评估活体肠道中溶酶体的碱化 秀丽隐杆线虫

摘要

使用 pH 敏感性活体染料 5(6)-羧基-2',7'-二氯荧光素二乙酸酯（cDCFDA）逐步检测 C. elegans 肠道内溶酶体酸性丧失的实验指南

摘要

线虫 秀丽隐杆线虫 (秀丽隐杆线虫是一种广泛用于研究寿命和发育通路的模式系统。该系统的透明性、正向与反向遗传学分析的可行性、荧光标记蛋白构建的相对简便性，以及可通过显微注射导入早期胚胎或通过食物摄取整合到体内的荧光染料的使用，为相关研究提供了便利。E. coli 菌株 OP50）以标记细胞器（例如 9-二乙氨基-5H-苯并(a)吩噁嗪-5-酮和(3-{2-[(1H,1'H-2,2'-联吡咯-5-基-κN(1))亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-N-[2-(二甲氨基)乙基]丙酰胺基)(二氟)硼。本文介绍一种荧光pH敏感性染料的应用，该染料可标记肠道溶酶体，从而在活体线虫中直观显示溶酶体酸度的动态生理变化。本方案并不直接测量溶酶体pH值，而是旨在建立一种可靠的方法，用于评估具有生理相关性的溶酶体酸度变化。cDCFDA是一种可穿透细胞的化合物，在细胞内酯酶的作用下水解后转化为荧光发色团5-(和-6)-羧基-2',7'-二氯荧光素（cDCF）。cDCF在溶酶体内发生质子化，从而被滞留并在此类细胞器中积累。由于其pKa值较低（4.8），该染料已被用作酵母中的pH传感器。本文描述了将cDCFDA作为食物添加剂用于评估线虫肠道溶酶体酸度的方法 秀丽隐杆线虫 该技术可用于在活体动物中检测碱化的溶酶体, 具有广泛的实验应用，包括衰老、自噬和溶酶体生物发生等方面的研究。

引言

蛋白质聚集体的出现被广泛认为是真核细胞衰老的一个标志性特征^1,2,3，其形成被认为是驱动细胞衰老的主要因素之一^4,5,6,7。越来越多的证据表明，随着细胞老化，蛋白质分解代谢功能受损，导致蛋白质聚集增加。衰老细胞中蛋白水解功能的崩溃涉及自噬功能受损⁸以及蛋白酶体介导的蛋白质降解能力下降⁹。最后，老年细胞中不可逆的蛋白质氧化水平升高，进一步损害了蛋白质的分解代谢¹⁰。

自噬最初被认为是一种非选择性降解受损蛋白质的批量降解过程，但近期研究表明，自噬对那些无法通过其他蛋白质清除机制降解的蛋白质聚集体和功能失调的细胞器具有高度选择性的分解作用¹¹。在自噬过程中，受损和聚集的蛋白质被包裹进一种称为自噬体的双层膜囊泡中。随后，该自噬体与被称为溶酶体的酸性细胞器融....

方案

1. 染色并成像肠道溶酶体

1. 接种了OP50的线虫生长培养基（NGM）平板
   1. 按照推荐方案制备NGM平板¹⁹ 将培养板保持密闭状态，在室温下干燥2天。
   2. 将OP50细菌接种于无菌的Luria肉汤（LB）培养基中，在37 °C条件下于摇床培养箱或水浴中培养36小时，或直至OD值达到0.2至0.4之间。避免使用OD值高于0.4的细菌培养物。 >1 或 OD <0.2.
   3. NGM 平板干燥后，取一滴（约 30 µL）OP50 菌液置于平板中央，然后将菌液涂布成约 2 cm × 2 cm 的菌斑。
      注意：剩余的 OP50 接种物可在 4 °C 下保存长达一个月。
   4. 将OP50平板倒置，待接种物干燥后（约10至15分钟），于37 °C培养36小时。
   5. 36小时后，从培养箱中取出培养板，置于4 °C保存，以备后续使用。
      注意：平板在 4 °C 下可保存长达 1 个月。
2. 向 OP50 中添加 cDCFDA
   1. 为在OP50平板上添加cDCFDA，用二甲基亚砜（DMSO）配制10 mM cDCFDA工作液。cDCFDA溶液需避光保存于-20 °C，以备后续使用。
   2. 将100 µ....

结果

cDCFDA 以 pH 依赖性方式标记溶酶体，其低 pKa 值以及易于被溶酶体摄取的特点使其成为理想的 pH 传感器²¹。cDCFDA 的染色强度与溶酶体 pH 值呈反比关系（即 pH 值降低时染色强度增加）^18,22。在用 20 mM 氯喹（一种溶酶体酸化抑制剂）处理的动物，以及在溶酶体膜上缺乏 v-ATPase（负责质子导入的蛋白质复合物）的线虫中，cDCFDA 信号始终较弱²²。在评估其他遗传背景或处理条件下 cDCFDA 染色水平的相对变化时，这些是重要的对照实验。

我们还发现cDCFDA处理对线虫的适应性或生育能力没有明显影响（数据未显示）。利用该方案，我们鉴定出在生殖后期的野生型线虫溶酶体中存在内源性的酸性下降现.......

讨论

多种细胞和分子事件参与衰老过程，并受到生活史特征和遗传因素的影响。我们最近的一项研究²²表明，生殖周期通过调控溶酶体pH动态，在控制体细胞适应性方面发挥重要作用。我们发现，在动物 actively reproduction 期间，v-ATPase 转录水平上调，促进溶酶体介导的蛋白质降解，从而维持溶酶体的酸性环境。生殖结束后，v-ATPase 表达下降，溶酶体趋于碱化，细胞内蛋白质聚集体随之积累。

已发现溶酶体酸化功能受损的疾病由v-ATPase活性改变引起，而脑内v-ATPase功能下降也被认为是多种神经退行性疾病的基础²³。我们的结果进一步支持v-ATPase功能受损是细胞衰老和老化的原因之一这一假说²⁴。

衰老细胞的一个细胞学特征是错误折叠和聚集的蛋白质在老年细胞中逐渐形成^1,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
OP50（E. coli)	秀丽隐杆线虫遗传学中心		在线订购地址：https://cgc.umn.edu/strain/OP50
5(6)-羧基-2’,7’二氯荧光素二乙酸酯	ThermoFisher	C369	通常称为cDCFDA
9-二乙氨基-5H-苯并(a)吩噁嗪-5-酮和(3-{2-[(1H,1'H-2,2'-联吡咯-5-基-κN(1))亚甲基]-2H-吡咯-5-基-κN}-N-[2-(二甲氨基)乙基]丙酰胺基)(二氟)硼	赛默飞世尔科技	L7528	通常称为 Lysotracker Red
共聚焦显微镜（例如 Zeiss LSM 510）
ImageJ			免费下载地址：https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LB肉汤粉末	赛默飞世尔科技	22700041
Bacto 琼脂	Sigma	A5306-1KG
NaCl	Sigma	S9888
Bacto Peptone	Fisher Scientific	S71604
胆固醇粉末	Sigma	C3045
CaCl2	Sigma	449709
MgSO4	Sigma	M7506
K3PO4	Sigma	P5629
叠氮化钠	Sigma	S2002
DMSO	Sigma	D8418
显微镜载玻片	VWR	48311-703
盖玻片	ThermoFisher	3406
琼脂糖	Sigma	A6013
培养箱
镜子或其他光滑平面表面