我们介绍了一种基于活动性监测的高通量睡眠测量方法，该方法通过动物在栖息笼内的活动情况进行睡眠评估。与传统的基于脑电图（EEG）的方法相比，该方法具有多项优势。该方法在总睡眠时间的测定方面已得到充分验证，可作为监测人类疾病啮齿类动物模型中睡眠状况的有力工具。
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本文内容
摘要
摘要
传统上，睡眠通过脑电图（EEG）进行监测。在啮齿类动物中进行EEG研究需要手术植入电极，并经历较长的恢复期。进行EEG记录时，动物需连接至接收器，从而在头部固定装置上形成一种非自然的束缚。EEG监测耗时较长，对动物存在风险，且并非完全自然的睡眠测量环境。若能采用替代方法检测睡眠，尤其是以高通量方式进行检测，将极大推动睡眠研究领域的发展。本文介绍一种经过验证的基于活动性监测的笼内睡眠检测方法。先前研究表明，通过该方法评估的睡眠与传统基于EEG的睡眠定义具有高度一致性。尽管该方法在总睡眠时间的测定上已得到验证，但需注意的是，睡眠片段持续时间的评估仍应采用时间分辨率更高的EEG方法。此外，EEG还可区分快速眼动（REM）睡眠与非REM睡眠，从而提供关于睡眠具体特征的更详细信息。尽管如此，基于活动性的睡眠判定方法仍可用于分析多日无干扰的睡眠情况，并评估睡眠对急性事件（如应激）的反应。本文展示了该系统检测小鼠对每日腹腔注射反应的能力。
引言
睡眠在恢复机体和大脑日常觉醒所承受的负担方面具有重要作用1。研究表明，睡眠在记忆保持和大脑整体可塑性中发挥着作用1。脑电图（EEG）是检测睡眠的金标准2。在啮齿类动物中，EEG监测需要通过手术将电极固定在头帽装置上进行植入，之后动物需要一段时间恢复2。恢复后，将动物连接至记录设备，并给予另一段适应期2。由于这些必要的恢复和适应阶段，EEG监测耗时且费力，难以大规模开展。此外，电极植入手术本身对动物存在固有风险。最后，EEG研究中用于睡眠分期的数据分析也非常繁琐。一种替代性的、非侵入性且高通量的睡眠监测方法将极大促进啮齿类动物睡眠研究。
一种基于活动的笼内监测系统可用于检测睡眠，从而克服了脑电图（EEG）研究的局限性。其基本原理是：不活动的动物很可能处于睡眠状态。已有研究表明，连续40秒的静止（以10秒为时间段进行分段统计）作为睡眠指标，与脑电图测量结果具有高度一致性（一致性达88–94%）3。笼内监测系统可用于大规模动物群体的研究，且所需准备时间极短。我们已证实，动物在该系统中进行单只饲养时，约需一天时间即可适应4，相比之下，脑电图研究则需要数周....
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方案
所有实验程序均经国家精神卫生研究所动物护理与使用委员会批准，并依照美国国立卫生研究院关于动物护理与使用的指南进行。
1. 设置睡眠检测装置
- 购买所需数量的设备和软件。
- 按照说明设置监测系统。
- 将探测器与发射器相对放置。确保红外光束朝内，并在同一高度对齐。
- 使用提供的螺丝将探测器和发射器固定在金属支架的指定高度。调整高度时，应使笼内垫料位于红外光束水平以下，同时确保光束高度能够准确检测动物活动。由此形成的内部区域为 27 cm × 32 cm（10.625 in × 12.75 in）。
- 如需更多螺丝，可在五金店另行购买（6-32 ¼ in Pan Head Screw）。
- 将每个探测器与对应的发射器连接。将发射器连接至配套的集线器，再将集线器连接至接收器。对 x 轴和 y 轴两个方向均执行此操作。所有设备设置均需重复此步骤。
- 使用提供的 USB 集线器将接收器连接至计算机。
2. 软件设置
- 安装分析软件，并选择提供的硬件配置文件作为默认设置。硬件配置文件仅可由公司进行更改。
- 点击 文件 | 打开实验配置，打开默认实验....
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结果
为了确定每日注射对睡眠的影响以及动物是否会对注射产生适应性，我们在连续14天内每天上午9:00（光照周期始于上午6:00）进行腹腔注射，并记录12只动物的睡眠持续时间 Fmr1 敲除 C57Bl/6J 小鼠。我们采用被试内设计，对每只动物连续 4 天（第 1–4 天）注射生理盐水，随后连续 10 天（第 5–14 天）注射 30% 环糊精。选择环糊精是因为其可用于溶解疏水性化合物以进行药物给药，而我们关注的是溶剂注射对小鼠睡眠的影响。鉴于记录时间较长，研究期间我们每周更换两次笼具。换笼时间与指定日期的注射时间同步进行。我们报告了在 14 天注射和换笼期间，光照期和黑暗期的平均睡眠持续时间百分比图1）。动物未接受在无注射条件下对睡眠装置的额外适应期。我们发现相位与天数之间存在显著的交互作用（F = 16.463）（p < 0.001），表明在14天期间，光照期与黑暗期的睡眠时长变化存在差异。 事后检验-测试结果显示，在光照阶段，第1天的睡眠时长与几乎所有其.......
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讨论
本文介绍一种基于动物在笼内活动监测的非侵入性、高通量睡眠时长测定方法。该方法对总睡眠时间的评估已通过脑电图（EEG）研究验证3。基于活动的笼内监测操作简便、无创，适用于大量动物的群体研究。其局限性在于无法提供有关睡眠的详细信息（如睡眠片段持续时间及睡眠阶段）。
该分析方法的潜在缺陷较容易被发现。研究过程中必须确保没有任何光束被遮挡，这种情况可能因笼具中某区域垫料堆积而发生。 可通过将垫料高度限制在3 mm以内并移除额外的筑巢材料来最大程度减少此类问题。该厚度的垫料足以覆盖笼底，且研究表明低体积垫料不会影响小鼠的应激水平17。额外的筑巢材料也可能干扰光束的通畅性，因此不应提供。 在实验设置过程中，还需确保所有光束正常工作，并在结束研究和提取数据前检查笼具。若某根光束出现故障，可能导致睡眠时长被高估。在数据分析阶段，可通过仔细查看CSV文件来识别光束故障或遮挡情况。若某一轴向上出现大量计数而另一轴向上无任何计数，表明其中一组光束可能处于故障或被遮挡状态。这可能是由于对准问题（探测器与发射器未正确对.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨感谢美国国立卫生研究院（NIH）研究员编辑委员会提供的编辑协助。本研究由美国国家精神卫生研究院（NIMH）院内研究项目（项目编号：ZIA MH00889）资助。RMS 还获得了 FRAXA 博士后奖学金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 综合动物实验室监测系统（CLAMS） | Columbus Instruments | 用于分析睡眠时长的设备和软件 | |
| Captisol 研究级 | Captisol | RC-0C7-100 | 用于溶解疏水性化合物的 Captisol |
| 30 G BD 针头，1/2 英寸 | BD | 305106 | 用于注射的针头 |
| BD 一次性注射器 | Fisher | 14-823-30 | 用于注射的注射器 |
| B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Labs | 3025 | Fmr1 基因敲除小鼠 |
| Super Mouse 750 小鼠笼具 | Lab Products, Inc. | 小鼠的饲养笼 | |
| SANI-Chips 垫料 | PJ Murphys | 小鼠用垫料 |
参考文献
- Picchioni, D., Reith, R. M., Nadel, J. L., Smith, C. B. Sleep, plasticity and the pathophysiology of neurodevelopmental disorders: the potential roles of protein synthesis and other cellular processes. Brain sciences. 4, 150-201 (2014).
- Ingvar, M. C., Maeder, P., Sokoloff, L., Smith, C. B.
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