研究溶酶体介导的蛋白质降解在衰老过程中的作用。尽管pH敏感型荧光探针此前已被用于 秀丽隐杆线虫 用于标记肠道溶酶体，目前尚未建立可检测溶酶体pH值微小升高的有效方案 体内18. 在此，我们提供一种可用于检测肠道细胞中溶酶体酸性丧失的实验方案 秀丽隐杆线虫 采用一种简单便捷的喂养方案，将pH敏感型荧光染料（cDCFDA）加入OP50食物中。

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方案

1. 染色并成像肠道溶酶体

  1. 接种了OP50的线虫生长培养基（NGM）平板
    1. 按照推荐方案制备NGM平板19 将培养板保持密闭状态，在室温下干燥2天。
    2. 将OP50细菌接种于无菌的Luria肉汤（LB）培养基中，在37 °C条件下于摇床培养箱或水浴中培养36小时，或直至OD值达到0.2至0.4之间。避免使用OD值高于0.4的细菌培养物。 >1 或 OD <0.2.
    3. NGM 平板干燥后，取一滴（约 30 µL）OP50 菌液置于平板中央，然后将菌液涂布成约 2 cm × 2 cm 的菌斑。
      注意：剩余的 OP50 接种物可在 4 °C 下保存长达一个月。
    4. 将OP50平板倒置，待接种物干燥后（约10至15分钟），于37 °C培养36小时。
    5. 36小时后，从培养箱中取出培养板，置于4 °C保存，以备后续使用。
      注意：平板在 4 °C 下可保存长达 1 个月。
  2. 向 OP50 中添加 cDCFDA
    1. 为在OP50平板上添加cDCFDA，用二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM cDCFDA工作液。cDCFDA溶液需避光保存于-20 °C，以备后续使用。
    2. 将100 µL 10 mM cDCFDA溶液轻柔地滴加至2 cm × 2 cm的OP50菌苔表面，使整个菌苔均匀覆盖cDCFDA。
      注意：必须确保OP50菌斑完全被cDCFDA覆盖。如有需要，每块平板最多可使用150 µL的cDCFDA。同时必须注意cDCFDA溶液不能超出OP50菌斑的边界，因为溢出菌斑区域的cDCFDA将无法被食物吸收，导致染色强度降低。
    3. 将OP50平板置于实验台上的暗盒中，直至所有cDCFDA溶液被细菌菌膜完全吸收（通常约25至30分钟）。
  3. 使用cDCFDA对线虫进行染色
    1. 一旦cDCFDA完全渗透OP50菌斑，每块培养皿放置不超过20条线虫，将培养皿倒置于20 °C孵育至少14小时。
      注意：建议将cDCFDA板置于不透明盒子中，以尽量减少光照暴露。
    2. 为控制不同实验间的摄入差异并标准化cDCFDA信号，建议使用3-{2-[(1H,1'H-2,2'-联吡咯-5-基-κN(1))亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-N-[2-(二甲氨基)乙基]丙酰胺基(二氟)硼（2.5 µL新鲜配制的1 mM溶液）进行共染色。该试剂为一种酸嗜性弱碱荧光染料，其荧光信号在酸性pH范围内基本保持稳定（参见 材料表 用于试剂的通用名称。
      注意：染色时间不得少于14小时，否则可能导致cDCFDA染色强度不足，从而对溶酶体pH产生错误判断。
  4. 制备显微镜载玻片
    1. 在光滑的平面上（如镜子）放置两条平行的标签胶带，间距约为 3 英寸图1).
    2. 用疏水喷雾剂涂抹镜面，并擦去多余的液体。
    3. 融化2%琼脂糖（溶于蒸馏H2O）在微波炉中加热至完全融化，然后在两条胶带之间滴加50 µL琼脂糖，并迅速用显微镜载玻片覆盖液滴，使载玻片与胶带垂直。待琼脂糖凝固并在载玻片下形成圆形垫状结构后，将载玻片翻转，加入10至15 µL的5 mM叠氮化钠（NaN3) 加到琼脂糖垫上。
      注：NaN3 是一种细胞色素C抑制剂，在低浓度下可逆地麻醉线虫，使其在成像过程中不会移动。
    4. 从补充了cDCFDA的OP50平板上挑选线虫，转移至不含OP50的干净NGM平板上。让线虫活动数秒钟，以去除体表大部分OP50，随后将线虫转移至含有5 mM叠氮化钠的琼脂糖垫上。
    5. 立即用盖玻片覆盖琼脂糖垫。放置盖玻片时务必轻柔，避免施加过大压力，以免导致线虫破裂。
      注意：OP50 细菌在添加 cDCFDA 后通过显微镜观察时会产生荧光，因此在将线虫转移至含有叠氮化钠的琼脂糖垫之前，应尽可能彻底清洗线虫。若需处理超过 6 个品系时 秀丽隐杆线虫 （包括N2野生型对照），建议将样品以每批6个为一组进行制备，以确保线虫在琼脂糖垫上不会干燥。在某些品系中，由于盖玻片的压力，长时间后阴门可能开始破裂，因此需合理规划实验步骤。
  5. 共聚焦显微镜
    注意：某些显微镜具有内置功能，可自动增强荧光强度以补偿荧光信号的波动。此类显微镜可能不适用于cDCFDA染色的线虫成像，因为它们会固有地增强样品的荧光强度。
    1. 在标准共聚焦显微镜上进行成像，cDCFDA 的激发/发射波长设置为 488/530 nm。采集肠道溶酶体的单层平面图像（非 Z 堆栈），仅选择处于最佳焦距（信号强度最大）的溶酶体用于强度定量分析。
      注意：可能由于染料供应的差异，咽部后方肠细胞的溶酶体对cDCFDA的染色强度保持稳定，不受基因型或年龄影响，因此应谨慎避免对这些细胞中的溶酶体进行成像。
    2. 首先对载玻片上含有两天大的野生型 N2 种虫进行成像。在此过程中，调整共聚焦成像参数，如激光功率、针孔和光圈，以确保 cDCFDA 染色强度未过饱和。
      注意：一旦设定这些参数，在当天成像的整个过程中不得更改。
    3. 使用60倍物镜拍摄线虫肠道单层的1024 × 1024像素图像（每条线虫拍摄3至4张图像）。
      注意：线虫中cDCFDA的发射光谱将在520 nm处呈现一个明显的单峰，与其报道的荧光光谱一致20，提供一种与肠道自发荧光明显不同的特异性信号读出图3).
    4. 将原始共聚焦图像（.lsm 文件）按各通道导出为 .tiff 文件。
    5. 接下来，打开 ImageJ 并单击 文件 | 打开 打开待量化的图像文件。图像加载后，使用 ImageJ 中的椭圆形选择工具选取一个感兴趣区域（ROI）。
    6. 随后，单击 分析| 测量 量化该 ROI 的荧光强度。每张图像中选择 4–5 个不同且处于焦平面上的溶酶体，计算每个感兴趣区域（ROI）的平均相对荧光强度。
    7. 对每张图像，在溶酶体之间的肠区区域测量背景荧光强度。将溶酶体荧光强度值减去背景荧光强度值。
    8. 总共为每种待测品系收集约 30 至 50 个独立的标准化 cDCFDA 荧光强度值（对应 6 至 10 只动物）。使用这些数据，通过适当的统计学软件绘制箱形图（box and whisker plot）。
      注意：染色结果可能因温度、孵育时间以及动物整体健康状况/年龄等因素而有显著差异，因此荧光强度的比较仅在同一次染色实验中处理的样本之间具有可比性。因此，每次染色实验都必须同时处理对照样本。计算统计学差异（t使用任何合适的统计软件进行检验。
    9. 按顺序成像同一次实验（同一天染色）的所有菌株，注意不要更改任何成像参数。

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结果

cDCFDA 以 pH 依赖性方式标记溶酶体，其低 pKa 值以及易于被溶酶体摄取的特点使其成为理想的 pH 传感器21。cDCFDA 的染色强度与溶酶体 pH 值呈反比关系（即 pH 值降低时染色强度增加）18,22。在用 20 mM 氯喹（一种溶酶体酸化抑制剂）处理的动物，以及在溶酶体膜上缺乏 v-ATPase（负责质子导入的蛋白质复合物）的线虫中，cDCFDA 信号始终较弱22。在评估其他遗传背景或处理条件下 cDCFDA 染色水平的相对变化时，这些是重要的对照实验。

我们还发现cDCFDA处理对线虫的适应性或生育能力没有明显影响（数据未显示）。利用该方案，我们鉴定出在生殖后期的野生型线虫溶酶体中存在内源性的酸性下降现...

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讨论

多种细胞和分子事件参与衰老过程，并受到生活史特征和遗传因素的影响。我们最近的一项研究22表明，生殖周期通过调控溶酶体pH动态，在控制体细胞适应性方面发挥重要作用。我们发现，在动物 actively reproduction 期间，v-ATPase 转录水平上调，促进溶酶体介导的蛋白质降解，从而维持溶酶体的酸性环境。生殖结束后，v-ATPase 表达下降，溶酶体趋于碱化，细胞内蛋白质聚集体随之积累。

已发现溶酶体酸化功能受损的疾病由v-ATPase活性改变引起，而脑内v-ATPase功能下降也被认为是多种神经退行性疾病的基础23。我们的结果进一步支持v-ATPase功能受损是细胞衰老和老化的原因之一这一假说24。

衰老细胞的一个细胞学特征是错误折叠和聚集的蛋白质在老年细胞中逐渐形成1,

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

我们感谢Caenorhabditis遗传中心提供菌株，感谢自然科学与工程研究理事会（NSERC）以及加拿大创新基金会（CFI）提供的经费支持。我们感谢陈丽珍博士（德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校细胞系统与解剖学系）允许我们无限制使用其实验室设施开展所有C. elegans实验，同时感谢王兴博士（德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校光学成像中心副主任）在共聚焦显微镜使用方面提供的协助。我们还感谢迈伦·伊格纳修斯博士为本视频拍摄工作所提供的支持与鼓励。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
OP50（E. coli)秀丽隐杆线虫遗传学中心在线订购地址：https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-羧基-2’,7’二氯荧光素二乙酸酯 ThermoFisherC369通常称为cDCFDA
9-二乙氨基-5H-苯并(a)吩噁嗪-5-酮和(3-{2-[(1H,1'H-2,2'-联吡咯-5-基-κN(1))亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-N-[2-(二甲氨基)乙基]丙酰胺基)(二氟)硼赛默飞世尔科技L7528通常称为 Lysotracker Red
共聚焦显微镜（例如 Zeiss LSM 510）
ImageJ免费下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB肉汤粉末赛默飞世尔科技22700041
Bacto 琼脂SigmaA5306-1KG
NaClSigmaS9888
Bacto PeptoneFisher ScientificS71604
胆固醇粉末SigmaC3045 
CaCl2Sigma449709
MgSO4SigmaM7506
K3PO4SigmaP5629
叠氮化钠SigmaS2002
DMSOSigmaD8418
显微镜载玻片VWR48311-703
盖玻片ThermoFisher3406
琼脂糖SigmaA6013
培养箱
镜子或其他光滑平面表面

参考文献

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