使用宽场高内涵分析系统对荧光标记组织进行自动载玻片扫描与分割

摘要

本文介绍了一种利用宽场高内涵分析系统（WHCAS）对载玻片上荧光标记组织进行自动分割的实验方案。该方案在涉及生物组织中荧光标记物定量的各个领域均具有广泛应用，包括生命科学、医学工程和健康科学。

摘要

自动化的载玻片扫描及荧光标记组织的分割是分析整张载玻片或大组织切片最高效的方法。然而，许多研究人员花费大量时间和资源开发并优化仅适用于自身实验的工作流程。本文介绍了一种适用于拥有宽场高内涵分析系统（WHCAS）的研究人员的实验方案，可用于成像任何置于载玻片上的组织，并可通过配套软件中预设模块进行个性化定制。尽管该系统最初并非为载玻片扫描设计，但本文详述的步骤使得在 WHCAS 中获取可用于导入配套软件的载玻片扫描图像成为可能。本文以脑肿瘤载玻片的自动分割为例进行演示，但任何荧光标记的细胞核或细胞质标志物均可实现自动分割。此外，还可运行多种其他定量分析软件模块，包括蛋白质定位/转位、细胞增殖/活力/凋亡以及血管生成等检测。该技术将节省研究人员的时间与精力，并建立一套用于载玻片分析的自动化流程。

引言

在载玻片上对荧光标记的组织进行准确且精确的定量分析，是许多科学领域中备受关注的技术。然而，研究人员通常需要手动计数样本，或花费大量时间开发复杂的自动化方法来实现这一目标。本文提供了一种利用WHCAS及其配套软件对载玻片上的细胞进行自动扫描和定量分析的实验方案，以冷冻人脑肿瘤切片中的固有免疫细胞为例进行说明。该配套软件提供了多种内置且可自定义的模块，涵盖从神经突生长计数到细胞类型区分等多种功能^1,2,3,4,5,6。本方法的目标是为研究人员提供一套从头到尾完整、易于重复的实验流程，用于获取任意载玻片组织中荧光标记目标的图像并进行定量分析。

在本实验方案中，尽管已有载玻片适配器及扫描载玻片的基本配置⁷，WHCAS 主要仍用于成像培养板，以便后续在配套软件中进行分析。对载玻片进行成像存在诸多限制，因其需要精确校准采集区域的空间位置、选择合适的期刊参数、创建定制化的扫描设置，并与产品代表进行协调。在更广泛的文献中，为避免购置专用的载玻片成像与分析设备⁸，先前一项技术报告中使用该软件的研究完全绕过了在 WHCAS 上进行载玻片图像采集的步骤⁹。在不同平台上进行图像采集或图像分析时，需额外工作以确保各平台之间的兼容性。

利用 WHCAS 及其软件进行图像采集的能力，可避免寻找或开发与这些工具不兼容的工作流程所带来的不必要复杂性。本文介绍了将载玻片视为培养板，创建低倍率概览扫描图像及相应高倍率图像所需的操作步骤，并结合使用多波长细胞评分分割模块进行后续分析，从而实现 WHCAS 的再利用。该方案在图像经 WHCAS 获取后，无需开发算法或多步计数流程^10,11，相较于其他技术更具优势。本方案减少了定量技术优化所需的时间，比人工计数更精确¹²且更高效，同时最大限度地提高了 WHCAS 的使用率。由于该方案能够对载玻片上任何荧光标记的组织进行成像与分析，因此具有广泛的适用性和易用性。

方案

肿瘤标本的获取遵循当地机构审查委员会和伦理委员会批准的方案，并符合国家相关规定。本文所使用的WHCAS及其相关软件列于材料表中。

1. 导入期刊

1. 打开相关软件。
2. 下载 材料表 中列出的期刊套件。
3. 通过点击主菜单中的 期刊，选择 导入期刊套件…，然后点击 导入，将期刊套件导入到合适的目录中。

2. 创建预览扫描采集的设置

1. 在孔板采集设置对话框中，进入物镜与相机选项卡。选择4X作为放大倍数，1作为相机二分之一像素合并（binning），2作为增益（gain）。
2. 在孔板 – 载玻片扫描选项卡下输入图1A所示的设置。
   注意：这些设置旨在允许用户查看和导航最多3张载玻片。每张载玻片被划分为3个相邻的孔，以便于对组织切片或细胞进行便捷导航和“实时”可视化。
3. 在需访问的位点选项卡中，将位点均匀地填充至各孔中。
4. 点击编辑孔板底部设置…，并输入图1B所示的数值。
5. 在采集循环选项卡下，为预览扫描输入所需的波长（本示例中为任意核染料）。为了获得最佳对比度和基于图像的对焦效果，请使用最亮的荧光信号（例如，通常是核染料）。
   注意：建议使用明亮染料（如核染料）对组织进行染色，因其与背景相比具有高对比度。这不仅有助于样本定位，而且在后续高倍镜采集过程中同时成像多个荧光染料时，最亮的荧光信号将被用作其他荧光信号成像偏移的基准。
6. 在孔板采集模式下启用阴影校正功能，以实现图像拼接。
7. 将这些设置保存为设置A。

3. 创建高倍镜下切片采集的设置

1. 在孔板采集设置对话框中，进入物镜与相机选项卡。选择40X作为放大倍数，1作为相机二乘（以获得最高的数字分辨率），2作为增益（以增强图像信号和亮度）。
   注意：可使用较低的物镜放大倍数，但作者发现，对于利用多波长细胞评分模块分析脑肿瘤组织中的人小胶质细胞和巨噬细胞，40X是最佳设置。
2. 确保孔板—载玻片扫描和编辑孔板底部设置…选项卡中的所有设置与设置A相同（见步骤2）。
3. 如果获得的图像不够清晰，可调整孔深度、孔板高度和孔板底部设置以校正焦距。如果焦距问题仍然存在，请在自动对焦选项部分选择使用图像恢复的激光对焦。
4. 在采集循环选项卡下，输入样本中存在的波长数量。勾选启用基于激光的对焦和启用基于图像的对焦（用于采集或激光恢复）选项。
5. 在自动对焦选项卡下，选择对焦于孔板及孔底。
6. 在期刊选项卡中，按照图2所示选择相应选项，并确保同时选中防止异步硬件移动。
7. 将这些设置保存为设置B。

4. 将载玻片放入宽场高内涵分析系统

1. 按 F4 键进入 主菜单，选择 载玻片扫描。点击 打开舱门 – 弹出载玻片，将载玻片及载玻片适配器（最多可容纳三张载玻片）插入 WHCAS（图 3A 和 3B）。放置载玻片时，确保盖玻片朝下，标签位于载玻片适配器缺口的一侧（图 3A）。
   注意：本实验所用载玻片为标准尺寸 25 × 75 × 1 mm 的载玻片。
2. 点击 关闭舱门 – 装载载玻片。

5. 获取预览扫描图像

1. 在筛选标题下，选择板获取与控制…和板获取设置…，并加载设置A。
2. 在要访问的孔选项卡下，使用鼠标右键移动到含有样品的孔。在要访问的位点选项卡下，结合实时图像采集功能移动至不同位点，直至定位到细胞。手动对焦样品或使用自动对焦功能，并点击拍摄以获取图像。
   注意：通过设置更多位点并使位点适配孔的范围（见步骤2.3），可更易于定位样品。
3. 在主菜单中选择预览载玻片。
4. 在自动弹出的对话框中，选择反映将要扫描的载玻片数量的选项。每次扫描一张载玻片。点击确定。选择4X作为放大倍数，点击确定。选择盖玻片朝下（0.17 mm）作为载玻片方向（若使用不同厚度的盖玻片，请使用校正环进行调整）。点击确定，然后点击继续。
   注意：如果用户希望为2张或更多载玻片获取预览扫描图像，则在采集相应高倍图像之前，必须分别单独打开每个预览扫描图像。
5. 在加载扫描载玻片设置界面中，确保勾选采集设置和校准选项框。点击取消。当扫描载玻片设置窗口再次出现时，点击继续。
6. 当扫描载玻片对话框出现时，按照图4A-4C中的建议调整设置，完成后点击关闭。
   注意：提高相机binning值并缩短相机曝光时间可加快扫描速度，但会分别降低数字分辨率和动态范围，从而影响图像质量。明场校正（Shading correction）可确保单个视野内的强度均匀。启用硬件和图像自动对焦功能可确保扫描图像清晰，但会减慢扫描速度。为节省时间，建议在采集低倍扫描图像时关闭明场校正以及硬件和图像自动对焦功能，但在步骤6进行高倍成像时应开启这些选项。低倍扫描的分辨率不会影响高倍扫描的分辨率。
7. 选择载玻片扫描数据的存储目录，点击确定。输入文件名，点击确定。
8. 绘制区域对话框将自动弹出。使用矩形区域工具（图5A）选择整个预览扫描区域，如图5B所示。点击继续。
9. 将出现设置完成对话框，点击继续。
   注意：此时将开始进行载玻片预览扫描。
10. 当预览完成后，将出现扫描完成对话框，点击继续。请勿关闭预览扫描窗口（在本例中为DAPI扫描窗口；参见图6）。
    注意：设置及低倍扫描采集过程大约需要20分钟。后续高倍图像采集时间取决于所选位点数量以及各通道的曝光时间。

6. 高倍扫描

1. 加载设置B。
2. 确定需要成像的孔位。在需访问的孔选项卡下，使用鼠标右键移动至含有样本的孔位。
   注意：本示例通过成像第1孔来演示该技术。
3. 在需访问的位点选项卡下，使用实时成像功能移动至不同位点，直至找到细胞或组织。可手动对焦样本，或使用自动对焦功能。使用快照功能捕获图像。
   注意：为在高倍镜下更易定位样本，可使用“板成像与控制”对话框将步长调整为5至100 µm以寻找样本，若自动对焦无法完成时可采用此方法。
4. 在W1 DAPI选项卡下，点击自动曝光。确保板成像快照 - DAPI图像清晰。
5. 在主菜单中，点击日志以展开下拉菜单，选择运行日志…。
6. 双击载玻片区域成像设置日志以启动该程序。当设置载玻片区域成像对话框出现时，选择继续。
7. 当系统提示时，正确选择DAPI扫描以获取低倍率的载玻片图像。点击确定。类似地，当系统要求提供板成像快照时，高亮选择“板成像快照 - DAPI”，然后点击确定。
8. 当创建或加载区域对话框出现时，使用矩形区域工具在DAPI扫描图像上选择一个或多个感兴趣区域（图6）。点击继续。
   注意：在40X倍率下可选择的最大区域为45列×35行。若选择多个感兴趣区域，系统将按面积最大的区域进行统一缩放。缩放后可重新调整各区域位置。
9. 在加载区域对话框中选择否。
   注意：选择是将加载之前保存的区域，适用于具有相同感兴趣区域位置的多批次载玻片。
10. 使用定位器工具，高亮显示最大的感兴趣区域，然后在选择区域对话框中点击继续。当出现确认区域对话框时，选择继续。当出现保存区域对话框时，决定是否保存该区域。
11. 下一个对话框为位点间距，用户可选择平铺（生成无重叠的图像）或10%重叠。选择一种选项后点击确定。本文作者选择平铺。
12. 接下来将出现三个对话框。设置完成对话框可通过点击继续关闭。请暂时保持40X成像位点设置对话框（图7A）打开，因其可明确显示需在板成像设置对话框（图7B）中输入的列数和行数。同时，请保持左下角出现的WellPositions对话框（图7C）在整个成像过程中处于打开状态。
13. 在板成像设置对话框中，于需访问的孔选项下，必须高亮选中与先前选择的感兴趣区域数量相同的孔数（图7D）。
    注意：本研究团队开发的方案每张载玻片最多支持九个感兴趣区域。若数量更多，只需在板 - 载玻片扫描选项卡中增加列数或行数以匹配实际区域数量。这些孔位并不在空间上对应感兴趣区域的实际位置，但必须通过左键点击高亮正确数量的孔位。
14. 在板成像设置对话框中，进入需访问的位点选项卡。输入建议的列数和行数（图7B）。请记得点击平铺位点。
15. 为避免盲目寻找含样本的位点，可在摘要选项卡下点击开始板成像，使载物台自动定位至预选的感兴趣区域。当摄像头移动至含有细胞的位点时，点击右下角的取消按钮以停止图像采集。确保此时载物台已准确定位于样本上方。
16. 优化波长设置，以确保获得对焦清晰且具有高动态范围的图像。确认满意后，点击摘要选项卡中的开始板成像。

7. 图像分析

1. 选择所需的自定义模块。
   注意：作者选择了多波长细胞评分模块，以演示脑肿瘤切片的自动分割。
2. 在所有成像位点上运行分析。如果多个切片的分析参数相同，可将分析步骤添加至后采集选项卡下的板采集设置框中。
3. 分析完成后，排除图像质量较差的成像位点，以避免结果产生偏差。由于本分析的目标是定量肿瘤实质中的小胶质细胞和巨噬细胞，因此应在肿瘤样本边缘内选择感兴趣区域。此外，应排除失焦、含有组织褶皱、气泡或组织撕裂的位点。具体示例请参见代表性结果。或者，可根据每个位点的激光反射幅度生成的激光聚焦评分设定阈值，低于该阈值的位点将被排除（该阈值可自定义，取决于曝光时间、所用介质类型等参数）。
   注意：高倍镜图像使得在必要时可特异性排除某些结构，例如大血管和坏死区域；也可仅包含特定感兴趣区域，例如细胞密度较高的区域。通过这种方式，可提高分析的特异性和准确性。

结果

图像可在 WHCAS 软件内查看。图8展示了在定义的兴趣区域内所有位点的高倍缩略图。请逐一检查每个位点，以确定应从分析中排除的位点（低倍和高倍下的示例分别见于图8和图9）。例如，位点149失焦（图9A），位点219存在气泡（图9B），位点54含有折叠（图9C），这些均应被排除。通常情况下，需排除所成像位点总数的10–15%。在本示例中，共排除了15.3%的位点（300个位点中有25个存在气泡，17个失焦，3个折叠，1个位于边缘）。图10A为选定用于分析的代表性图像（其对应的低倍缩略图见于图8）。此处，由多波长细胞评分模块生成的相应叠加图像展示了针对位点59进行的自动分割结果，该分割根据作者的设定进行了定制（细胞核最小宽度 = 2.5 µm，最大宽度 = 7.5 µm，高于局部背景的强度 = 35灰度级；CD11b阳性细胞最小宽度 = 4 µm，最大宽度 = 18 µm，最小染色面积 = 15 µm²，高于局部背景的强度 = 310灰度级；CD45阳性细胞最小宽度 = 4 µm，最大宽度 = 18 µm，最小染色面积 = 15 µm²，高于局部背景的强度 = 50灰度级）。完成分割后，可获得以下定量数据：各标记物阳性细胞比例（CD11b⁺和CD45⁺细胞分别为6.2 ± 5.1%和3.8 ± 2.1%）、双标记阳性细胞比例（3.5 ± 2.1% CD11b⁺CD45⁺细胞）、无标记细胞比例（86.6 ± 9.0% CD11b^-CD45^-细胞；图10B）、平均染色面积（CD11b⁺和CD45⁺细胞分别为40.0 ± 9.2 µm和36.7 ± 7.6 µm；图10C），以及平均荧光强度（CD11b⁺和CD45⁺细胞分别为408.9 ± 40.3相对荧光单位和373.9 ± 38.1相对荧光单位；图10D）。

图1：低倍镜下扫描载玻片的设置。A. 此图像显示孔板设置。 B. 此处显示孔板底部设置。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：高倍镜下载玻片采集的设置。 本图展示了适当期刊的选择。 请点击此处查看此图的放大版本。

图3：使用载玻片适配器加载载玻片的演示。 A. 将盖玻片朝下放置载玻片，标签位于载玻片适配器缺口的一侧。 B. 将载玻片适配器装入宽场高内涵分析系统中。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4：预览幻灯片设置。 A. 本图显示了图像采集的参数设置。 B. 此处显示了Hoescht/DAPI波长设置的数值。 C. 本图展示了日志设置。 请点击此处查看此图的放大版本。

图5：绘制载玻片区域。A. 使用矩形区域工具（其他绘图工具不可用）在DAPI扫描图像上选择预览扫描区域并创建感兴趣区域。B. 本图中的青色轮廓显示了应如何选择载玻片的整个区域（包括标签）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：在预览扫描图像上创建感兴趣区域。 预览图像或DAPI扫描图像显示了载玻片的整个区域。在此示例中，包含三个连续的脑组织切片（实线白色矩形轮廓）。这些切片上方的区域代表载玻片上的圆形标签。不同的切片排列方式不会限制后续感兴趣区域的选择。本示例中的感兴趣区域以虚线白色矩形轮廓标出。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：高倍镜图像采集的关键窗口设置。 A. “采集位点设置”窗口将显示感兴趣区域中包含的列数和行数。 B. 确保在“板采集设置”框中输入与图7A所示一致的正确列数和行数，并使位点以拼接方式排列。 C. 即使该窗口为空白，也必须在整个图像采集过程中保持“WellPositions”窗口处于打开状态。 D. 必须选中适当数量的感兴趣区域。 请点击此处查看此图的放大版本。

图8：感兴趣区域的代表性图像。 每个位点均可在感兴趣区域的组合缩略图中显示。图中以较高放大倍数展示了被排除的代表性位点（用红色框标记）以及一个被纳入分析的位点示例（用绿色框标记）。建议逐一审查每个位点，以确保其图像质量满足分析要求。比例尺 = 1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图9：应排除在分析之外的图像示例。 A. 人脑肿瘤切片经CD11b（绿色）和CD45（红色）染色，二者分别为小胶质细胞和巨噬细胞的标记物。该图像失焦，已被排除在分析之外。 B. 该图像中存在气泡，因此被排除在最终分析之外。 C. 由于组织折叠，该位点被排除在分析之外。比例尺为20 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图10：代表性图像及分析结果。A. 每幅图像旁边显示的是代表自动分割结果的叠加图。在叠加图中，细胞核以白色显示，CD11b阳性染色细胞以绿色显示，CD45阳性染色细胞以红色显示。在排除质量不达标的位点后，整合所有剩余位点的结果，B. 以图形形式展示各标记物单独阳性及双标记阳性细胞占每个位点总细胞数的平均比例，C. 平均染色面积，以及D. 平均细胞荧光强度。RFU = 相对荧光单位。数据以均值 ± 标准差表示。比例尺为20 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

目前仍阻碍生物科学研究效率的一个常见问题是，缺乏针对荧光标记组织及其内部结构进行无偏、准确且精确量化的方法。研究人员需要投入大量时间和精力，以寻找对已成像的组织切片进行分析的有效途径。许多现有方法为用户提供了可在程序中重新实现的算法^12,13,14。这些方法虽可接受，但本报告的意义在于，若用户能够使用 WHCAS，则可轻松快速地建立一套完整的图像采集与分析流程。例如，相关软件中已提供可区分细胞类型并量化多种结构与过程的检测方法，包括细胞周期分析和核转位分析等。

该设置包含几个关键步骤。首先，将载玻片的空间参数定义为类似于培养板的形式。其次，通过低倍率全景扫描图像选择感兴趣区域，用于高倍成像。最后，排除会影响后续分析准确性和精确性的位点。该技术最大的局限性在于其适用性取决于用户是否能够使用全玻片扫描成像系统（WHCAS）。然而，随着对高内涵分析系统的需求不断增加，许多机构正在为研究人员提供此类设备，以保持竞争力¹⁵。最常见的问题排查情况是组织切片厚度不一致。如果选择了多个感兴趣区域，其中一些区域可能处于焦内，而另一些则可能失焦。理想情况下，在切片过程中，操作者应确保制备出均一的样本。然而，若样本存在不一致性，可针对每个失焦的感兴趣区域甚至每个视野，重新调整基于细胞核染色波长（或用户所用最亮荧光染料）的焦距。由于其他波长的位置仅相对于细胞核染色波长进行偏移，因此只需重新调整该波长的焦距即可。

本报告详细介绍了如何使用WHCAS及其配套软件对切片进行扫描和分析。多波长细胞评分模块可让用户自动计数任何经荧光标记的细胞核或细胞质标志物。在调整焦距设置并定义细胞特征（如宽度和面积），以使模块适配所成像的组织后，无需进一步的人工干预即可获得成像切片和定量数据。每次最多可同时对三张切片进行成像，并可定义多个感兴趣区域。该方案使需要分析切片的WHCAS用户能够利用可定制、多功能、自动化的分析流程，这些流程几乎无需优化，未来可广泛应用于涉及组织学分析的各类研究项目中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ImageXpress MicroXLS	Molecular Devices	NA	图像采集装置
MetaXpress 5.1	Molecular Devices	NA	与ImageXpress MicroXL配套的软件（运行于搭载Windows操作系统的PC上）
载物片适配器	Molecular Devices	NA	可插入ImageXpress MicroXL的金属载物片支架
Slide_Region_Acquisition_revA.jzp	Molecular Devices	NA	该日志文件可从metamorph.moleculardevices.com/forum/showthread.php?tid=218&highlight=slide获取，或通过联系Molecular Devices公司代表获得
Slide_Region_Acquisition _Setup.JNL	Molecular Devices	NA	在步骤6.6中选择此日志文件